膀胱癌干细胞

膀胱癌干细胞（精选十篇）

膀胱癌干细胞 篇1

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌T24细胞来源于中国科学院上海生物细胞研究所,实验时取对数生长期的细胞,在含10%小牛血清的细胞培养基(DMEM)培养液中培养,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下生长,0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2 MTT实验

T24细胞以5×104/mL、100μL/孔,接种于96孔培养板,培养24 h后,分别加入浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L的MS-275作为5个实验组,阴性对照组不加MS-275,空白对照组为单纯DMEM培养液,每组各设5个复孔。继续培养48 h,每孔加入5 g/L的MTT溶液10μL,再培养4 h,吸出孔内培养液,每孔加100μL二甲基亚砜(DMSO),酶标仪测定吸光度,选择492 nm波长,用空白对照组调零,计算细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。以细胞生长抑制率与药物浓度的对数作图,在图上求出MS-275对T24细胞的半抑制浓度(IC50)值。选取接近于IC50值的浓度用于下一步实验。

1.3 荧光显微镜观察凋亡的形态学变化

将T24细胞以1×105/孔接种于6孔培养板,观察细胞贴壁且生长良好后,加入浓度为4.0μmol/L的MS-275作为实验组,非药物处理组作为对照组,继续分别培养12、24、48 h,细胞经胰蛋白酶消化收集后,以磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度为1×106/mL,制成单细胞悬液,取95μL细胞悬液,加人100μg/ml的吖啶橙染液5μL混匀,取10μL混合液于载玻片上,加盖玻片后于荧光显微镜(Olympus BX60)下(515 nm激发光)观察细胞形态学变化并摄片。

1.4 原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡

4μmol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48 h,设阴性对照,每个时间点设3个复孔,培养结束后收集细胞悬液,做细胞涂片,行TUNEL法处理及染色,并以二氨基联苯胺显色。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,分析细胞凋亡率。

1.5 流式细胞仪(FCM)检测细胞内Bcl-2和Bax的变化

4μmol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48 h,收集后4%多聚甲醛固定,PBS液漂洗2次,加入1.5 mL破膜剂透化15 min后,离心去上清,重悬于150μL破膜剂中,分别加入Bcl-2和Bax的单克隆抗体,留取空白对照(不加单抗),避光反应30 min,PBS漂洗2次,每管加入FITC荧光标记的二抗,避光反应30 min,PBS漂洗2次,上FCM检测。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验结果

经MTT法测定,浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L的MS-275处理T24细胞48 h后,细胞的生长抑制率分别为(4.59±2.37)%、(9.86±6.74)%、(22.82±7.55)%、(41.17±6.14)%、(65.02±6.21)%,通过作图求得IC50为(5.21±0.61)μmol/L。选用接近IC50的4.0μmol/L浓度作为实验浓度。

2.2 荧光显微镜观察结果

对照组基本为正常细胞,表现为细胞核形态规则,胞核DNA呈现黄绿色均匀弥散荧光。MS-275处理12 h和24 h凋亡细胞逐渐增多,48 h后出现大量凋亡细胞,细胞呈现核固缩,呈现致密浓染的黄绿色荧光,部分细胞表现为核碎裂,还可见典型的出泡现象。见图1。

2.3 MS-275诱导T24细胞凋亡率(AI)的升高

MS-275诱导T24细胞凋亡呈明显的时间依赖性,T24细胞的凋亡率随MS-275作用时间的延长而升高。MS-275作用12、24、48 h的AI分别为(9.52±2.61)%、(17.76±3.75)%和(37.5±5.26)%,AI在MS-275作用12 h以上各组,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 MS-275对Bcl-2和Bax表达的影响

MS-275作用6、12 h,T24细胞内Bcl-2蛋白的表达率即出现明显降低,而同时Bax蛋白的表达率出现明显升高(P<0.05或P<0.01);24 h Bax的蛋白表达率逐渐降低(P<0.01);此后随着作用时间的延长,Bcl-2的蛋白表达率逐渐升高,而Bax的蛋白表达率逐渐降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡是HDAC抑制剂抗肿瘤作用的重要机制之一。本实验用荧光染色法及TUNEL法观察到,微摩尔数量级的MS-275即可诱导T24细胞出现特征性的凋亡形态学改变,并且随作用时间的延长,凋亡细胞的相对数量呈增多趋势。随后的实验对其诱导膀胱癌细胞凋亡的机制进行了初步探讨。

抗肿瘤治疗可诱发肿瘤细胞对细胞内的损伤信号起反应,而细胞是否凋亡很大程度上决定于Bcl-2家族蛋白之间的相互作用[4]。Bcl-2是Bcl-2基因家族中调节细胞凋亡的一个重要分子,能广泛抑制各种凋亡诱导因素引发的凋亡,其很可能影响凋亡最终通路上的中心环节。另一个Bcl-2家族蛋白Bax是重要的异二聚体伴分子,可与Bcl-2构成异二聚体,而Bax自身组成同二聚体。Bcl-2必须结合Bax才能发挥作用。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体(Bcl-2/Bax)与同二聚体(Bax/Bax)的比值,这对决定细胞的凋亡易感性起关键作用[5]。本实验的检测结果表明,MS-275作用T24细胞后Bcl-2的表达减弱,Bax的表达增强,说明MS-275可下调Bcl-2表达,上调Bax表达,这与HDAC抑制剂诱导其他恶性肿瘤细胞凋亡时对凋亡相关因子表达的影响相一致[6,7]。本实验还观察到MS-275引起Bax表达的改变较Bcl-2的改变更明显,而由于Bcl-2和Bax表达的改变是同步的,这样就引起Bax/Bcl-2发生更显著的变化。更重要的一点在于,凋亡率发生显著变化之前,Bcl-2和Bax的表达即已发生显著的改变,这更表明Bcl-2和Bax表达的改变是MS-275诱导凋亡的启动环节上的作用因素。

本实验结果表明,HDAC抑制剂MS-275通过诱导膀胱癌T24细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用,Bcl-2和Bax蛋白表达分别下调和上调是其诱导膀胱癌细胞凋亡的机制之一。HDAC抑制剂为膀胱癌的治疗提供了新的思路。

