Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达

Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达（共2篇）

篇1：Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达

Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达

按常规分子克隆方法将马铃薯中高表达的patatin启动子和乙肝表面抗原基因分别插入双元质粒pBI101成为植物表达载体pPHG9,由前者驱动后者表达;通过农杆菌转化法将乙肝表面抗原基因导入马铃薯并获得再生植株;用ELISA方法检测经PCR鉴定的.转基因植株中乙肝表面抗原的含量,对照标准曲线得知转基因马铃薯植株中的乙肝表面抗原含量高达100～174 ng/mg可溶性蛋白.

作 者：宋东光 王光清 汪训明 Song Dongguang Wang Guangqing Wang Xunming 作者单位：复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室,上海,33刊 名：高技术通讯 ISTIC EI PKU英文刊名：HIGH TECHNOLOGY LETTERS年，卷(期)：10(2)分类号：Q34 Q94关键词：马铃薯 patatin启动子 乙肝表面抗原基因 基因表达

篇2：Patatin启动子驱动的乙肝表面抗原基因在马铃薯中的表达

目前虽有利用植物生物反应器表达h IL-12的报道,但是表达量非常低[9,10]。有研究表明,对植物表达系统中驱动外源基因表达的启动子进行替换和改进,能有效提高外源基因的表达量[11]。在前期研究中,作者课题组克隆了马铃薯叶特异性启动子Prbcs并构建了其驱动的h IL-12表达载体,将其导入马铃薯基因组后获得了阳性转基因植株[12,13]。因此,本研究接下来对阳性转基因马铃薯中h IL-12在RNA和蛋白水平的表达情况进行检测,为利用马铃薯高效表达生产h IL-12蛋白提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

转基因马铃薯材料由作者实验室前期研究获得[13]。

1.1.2 试剂

植物RNA提取试剂盒(Tiangen公司);c DNA制备试剂盒(北京博迈德公司);h IL-12抗体(Abcam公司);HRP标记二抗(碧云天公司);化学发光试剂盒(Bio-Rad公司);SDS-PAGE凝胶试剂盒(碧云天公司);h IL-12 ELISA试剂盒(上海生工公司)等。其它试剂为国产或进口分析纯。

1.1.3 仪器

PCR仪(Flex Cycler,德国JENA);凝胶成像系统(GELDOC XR,美国Bio-Rad);酶标仪(IMARK,美国Bio-Rad);蛋白质电泳设备及转印系统(美国Bio-Rad);化学发光成像仪(Chemidoc Touch,美国BIO-RAD);台式高速冷冻离心机(PRIMO R,美国Thermo Fisher);超净工作台(BCM-1300A,苏净安泰空气技术有限公司);人工气候箱(XL-250BS/H-Ⅲ,馨郎科技有限责任公司)。

1.1.4 培养基

马铃薯无性繁殖及试管薯诱导培养基参考文献[13]。

1.2 方法

1.2.1 h IL-12在转基因马铃薯中RNA水平的表达检测

利用植物RNA提取试剂盒,按照操作说明提取马铃薯块茎总RNA,反转录获得c DNA。反转录体系和过程如下:总RNA 2μg,oligo(d T)(100 ng/μL)1μL,5×buffer 4μL,d NTP(10 mmol/L)2μL,RNase inhibitor 20 U,反转录酶M-MLV 1μL,加DEPC处理水至20μL,42℃反应1 h后,-20℃保存备用。以c DNA为模板,以启动子引物[12]Prbcs-f:5’-CAGGAAAAAGGGATTAATGAG-3’和Prbcsr:5’-GTTGACAATAATTGCTCTCTAG-3’检测确定有无基因组DNA污染,以h IL-12-F:5’-GCT-GATGGATCCTAAGAGGC-3’和h IL-12-R:5’-TTAGGAAGCATTCAGATAGC-3’为引物进行扩增检测h IL-12基因的表达。以组成型基因GAPDH作为内参[14],扩增引物为GAPDH-F:5’-AT-GAAGGACTGGAGAGGTGG-3’和GAPDH-R:5’-GAAAATGCTTGACCTGCTGT-3’。扩增反应程序为:预变性94℃2 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s;26~30循环,72℃延伸10 min。