参考文献

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中医治疗膀胱癌的感想 篇2

大部分患者都会采用西医的方法进行诊断，一旦确诊，也就接着在西医的指导下开始进行治疗。西医治疗膀胱癌的方法已经被人们广为了解，主要是手术、化疗和放疗。每种疗法又分为很多细类，根据患者病情的不同，外科手术会采用不同的术式，放化疗会使用不同的方案。运用西医的方法治疗癌症，往往能在较短的时间内使症状缓解、病灶缩小，对于极少部分早期的患者以及患有某种治疗难度相对较低的膀胱癌病种的患者，甚至有可能实现临床治愈。然而大多数膀胱癌患者来说，却往往没有那么幸运。

大多数的患者被确诊时，就已经是中晚期了。单单依靠西医治疗，不但无法根除膀胱癌，还会大大的削弱患者自身的免疫力和抵抗力。郑州希福中医肿瘤医院的院长袁希福指出：肿瘤是一类全身性的疾病，其发生、发展与机体的抵抗能力有很大关系，不可一味的放化疗，追求“无瘤生存”而舍本逐末。况且从理论上说化疗药物是不能完全消灭体内癌细胞的。癌症的复发与转移还与机体的免疫功能有关，而传统西医治疗方法常可导致人体免疫功能下降。瘤体的缩小也没有带来预期生存期的延长与生活质量的提高。

看看服用该中药治疗后的膀胱癌患者的真实文字病例记录： 基本情况：常先生，男，60岁，北京市朝阳区人，膀胱癌

常先生在2014年1月7日，进行例常体检时发现尿潜血，后到北京朝阳医院复查，发现“膀胱肿物”。于2014年2月12日进行了膀胱镜切除术，术后拟灌注8次。在2月19日，进行了第一次灌注，家人考虑病人年纪大，决定使用中西医综合治疗。后通过网络了解到，郑州希福中医肿瘤医院比较擅长中医治疗肿瘤，且比较认同袁希福院长提出的抗癌“三联平衡疗法”理念。

于2014年2月21日，来到郑州希福中医肿瘤医院寻求袁希福院长的治疗，袁希福院长详细了解病情后，依据“三联平衡疗法”给其开取中药治疗。用药致3月31日时常先生亲自来诊，其精气神、体力、睡眠等方面显著好转，大便已成型。2014年4月18日，进行膀胱镜及彩超复查，结果并未发现异常。从2014年9月3日到2016年1月8日，共邮寄中药280付。2016年1月8日来诊时，常先生精神、体力、饮食、睡眠、大小便等各方面症状，到医院检查未发现异常，送院长锦旗一面。之后又通过邮寄，服用中药170付。2017年8月18日，常先生打电话自述，现在身体与正常人一样，计划与9月21日到日本旅游，感谢袁希福院长祖传中药。

膀胱癌干细胞 篇3

【摘 要】 目的：研究芹菜素诱导人膀胱癌5637细胞凋亡的作用机制。方法：采用25～100μmol/L芹菜素处理膀胱癌5637细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；采用Western blotting检测细胞凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和PARP蛋白的表达水平。结果：芹菜素处理使细胞Bcl-2蛋白表达降低且呈浓度依赖性，并使Bax的表达增加和导致PARP蛋白发生切割且呈浓度依赖性。结论：芹菜素能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与下调Bcl-2并上调Bax表达，导致Bcl-2/Bax比值下降，PARP活化有关。

【关键词】 芹菜素；膀胱癌；细胞凋亡；机制

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）14-0025-04

Abstract：Objective To study the mechanism of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， and MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. The expressions of apoptosis-related proteins Bax， Bcl-2 and PARP were analyzed by Western blotting. Results Apigenin causes concentration -dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. Western blotting demonstrated that apigenin increased the protein levels of Bax and PARP cleavage and reduced the protein expression of Bcl-2. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells possibly by up-regulating the Bax expression， enhancing PARP cleavage， downregulating the Bcl-2 expression and resulting in the Bcl-2/Bax ratio decreased.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Apoptosis； Mechanism

膀胱癌的全球发病率在全身恶性肿瘤中占第9位。而在我国，膀胱癌是泌尿系统中最高发的一种恶性肿瘤。临床上根据分期可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌[1]。其中非肌层浸润性膀胱癌占发病率70%，其主要治疗方法为经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of bladder tumor， TUR-Bt）加术后膀胱灌注化疗，膀胱灌注化疗常用药物包括表柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羟基喜树碱等[2]，虽经过严格术后灌注方案，仍有20%左右的肿瘤患者术后仍会复发。而肌层浸润性膀胱癌中有一部分患者的治疗主要需采用以顺铂为主的化疗方案[3]，顺铂的化疗方案疗效虽然敏感，但不能持久，患者5年生存率仅为20%～40%。而且，目前常用的化疗药物存在不同程度的全身或局部毒副反应，包括骨髓抑制、过敏反应以及膀胱刺激征等。这些方法虽然在一定程度上取得一定的疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[4]。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羟基黄酮），是一种广泛存在于果蔬中的一种黄酮类化合物，具有多种药理活性[5-6]，其中以抗肿瘤活性研究较多。研究表明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡，包括：人胃癌细胞[7]、人卵巢癌[8]、人结肠癌细胞[9]、人乳腺癌MDA-MB-231细胞[10]、人肝癌Hep G2细胞[11]、HeLa细胞[12]等，而其对膀胱癌细胞的作用机制研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用，探讨其促进细胞凋亡的作用机制。

1 实验材料

1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜（DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；RPMI1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自GIBCO公司；人抗兔Bax，Bcl-2，PARP抗体购自Santa Cruz，GAPDH抗体购自Abcam，BCA蛋白定量试剂盒和羊抗兔/鼠二抗购自Pierce；PVDF膜Millipore；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

2 实验方法

2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后每孔分别加入100μL不同浓度的芹菜素（25、50、75和100μmol/L），每个浓度设4个重复，同时设立空白对照组（加同体积的DMSO），细胞培养72h后，向每孔加入20μL 5.0 g/L的MTT后继续培养4h，弃上清，向每孔中加入200μL DMSO溶解结晶紫，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将5637细胞以2×106/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素（50、75、100μmol/L），处理24h后收集细胞，并调整细胞数至1×106/mL，用预冷PBS 洗涤细胞2次，弃上清液。加入100μL染料结合缓冲液重悬后，加入10μL AnnexinV-FITC 染色，混匀后室温避光静置15min，然后加入200μL的染料结合缓冲液和5μL PI染液（50mg/L），静置5min，立即进行流式细胞仪分析。

2.3 Western blotting检测Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达 将5637细胞以2×105/孔接种于6孔板中，以75、100μmol/L芹菜素作用细胞24h后，收集细胞，在每管细胞中加入100μL的蛋白裂解液后，BCA法进行总蛋白定量，每泳道上样量为40μg总蛋白，经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上。一抗稀释浓度分别为：Bax（1∶3000）、Bcl- 2（1∶2000）、PARP（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）。羊抗兔/鼠二抗为1∶5000稀释。ECL化学发光液，X光片暗室曝光、显影及定影。采用WO-9413B型凝胶成像。实验重复3次。

2.4 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间差异显著性比较采用t检验，以P< 0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 为了研究芹菜素对膀胱癌细胞增值的作用，采用不同浓度芹菜素（25、50、75和100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞48 h后，采用MTT法检测各个组细胞增值效率，研究结果显示，不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比具有显著性差异（P< 0.05，图1）。芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（25、50、75和100μmol/L）芹菜素处理后，随着处理浓度的增加，其抑制效果更明显。芹菜素对5637细胞的抑制呈现浓度依赖的特征。

3.2 Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测芹菜素诱导5637细胞的凋亡率为了研究芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用，根据MTT实验结果，采用不同浓度芹菜素（50、75和100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24 h后，采用Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测各个组细胞的凋亡效率，研究结果显示（图2和图3），0、50、75和100 μmol/L芹菜素处理组细胞凋亡率分别为（2.3±0.8）%、（14.3±2.9）%、（20.0±5.9）%和（63.8±6.2）%，与对照组相比差异显著（P<0.05）。随着芹菜素处理浓度的增加，其诱导膀胱癌5637细胞凋亡效率效果更明显，提示芹菜素对5637细胞的凋亡诱导效应具有剂量依赖性。

3.3 芹菜素对Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达的影响 为了探讨芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用机制，采用不同浓度芹菜素（75和100 μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24h后，采用Western-blotting检测各个组细胞的凋亡相关蛋白的表达，研究结果显示，75和100μmol/L芹菜素芹菜素处理5637细胞24h后，进行蛋白检测。检测结果表明，随着浓度增加，Bax蛋白表达逐渐增加，PARP蛋白的切割水解亦逐渐增加，而Bcl-2蛋白表达逐渐降低，因此Bcl-2/Bax比值逐渐下降（图4）。随着芹菜素处理浓度的增加，膀胱癌5637细胞中，Bcl-2与剪切的PARP蛋白表达量逐渐降低，Bax蛋白表达量逐渐增高，结合以上实验结果，提示芹菜素对5637细胞的凋亡可能是通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达，激活PARP的活性，从而诱导5637细胞的凋亡，并且这种诱导效应具有剂量依赖性。

4 讨论

芹菜素是具有多种生物活性的黄酮类化合物，多项研究结果已经证实， 芹菜素对体内、外多种癌细胞具有杀伤作用， 其作用机制可能是通过对细胞凋亡的基因调控实现的，主要通过如Rb、p53及周期蛋白依赖性激酶抑制因子如p15、p16、p21等[13]。抗癌活性是芹菜素的主要活性之一， 细胞凋亡是基因调控细胞程序性死亡的过程， 凋亡异常与肿瘤发生发展有密切关系。细胞凋亡敏感性主要取决于于多种凋亡相关基因表达产物的水平及相互作用， 存在着多种控制细胞凋亡的复杂的调控系统。

体内肿瘤细胞生长主要是由于对机体正常调控机制的逃逸来实现的， 细胞正常的凋亡调控机制受到严格的控制。对多种肿瘤细胞株， 芹菜素以浓度及时间依赖性的方式诱导出现细胞皱缩、染色体凝集及DNA碎裂等特征性凋亡检测标志。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。本研究采用Annexin-V荧光与PI双染色技术在5637细胞中也获得同样结论。芹菜素能抑制人膀胱癌5637细胞生长， 诱发细胞凋亡。

Bcl-2和Bax基因家族在细胞凋亡过程中起着重要的调节作用[14]，Bcl-2和Bax蛋白之间的比例影响着细胞对各种凋亡诱导分子的敏感性，直接决定下游Caspases活化与否，从而决定凋亡是否发生。PARP正是Caspase的切割底物，切割过的PARP不能正常发挥功能，引起DNA的断裂[15]。PARP切割降解是细胞凋亡的标志之一。通过Western blotting 检测发现75、100μmol/L芹菜素处理后，PARP的切割增加，并且这种增加是浓度依赖性的。Bcl-2表达量多，细胞易于存活，而当Bax表达量过多时，容易形成Bax同源二聚体，导致细胞容易发生凋亡。通过Western blotting 检测发现75、100 μmol/L芹菜素可降低Bcl-2蛋白的表达，同时增加Bax的表达，且随着浓度的增加增加/抑制的效果更加明显。实验结果显示芹菜素诱导膀胱癌5637细胞凋亡的机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达，导致Bcl-2/Bax比值下降，从而诱导细胞凋亡。

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膀胱癌干细胞 篇4

1 材料与试剂

1.1 材料

膀胱癌细胞T24细胞 (由海口市人民医院中心实验室提供) , 37℃、5%二氧化碳下培养于含10%小牛血清、1%双抗 (青霉素和链霉素) 的RPMI-1640培养液 (Gibco) 中传代扩增备用。

1.2 试剂与仪器

吉西他滨 (GEM) 、吡柔比星 (THP) 、紫杉醇 (PTX) 都配制浓度0.1、1、10和100μg/m L四个浓度梯度[2,3,4], 平阳霉素 (PYM) 0.1、0.5、1及10μg/m L[5] (药物由北华大学附属医院提供) ;噻唑蓝 (MTT, Sigma) p H7.2的PBS配制成5 mg/m L, 过滤除菌并在4℃保存, DMSO、EDTA-0.25%胰蛋白酶、PBS, 37℃、5%二氧化碳培养箱、4℃冰箱、倒置显微镜、96孔板、计数板、生物安全柜、x MARK酶标仪等。