1.2.2 Western Blot检测h IL-12蛋白在转基因马铃薯中的表达

取马铃薯绿色叶片或块茎约0.1 g,加入1.5m L总蛋白提取液(0.1 mol/L Tris-HCl,p H 7.5,50mmol/L EDTA,0.5%SDS,1%蛋白酶抑制剂),冰上研磨至匀浆,12 000 r/min离心10 min,收集上清液利用BCA法测定蛋白质浓度后保存。Western Blot方法参考文献[15]并进行适当改进。配制浓度为12%的SDS-PAGE凝胶,将处理后的蛋白样品点入上样孔进行电泳。电泳完毕后按照“滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸”从负极到正极的顺序进行组装置于电转仪中,恒流200 m A转移1~2 h。将膜用TBS清洗1次(5 min),浸入5%脱脂奶粉(TBS溶解)中37℃封闭1 h后,将膜取出,TBS清洗1次(5 min);在5%脱脂奶粉(TBS溶解)中按照1∶2000的稀释比例加入一抗,膜浸入其中,37℃孵育1h;将杂交膜1×TTBS清洗5次,每次5 min;在5%脱脂奶粉中按照1∶5 000的稀释比例加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G),将膜浸入其中,37℃孵育1 h;1×TTBS清洗5次,每次5 min,1×TBS洗15 min;利用化学发光试剂盒进行发光后利用化学发光成像仪进行曝光照相。

1.2.3 ELISA定量检测h IL-12蛋白在转基因马铃薯中的表达

将待测样品稀释30倍后用人IL-12 ELISA检测试剂盒测定样品中h IL-12的含量,按照试剂盒说明书进行操作。主要步骤包括将蛋白质样品(包括标准品与待测样)、生物素标记抗体及酶试剂加入h IL-12包被的酶标板,混匀后37℃保温1 h,洗板后加入显色液,5 min后加入终止液于450 nm测量OD值。所有数据用SPSS 22.0软件进行统计分析,实验数据重复3次,结果用均值±标准差(x-±s)表示。利用独立样本T检验法计算两个样品间的差异显著性,P<0.05表示有统计学意义(*)。

1.2.4 转基因植株无性繁殖与试管薯诱导

在超净工作台中,将无菌幼苗植株切成3 cm左右带叶的小段,接着将切下来的茎段插入MS培养基。将其置于人工气候箱,22℃条件下以光照16 h黑暗8 h的周期进行培养,进行无性繁殖。无性繁殖的植株生长至10 cm左右长度后,转入装有MS培养基(含0.5 g/L活性炭)的培养管中,置于22℃光照8 h黑暗16 h的人工气候箱进行试管薯诱导。

2 结果与分析

2.1 h IL-12在转基因马铃薯叶片中的表达检测

在前期研究中,获得了大量Prbcs驱动的h IL-12转基因马铃薯植株,并通过PCR和GUS染色分析初步获得了11株阳性植株[13]。本研究接下来首先提取植株叶片总RNA并反转录为c DNA。首先利用启动子DNA引物Prbcs-f和Prbcs-r检测确定无基因组DNA污染后,利用RT-PCR检测h IL-12基因的表达情况。结果显示,11个样品中的有7个检测了h IL-12基因RNA水平的表达(图1A)。为进一步检测外源基因在转录后的蛋白质表达情况,提取这7株马铃薯植株叶片总蛋白,利用h IL-12抗体进行Western Blot检测h IL-12在蛋白水平的表达情况。结果显示:其中的2、4、9、10、15号5个植株块茎能明显检测到h IL-12蛋白表达,另外的6、11号植株叶片中未检测到明显信号(图1B)。本研究进一步利用ELISA技术对h IL-12蛋白的表达进行定量检测,结果与Western Blot实验一致,除6、11号植株外,其余5个转基因植株的叶片中均检测到h IL-12蛋白,表达量在0.5~3.0μg/g总蛋白之间(图1C)。其中,10号植株的马铃薯叶片中h IL-12表达量最高,达到2.84±0.19μg/g总蛋白(图1C)。

2.2 h IL-12蛋白在转基因马铃薯中表达的组织特异性检测

由于本研究中驱动h IL-12基因表达的启动子Prbcs为叶片和绿色组织特异性启动子[13],为检测h IL-12蛋白的表达是否也具有组织特异性,本研究接下来对在叶片中能检测出h IL-12蛋白表达的5个植株的块茎进行了检测。通过试管薯的诱导,本研究成功获得了这5个植株的马铃薯块茎(图2A)。将块茎的绿色外皮去掉后提取总蛋白进行ELISA检测并对检测数据进行统计学分析。结果显示,虽然都能检测到微量的h IL-12蛋白信号,但2、10、15号植株块茎中h IL-12蛋白的表达与野生型对照植株无统计学差异(P>0.05)。而4号和9号植株块茎中检测到h IL-12蛋白的表达虽然与野生型对比有统计学差异,但表达量极低,每克总蛋白中h IL-12的表达量均小于0.4μg(图2B),远低于其在叶片中的表达量,初步表明h IL-12蛋白的表达具有叶片组织特异性。

注:编号0表示野生型植株叶片(阴性对照),其余编号表示不同阳性单株。Note:number 0 indicates the negative control;other numberss indicate different transgenic lines.

注:A:转基因试管薯(箭头);B:ELISA检测试管薯中h IL-12蛋白的表达,编号与图1对应,*表示与阴性对照相比有统计学差异(P<0.05)。Note:A:transgenic potatomicrotuber(arrow);B:expression of h IL-12 in transgenic potato microtubers;numbers are correspondence with that in figure 1;asterisks mean statistical differences with control(P<0.05).