1.3 实验方法

1.3.1膀胱癌T24细胞传代培养将T24细胞复苏 (快融法) , 传2~3代后, 选择处于对数生长期细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液并计数, 将细胞总数调整到1.4×106个, 并将细胞充分吹打均匀分散, 按每孔5×103个100μL种到96孔板中 (四周孔用PBS填充, 防止污染) , 37℃、5%二氧化碳孵育, 至细胞单层铺满。

1.4 MTT法

向各孔中加入浓度梯度药物, 每孔100μL并设3个复孔, 37℃、5%二氧化碳继续培养、观察, 并设计好12、24及36 h时间梯度。按时间段每孔加入20μL MTT溶液, 继续培养4 h。终止培养, 小心吸出孔内液体后, 每孔加入150μL DMSO振荡混匀10 min, 酶标仪490 nm处测OD值。同时设置空白孔 (培养基、MTT、DMSO) 、对照组 (T24细胞、培养液、药物溶解介质PBS、MTT、DMSO) 。

1.5 计算与处理

抑制率 (IR) =1-实验组OD值/对照组OD值×100%, 空白组调零, 采用半数抑制 (IR≥50%) [6]。OD值组间采用方差分析法, 评估药物的作用。

2 结果

平阳霉素 (PYM) 在10μg/m L浓度以下抑制率 (IR) <50%, 同浓度的组间OD值有显著差异 (P<0.05) , 对膀胱癌T24细胞抑制不明显 (图1和表1) 。

注:用药组OD值与对照组OD值比较有显著性差异 (P<0.05) 。在同浓度情况下, 不同时间各组OD值比较无显著性差异 (P>0.05)

注:药物组OD值与对照组OD值比较有显著性差异 (P<0.05) 。在同时间情况下, 浓度0.1μg/m L组与1.0μg/m L组比较无显著性差异 (P>0.05) , 其余三组比较有显著性差异, P<0.05;覮同浓度下组间有显著性差异 (P<0.05) , 其余则无显著性差异 (P>0.05)

吡柔比星 (THP) 、紫杉醇 (PTX) 、吉西他滨 (GEM) 三组药物浓度达到1.0μg/m L左右时 (抑制率IR≥50%) 达到半数抑制;药物组OD值都低于对照组OD值, 差异显著 (P<0.05) , 三种药物对膀胱癌T24细胞都具有抑制作用 (图2、3、4和表2、3、4) 。

注:用药组OD值与对照组OD值比较有显著差异 (P<0.05)

浓度为1.0μg/m L处紫杉醇组抑制率随时间的延长而上升, 吡柔比星组基本无太大变化, 抑制率基本保持在50%左右。吉西他滨组则出现先下降后上升, 抑制率升降幅度较大。见图5。

3 讨论

平阳霉素 (PYM) 在10.0μg/m L才具有抑制作用, 在高浓度下毒副作用较大, 其体外实验用药浓度一般在500 ng/m L~1μg/m L左右[5], 在浓度<10μg/m L的药物组OD值与对照组OD值无显著差异 (P>0.05) , 不同时间组间有显著差异 (P<0.05) , 说明药物不能很好抑制癌细胞的增殖, 表明平阳霉素对膀胱癌T24无明显作用, 与临床用药习惯相符合[7]。吡柔比星 (THP) 、紫杉醇 (PTX) 两组的实验药物组与对照组比较有显著差异 (P<0.05) , 药物组OD值随用药浓度的升高而降低, 表现药物剂量的依赖性。在同浓度下, 不同时间组间无显著差异 (P>0.05) , 从而说明此两种药物能抑制癌细胞的增殖;吉西他滨则是在30 h后才有明显效果, 说明吉西他滨 (GEM) 也具有抑制作用但需要较长的作用时间。

另外, 吡柔比星 (THP) 浓度C为1.0μg/m L左右时达到半数抑制, 再从对患者化疗副作用方面考虑 (化疗药物浓度越低越好) , 故将1.0μg/m L作为吡柔比星最适浓度。同理可知紫杉醇 (PTX) 、吉西他滨 (GEM) 最适浓度也在1.0μg/m L左右 (如图1) 。浓度为1.0μg/m L的三种药物, 在不同的时间段有不同的抑制情况。12~36 h时间范围内, 吡柔比星 (THP) 抑制率基本无变化, 维持在50%左右, 说明它不出现时间的依赖性, 紫杉醇 (PTX) 则是随时间的延长, 其抑制率逐渐增加, 表现出时间依赖性, 吉西他滨 (GEM) 24 h后才有明显的增长幅度 (如图2) 。

以上表明, 膀胱癌T24细胞对紫杉醇 (PTX) 具有药物剂量依赖性和一定浓度下的时间依赖性, 吡柔比星 (THP) 具有药物依赖性, 吉西他滨 (GEM) 则需要较长的作用时间才能发挥作用。所以对此膀胱癌T24细胞紫杉醇 (PTX) 显示出最有效的抑制效果, 这也与临床习惯性用吉西他滨 (GEM) 有差别[7]。MTT法方便、快捷准确性较好, 但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水, 需被DMSO溶解后才能检测。这不仅使工作量增加, 也会对实验结果的准确性产生一定影响, 另外一种还原剂盐酸异丙醇又有挥发作用, 所以寻找更优良的试剂成为药敏实验研究的趋势。

随着近年来肿瘤患者的数量不断增加, 预防和治疗肿瘤引起广泛关注, 化疗作为肿瘤治疗的主要方法, 近年也频频遇到了患者耐药、用药针对性不强、用药过度以及对患者造成过大的毒副作用等诸多情况[8]。若能继续研究更优的药物敏感实验方法, 将对患者治疗起到有效的指导作用。