2.3 马铃薯转基因植株无性繁殖及h IL-12蛋白表达的遗传稳定性检测

将表达h IL-12的2号和10号转基因马铃薯幼苗,切成3~5 cm长的茎段进行无性繁殖。待植株长至7~8 cm的高度后(30 d左右,图3A),选取其后代幼苗各5株提取叶片的总蛋白。利用ELISA技术检测无性繁殖后h IL-12蛋白表达情况,验证其遗传稳定性。结果显示(图3B),所有的叶片均能检测到h IL-12蛋白的表达,且表达量和亲代植株接近。表明在经过一次无性繁殖后,h IL-12在转基因植株中的表达稳定。接着,本研究选取2-2号和10-1号植株的各5株后代幼苗叶片,提取蛋白利用ELISA技术检测h IL-12的表达量,分析经过2次无性繁殖后h IL-12蛋白的表达情况。结果显示,所检测的全部样品中均有h IL-12蛋白表达(图3C)。以上研究结果初步表明获得的h IL-12转基因植株的遗传稳定性良好。

注:A:马铃薯转基因幼苗无性繁殖。B:ELISA检测h IL-12在第二代马铃薯幼苗叶片中的表达;0:阴性对照;其余编号表示2号和10号植株的不同后代单株。C:ELISA检测h IL-12在第三代马铃薯幼苗叶片中的表达;0:阴性对照;其余编号表示2-2号和10-1号植株的不同后代单株。Note:A:propagation of transgenic potato plants.B:expression of h IL-12 protein in the second generation of potato leaves by ELISA;number 0 shows negative control and others mean generations of transgenic Line 2 and Line 10.C:expression of h IL-12 protein in the third generation of potato leaves by ELISA;number 0 shows negative control and others mean generations of transgenic Line 2-2 and Line 10-1.

3 讨论

利用外源重组表达系统生产的生物技术药物已在癌症、心脑血管疾病、糖尿病等重大疾病的治疗方面起着举足轻重的作用[16]。目前,临床上和实验室所使用的重组白细胞介素大多数是用大肠杆菌或者动物细胞进行表达和生产[17,18,19],价格较为昂贵。Nancy S Magnuson等于1998年利用烟草悬浮细胞表达系统,获得了具有生物学活性的人IL-4[20]。自此以来,先后已有多种白细胞介素在成功植物中获得重组表达。相比于微生物和动物细胞反应器,植物具有细胞培养简单、转基因体系成熟、与动物细胞相似的真核基因表达机制等优点,开发植物生物反应器来表达具有应用价值和潜力的药用蛋白受到了许多科研工作者的重视[1,2,3,4]。

但是,相比于已经成熟的微生物重组表达体系,植物细胞中外源蛋白的表达量很低[3,20],限制了其发展和应用。Gutiérrez-Ortega等早在2004年便在烟草中成功表达了具有生物学活性的h IL-12蛋白,但表达量仅为30 ng/g(鲜重)[21]。在本实验室的前期研究中,利用组成型的Ca MV35S启动子驱动h IL-12基因在马铃薯中的重组表达,虽获得了具有生物学活性的重组蛋白[22],但表达量仍低于0.1μg/g(总蛋白)[9]。因此,如何提高h IL-12蛋白在植物生物反应器中的表达量至关重要。启动子是决定其下游基因表达量的关键因素之一,利用组织特异性启动子来驱动外源基因,可以在植物的某一特定组织内获得高表达的重组药用蛋白,从而有效提高植物生物反应器的表达效率。如:Yoonkyung Park等利用Ppatatin启动子驱动白细胞介素-2(IL-2)蛋白特异性的在块茎中表达,表达量提高了2倍以上,最高可达到约110μg/g(总蛋白)[10]。在前期研究中选择的Prbcs启动子是植物叶片组织中一个高效特异性的启动子[23],目前尚无该启动子在植物生物反应器表达重组白细胞介素领域应用的报道。本研究将Prbcs启动子应用于h IL-12在马铃薯生物反应器中的表达,获得了能在叶片组织中大量表达h IL-12蛋白的转基因马铃薯植株。h IL-12在每克总蛋白中的表达量约2.8μg,外源蛋白的表达量比前期研究[9]大大提高。

此外,植物基因组遗传的复杂性往往易会造成外源基因表达的不稳定性,外源基因在经过几代繁殖后表达量可能会大大减少[24]。因此,药用蛋白基因在转基因植物基因组中的遗传稳定性是决定植物生物反应器生产效率的重要因素之一[11]。在本研究中,外源基因在所检测的所有试验材料中的表达均具有非常好的遗传稳定性,进一步为该表达系统的应用提供了理论基础。