摘要：目的 对比吡柔比星 (THP) 、紫杉醇 (PTX) 、平阳霉素 (PYM) 、吉西他滨 (GEM) 对体外培养的人膀胱癌T24细胞的生长抑制作用, 为指导临床用药提供体外试验依据。方法 用噻唑蓝 (MTT) 法测定不同时间段和不同浓度的四种药物对膀胱癌T24细胞的作用效果。分三组:空白组、对照组、用药组。使用酶标仪 (xMARK, Bio-Rad) 在波长490 nm处读数。结果 平阳霉素 (PYM) 在浓度为10μg/mL有抑制作用;吡柔比星 (THP) 、紫杉醇 (PTX) 、吉西他滨 (GEM) 三种药物在浓度为1.0μg/mL时抑制率IR达到50%, 但吉西他滨 (GEM) 在30 h后才有明显的抑制效果。结论 平阳霉素 (PYM) 在体外实验用药浓度范围内, 基本对膀胱癌T24细胞无抑制作用;吡柔比星 (THP) 、紫杉醇 (PTX) 、吉西他滨 (GEM) 三种药物能明显抑制膀胱癌T24细胞增殖, 吡柔比星 (THP) 和紫杉醇 (PTX) 随着药物浓度的升高OD值逐渐降低, 表明膀胱癌T24细胞对药物剂量依赖性;在最适合体外用药浓度上, 紫杉醇 (PTX) 随时间的延长, 抑制率逐步增大, 表现出时间的依赖性。MTT法简单、快捷、有效, 应用在临床体外药物敏感试验上, 将对临床上肿瘤的个体化治疗起到有效的指导作用。

关键词：膀胱癌T24细胞,紫杉醇,吡柔比星,MTT法

参考文献

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膀胱癌干细胞 篇5

关键词：造血干细胞移植术；出血性膀胱炎；护理

【中图分类号】R472 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）06-0149-01

在行造血干细胞移植术治疗的时候，会因各种因素造成出血性膀胱炎，这不仅会影响手术的治疗效果，还会增加患者的痛苦及治疗费用，甚至会发生肾衰竭而致患者死亡。对此，我院在造血干细胞移植术中行综合护理干预，有效降低了出血性膀胱炎的发生率，现报道如下。

1 一般资料和方法

1.1 一般资料

选取本院自2014年1月至2014年12月期间所收治的116例行造血干细胞移植术的患者为研究对象。将其随机分为对照组和干预组各58例。对照组中，男37例，女21例，年龄20-80岁，平均年龄（52.7±6.4）岁，其中急性淋巴性白血病32例，慢性粒细胞性白血病26例；干预组中，男36例，女22例，年龄22-82岁，平均年龄（53.6±6.7）岁，其中急性淋巴性白血病33例，慢性粒细胞性白血病25例。对比两组患者的性别、年龄、疾病类型等一般资料，无明显差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

對照组给予一般护理：进行常规检查，监测患者的各项生命体征，进行抗感染治疗和护理。干预组给予综合护理干预：（1）预防治疗药物：根据患者的病情选用阿糖胞苷、司莫司汀、依托泊苷、抗胸腺细胞球蛋白等预防治疗药物。（2）补液护理：开通静脉通道进行补液护理，采用250ml，5%碳酸氢钠进行静脉滴注治疗，每8个小时滴注一次。（3）合理使用解毒剂：根据患者的具体情况将0.8g美司钠溶于100ml生理盐水中静脉滴注。（4）实施无菌操作：在手术中要严格按照无菌操作的规范进行操作，要加强患者皮肤及肛周的清洁卫生护理，定时使用消毒液对尿道口进行消毒。此外，要密切观测患者的皮肤、肠道等变化，如发现异常应及时给予针对性的处理。

1.3 观察指标

以两组的出血性膀胱炎发生率及护理满意度等为观察指标。

1.4 统计学分析

利用统计学软件SPSS 16.0对两组患者的相关数据资料展开分析，总结，计量资料表示为（ ）形式，计数数据对比采用X2检验法，计量数据对比采用t检验，若P<0.05则二者差异显著，对比具有显著的统计学差异。

2 结果

2.1 两组出血性膀胱炎发生率比较

干预组出血性膀胱炎发生率为5.2%，对照组出血性膀胱炎发生率为17.2%，干预组出血性膀胱炎发生率明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。具体见表1。

2.2 两组护理满意度比较

干预组对护理非常满意、满意、不满意分别有37例、19例、2例，护理满意度为96.6%；对照组对护理非常满意、满意、不满意分别有23例、26例、9例，护理满意度为84.5%。观察组护理满意度明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

造血干细胞移植术是治疗恶性血液病、非恶性难治性血液病、遗传性疾病和某些实体瘤的常用方法。它主要通过采集足够数量的造血干细胞，并对其进行严密的分型和配型，最后移植到受体以治疗某种疾病[1]。在行造血干细胞移植术时，会使用一些烷化剂类药物，膀胱在和含这些高浓度物质的尿液长期接触时，会导致膀胱粘膜急性或慢性损伤，引起化学性炎症，造成膀胱广泛的出血，也就是出血性膀胱炎。出血性膀胱炎不仅会影响手术的治疗效果，还会引发其他更加严重的疾病，严重影响患者的生命安全及术后生存质量。

有关研究表明，充分的水化、碱化尿液，以及使用解毒剂，严格进行无菌操作可以有效降低出血性膀胱炎的发生率[2]。因此在本研究中，通过进行合理的补液护理，能够使药物充分的水化，碱化尿液，从而能够有效降低药物降解产物对肾脏、膀胱的毒性损害；通过使用利尿剂能够避免药物在膀胱内滞留，降低对膀胱的损害；通过使用解毒剂，能够避免对膀胱黏膜的损伤，从而可以预防和减少出血性膀胱炎的发生率；通过指导患者养成正确的个人卫生及饮食习惯，严格按照无菌操作要求进行操作，能够有效预防感染。

通过本文研究显示，干预组出血性膀胱炎发生率（5.2%）明显低于对照组（17.2%），护理满意度（96.6%）明显高于对照组（84.5%），差异具有统计学意义（P<0.05）。这说明，在造血干细胞移植术中行综合护理干预，能够有效降低出血性膀胱炎的发生率，提高护理满意度，值得临床推广使用。

参考文献

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膀胱癌干细胞 篇6

关键词：高迁移率族蛋白B1,膀胱移行细胞癌,内毒素,磷脂酰肌醇3-激酶,蛋白激酶B

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤,其绝大多数为移行细胞癌。膀胱癌目前以手术治疗为主,但五年生存率低。慢性感染和炎症被认为是肿瘤发生、发展极为重要的原因之一。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种核内DNA结合蛋白,可以分泌到胞外并介导炎性反应,是一种重要的晚期促炎症因子[1]。研究显示,HMGB1的高表达与肿瘤细胞增殖、浸润、转移以及患者预后等关系密切[2]。最近研究表明,HMGB1在膀胱癌组织中高表达,且与肿瘤的分级、分期及患者预后相关[3,4]。脂多糖(LPS)可以诱导单核细胞、巨噬细胞等主动释放HMGB1到胞外[5,6]。LPS对膀胱癌细胞诱导HMGB1释放作用尚未见研究报道,本研究旨在观察LPS对膀胱癌细胞释放HMGB1的影响,并探讨其相关信号通路机制,为阐明疾病治疗新途径提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱移行细胞癌细胞株T24购自中国科学院细胞库;RPMI-1640培养液、OPTI-MEM I培养液购自美国Gibco公司;LPS、LY294002购自美国Sigma公司,HMGB1ELISA试剂盒购自日本Shino-Test公司;Trizol、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。HMGB1、GAPDH引物由日本TaKaRa公司合成。

1.2 细胞培养

使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液,将人膀胱癌细胞株T24置于5%CO2培养箱中培养,至细胞达到对数生长期时,换用无血清OPTI-MEM I培养液。首先经预实验筛选出LPS的合适浓度和LY294002的不同浓度及检测培养上清液中HMGB1含量的最佳时间。选择100μg/L LPS为作用浓度。只加OPTI-MEM I培养液组为对照组,加含100μg/L LPS培养液组为LPS诱导组,并于LPS诱导6、12、18、24 h检测培养上清液中HMGB1浓度和细胞HMGB1 mRNA表达水平。加100μg/L LPS及不同浓度LY294002组为LY294002干预组,LY294002预处理时于100μg/L LPS诱导前1 h加入培养细胞,干预24 h后,收集细胞培养液,然后离心取上清液检测HMGB1含量。每组实验均重复3次。

1.3 HMGB1浓度测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中HMGB1浓度。按试剂盒说明书进行实验。

1.4 HMGB1 mRNA测定

根据Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录成c DNA,以c DNA为模板进行PCR扩增。HMGB1上游引物:TTGTCGGGAGGAGCATAA,下游引物:GGGCGAT-ACTCAGAGCAGAA,扩增产物长度为267 bp。内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),上游引物:AACGGATTTG-GTCGTATTG,下游引物:GGAAGATGGTGATGGGATT,扩增产物长度为208 bp。PCR循环参数为95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火/延伸20 s,循环40次。以目的基因HMGB1和内参GAPDH的Ct值之差(△Ct)作为评价目的基因m RNA相对表达水平的指标。目的基因m RNA的相对量按公式:目的基因=2-△△Ct计算。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,组间比较采用双侧t检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对膀胱癌细胞HMGB1释放的影响

膀胱癌细胞T24经100μg/L LPS诱导12、18、24 h后,培养上清液中HMGB1含量均高于各自对照组(P<0.05或P<0.01),分别为对照组的1.9、3.5、4.2倍,见表1。

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.2 LPS对膀胱癌细胞HMGB1 mRNA表达的影响

膀胱癌细胞T24经100μg/L LPS诱导12、18、24 h后,细胞HMGB1 mRNA表达水平均高于各自对照组(P<0.05或P<0.01),分别为对照组的2.2、2.3、3.2倍。见表2。

2.3 PI3K/AKT信号通路抑制剂对LPS诱导膀胱癌细胞HMGB1释放的抑制作用

PI3K/AKT信号通路抑制剂20、40μmol/L LY294002对LPS诱导24 h的膀胱癌细胞T24释放HMGB1均显示明显的抑制作用(P<0.01)。40μmol/L的LY294002抑制作用强于20μmol/L(P<0.05)。10μmol/L的LY294002对LPS诱导的膀胱癌细胞释放HMGB1未起抑制作用(P>0.05)。见图1。

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

HMGB1是普遍存在于真核细胞核内重要的非组蛋白染色体结合蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度快而被命名。HMGB1过去被认为是染色质的结构成分,功能局限在核内,主要参与稳定核小体结构、促进基因转录、参与DNA复制及调节类固醇激素等活动。1999年,Wang等[1]首次发现HMGB1可以介导炎性反应,是一种重要的晚期炎症介质。

HMGB1可以在细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、LPS等因素刺激下,由单核细胞、巨噬细胞等主动分泌;也可由坏死细胞或受损细胞被动释放。HMGB1参与许多疾病的病理过程,如脓毒症、肿瘤等[2,7]。研究表明,HMGB1在肝癌、结肠癌、肺癌等人类恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤的进展及患者预后等相关[2]。HMGB1在膀胱癌中的研究极少,最新研究发现,HMGB1在膀胱癌组织中高表达,且与肿瘤的分级、分期及患者预后有关[3]。但HMGB1在膀胱癌中的具体分子作用机制尚未见研究报道。

本研究以LPS作为刺激因素,探讨其对膀胱癌细胞T24HMGB1释放的影响。应用台盼蓝染色法检测到100μg/L LPS诱导24 h后,各组膀胱癌细胞存活率均在95%以上,因而排除了细胞通过坏死损伤发生的HMGBl被动释放。本研究显示,膀胱癌细胞经缺氧诱导12 h后,培养上清液中HMGB1蛋白含量较常氧对照组升高,并呈时间依赖性,24 h达到峰值。本研究亦测定了细胞HMGB1基因表达水平,实验结果显示,LPS诱导12 h时细胞HMGB1基因水平已显示增高,提示LPS诱导的HMGB1释放增加受转录水平调控。

膀胱癌干细胞 篇7

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌BIU87细胞株由北京医科大学泌尿外科研究所馈赠。取出冻存管，立即投入37℃水中，1 min内融化，然后离心去除冻存液，用约10倍RP-MI 1640完全培养液洗1次，接种于培养瓶中，待细胞贴壁后更换培养液，加入含10%FBS、青霉素100μ/m L、链霉素100μ/m L、L-谷氨酰胺和抗坏血酸的RPMI 1640培养基并置入细胞培养箱，在37℃、5%二氧化碳条件下培养。每3 d更换培养液1次;细胞长成单层后，用0.25%胰酶EDTA消化、传代。

在超净工作台上，将已消毒的多聚赖氨酸处理的盖玻片放入6孔板内。当细胞进入指数生长期，生长情况良好时以每孔2 m L,5×105/m L接种于6孔培养板，作为实验细胞，并按实验要求分组。常氧组继续置37℃含5%二氧化碳的细胞培养箱中培养48 h后取出进行实验;低氧组培养基置于高压氧动物舱，内充一定量的N2使其内二氧化碳浓度为5%，舱内外气压相同，空调将室内温度调至37℃，48 h后取出培养基，细胞生长情况良好，即时实验。

1.2 试剂与方法

CD105蛋白采用标准免疫组织化学(SP法)检测。CD105(Endoglin)Mouse Monoclonal Antibody(美国Newmarker公司);过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组织化学试剂盒(北京中山)。

1.3 结果判断

由2名病理科医师采用盲法阅片的方式，进行结果判断。随机选择5个高倍镜视野(400倍)，CD105蛋白阳性表达时，细胞浆和细胞膜着色，呈浅黄色-黄褐色。每个视野下计数200个细胞，计算阳性细胞率(%)，最后取其平均值。

1.4 统计学方法

所有运算过程均在SPSS 10.0统计软件上运行完成。每组设20张细胞片，实验数据以每张细胞片阳性细胞率表示(x±s)%，组间比较采用秩和检验(Kruskal-Wallis Test法)，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

人膀胱癌BIU87细胞株中CD105蛋白主要表达于细胞膜及细胞浆(见图1、图2)，其在低氧组和常氧组阳性表达率分别为(90.4±8.2)%和(61.0±7.5)%，经Kruskal-Wallis Test法检验，差异有显著性，P<0.01。实验结果见附表及图1、2。

3 讨论

BTCC是泌尿系统最常见恶性肿瘤，具有易发生侵袭和转移、术后易复发等生物学特性[1]，约有70%的患者虽经系统和正规治疗，但仍然复发，约有30%的肿瘤发生侵袭或/和远处转移[2]。而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的最主要因素。

实体瘤的发生发展均依赖于一定的条件，即肿瘤微环境，包括细胞环境和脉管系统。由于瘤细胞呈失控性生长，耗氧量大而且代谢产物多，血管生成速度总是不能与瘤细胞增殖速度保持一致，瘤细胞可浸润至氧供较少区域，这样可能导致肿瘤内低氧。低氧诱导血管生成是通过低氧诱导因子HIF-1诱导血管内皮生长因子(VEGF)表达从而调控肿瘤血管生成[3]。

CD105又名Endoglin，是内皮细胞表面与增殖相关的膜抗原，是TGF-β1，-β3受体复合物成分之一，在血管内皮细胞中表达[4]，其上调与血管新生有关。CD105调节内皮-间叶细胞的信号通路，是血管形成所必需[5]。

杨庞等[6]研究发现CD105在BTCC组织中高表达，抗-CD105标染的微血管密度(MVD)与BTCC分级分期、转移及复发密切相关。而笔者在人膀胱癌BIU87细胞株中研究了低氧与常氧状态下CD105蛋白的表达，发现它们在低氧组中的阳性表达率(90.4±8.2)%高于常氧组(61.0±7.5)%，经统计学检验差异有显著性。MAIER等[7]用AGM-1470(血管抑制因子)及TEC-11(抗CD105单克隆抗体)可以显著抑制微血管及大血管内皮细胞增殖。进一步的研究证实，此两者均可抑制u-PA的产生，从而抑制新生血管形成。这提示抗CD105单克隆抗体可以为抗肿瘤血管生成提供另一条途径，具有重要的临床应用价值。

摘要：目的 研究人膀胱癌BIU87细胞株中低氧与常氧状态下CD105表达,为膀胱癌的抗血管治疗提供理论依据。方法 在人膀胱癌BIU87细胞株中用免疫组织化学检测常氧与低氧状态下CD105蛋白的表达。结果 人膀胱癌BIU87细胞株CD105蛋白在低氧组和常氧组阳性表达率分别为(90.4±8.2)%和(61.0±7.5)%。结论 人膀胱癌BIU87细胞株中低氧诱导CD105表达。

关键词：人膀胱癌BIU87细胞,低氧,CD105,侵袭,转移

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膀胱癌干细胞 篇8

1 临床资料

1.1 一般资料

2009年1月—2009年12月收集了我院血液科造血干细胞移植病房32例恶性血液病病人行HSCT治疗, 其中男20例, 女12例;年龄13岁～63岁;异基因HSCT病人25例, 自体HSCT病人7例;3例病人出现2级出血性膀胱炎, 1例为3级出血性膀胱炎, 均为男性病人, 出现时间在移植后26 d～35 d。

1.2 临床表现

1.2.1 症状和体征

病人可出现肉眼或镜下血尿、蛋白尿以及尿频、尿急、尿痛膀胱刺激症状, 严重时血块阻塞尿道可引起排尿困难、尿潴留, 甚至出现肾盂积水、肾功能受损, 继发贫血等。

1.2.2 临床分级

血尿按轻重程度可分为镜下血尿和肉眼血尿。1级为镜下血尿;2级为肉眼血尿;3级为肉眼血尿伴血块;4级为肉眼血尿伴泌尿系梗阻[1]。

1.3 结果

通过采取积极有效的护理措施, 期间发生2级以上出血性膀胱炎病人1周内均肉眼血尿消失, 尿频、尿急、尿痛膀胱刺激症状消失, 无一例出现出血性膀胱炎相关死亡。1例3级出血性膀胱炎病人因严重急性移植物抗宿主病 (aGVHD) 而死亡。

2 护理

2.1 预处理期间的护理

2.1.1 水化、碱化

在预处理前1 d开始给病人大剂量的静脉补液, 充分水化, 每日补液量为5 000 mL～6 000 mL, 注意补充电解质, 并保证液体匀速滴入, 对白消安及环磷酰胺代谢产物加以稀释使之迅速排出体外。化疗前1 d开始给予病人5%碳酸氢钠250 mL, 12 h静脉输注1次, 碱化尿液, 使尿液pH保持在7～8, 以减少药物的降解产物对肾脏、膀胱的损害。

2.1.2 利尿

预处理期间使用呋塞米20 mg静脉注射, 每天2次, 并鼓励病人多饮水, 每日保证饮水2 000 mL以上。采用强迫性利尿, 使病人有足够的尿量, 要求每小时尿量在250 mL以上。如果尿量少应遵医嘱酌情加用利尿剂。

2.1.3 解毒剂的应用

美司钠为特异性的解毒剂, 是一种含有半胱氨酸的化合物, 能与重复活化的环磷酰胺的毒性代谢产物丙烯醛相结合, 形成非毒性产物自尿中迅速排出体外, 预防出血性膀胱炎的发生。在白消安/环磷酰胺方案中使用环磷酰胺的同时遵医嘱给予0.9%氯化钠100 mL加入美司钠2.0 g静脉输注, 并在环磷酰胺使用的3 h、6 h、9 h重复使用美司钠。环磷酰胺停药后美司钠常规再使用1 d。

2.2 造血干细胞回输后粒细胞缺乏期的护理

由于HSCT回输后病人在造血重建前会处于粒细胞缺乏期, 易受到自身及各种外源性感染。某些病毒感染, 如腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒感染等均可引起出血性膀胱炎的发生, 在护理过程中应严格执行无菌操作技术, 加强病人五官及皮肤、肛周清洁卫生。准确按医嘱皮下注射粒细胞集落刺激因子。如有病毒感染应遵医嘱使用抗病毒药物 (阿昔洛韦、更昔洛韦等) , 做到准时间、准剂量、准浓度给药, 并应监测药物的不良反应。

2.3 加强病情监测

每日监测体重、腹围和血压的变化, 保持出入量平衡。补液应均匀滴入病人体内。如病人心肺功能较差者, 可在心电监护下进行补液, 严密监测心律、呼吸和血压, 并备齐各种抢救物品。遵医嘱定期监测血常规、血电解质的变化, 及时予以纠正和补充电解质和红细胞、血小板等血制品。每日观察尿液的颜色、性质, 每日早晚用试纸监测尿液pH值, 使尿液pH值保持7～8, 呈弱碱性。定期监测尿常规, 同时倾听病人的主诉, 注意有无尿频、尿急、尿痛等尿路刺激症状。

2.4 行膀胱冲洗病人的护理

2级以上出血性膀胱炎病人可酌情行膀胱冲洗。膀胱冲洗可稀释膀胱内的血块, 增加尿量, 促使血块排出, 使膀胱的炎症性出血得以缓解。可根据病人的实际情况选择合适的Foley三腔气囊导尿管行膀胱灌注。灌注液可选择0.9%氯化钠溶液, 也可膀胱内注射止血药物, 根据病情选择持续或间歇冲洗, 一般3 000 mL液体按500 mL/h进行冲洗, 速度不宜过慢, 否则达不到冲洗效果。在病人行留置导尿冲洗期间, 应注意每日更换集尿袋, 保持尿道口及会阴部的清洁卫生, 留置导尿管不超过1周。观察引流液的颜色、量和性质, 血块堵塞出现引流不畅时可用0.9%氯化钠溶液50 mL进行反复冲吸, 有的病人在留置导尿期间会出现短暂轻微尿道痉挛性疼痛, 可安慰病人, 无需特殊处理, 严重者可用利多卡因胶浆纱布进行局部湿敷。当尿红细胞阴性后24 h可拔除尿管, 拔除尿管前可行粒-单核细胞集落刺激因子300 μg～600 μg膀胱内给药, 并夹管尽量保留30 min以上以促进膀胱黏膜的恢复[2]。

2.5 心理护理及健康宣教

向病人强调多饮水的重要性, 饮食清淡易消化, 也可食用水果或蔬菜汤、红豆汤等以增加尿量。督促指导并协助病人保持尿道口及会阴部的清洁, 每日用1∶5 000高锰酸钾溶液坐浴2次。如病人已出现出血性膀胱炎, 应安慰病人, 嘱其勿紧张, 告知此为自限性疾病, 鼓励病人积极配合水化、碱化及止血治疗。强调多饮水、勤排尿的重要性, 尤其在病人留置导尿期间应给予病人必要的生活帮助, 防止意外事故的发生。

3 小结

出血性膀胱炎是指某些药物或化学制剂在尿中产生对膀胱的急性或慢性的损伤, 导致膀胱广泛的炎症性出血。出血性膀胱炎是HSCT的常见并发症之一, 目前尚无十分有效的药物治疗。国外报告发生率3%～35%, 无预防措施者可达68%[3], 其中严重者占2%～5%, 然而这些严重者病死率则可高达30%～40%[4]。出血性膀胱炎可在HSCT的早期或晚期出现, 早期出血性膀胱炎多由于药物或其代谢产物损害膀胱黏膜所致, 大剂量环磷酰胺是出血性膀胱炎的主要原因。晚期出血性膀胱炎多与病毒感染有关, 偶见αGVHD[5]。出血性膀胱炎的预防很关键。造血干细胞移植病房护士充分了解出血性膀胱炎的病因和发生的危险因素, 熟悉其预防及治疗措施, 掌握出血性膀胱炎的监测和病情观察要点, 配合采取积极有效的治疗措施, 对提高移植成功率、减轻病人痛苦及经济负担、避免出血性膀胱炎相关死亡是非常重要的。

参考文献

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[4]Levine LA, Richie JP.Urological complications of cyclophospha-mide[J].J Urol, 1989, 141:1063.

膀胱癌干细胞 篇9

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人膀胱癌T24细胞 (简称T24细胞) 购自中国科学院上海细胞库。苯扎溴铵 (浙江白云药业有限公司) 。MTT粉、二甲基亚砜 (DMSO) (美国Sigma公司) 。碘化丙啶 (PI) 单染试剂盒、Annexin V FITC/PI双染试剂盒 (南京凯基生物有限公司) 。RPMI 1640培养基、胎牛血清 (美国Hyclone公司) 。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

取出冻存管, 立即投入37℃水中, 1 min内融化, 然后去除冻存液, 用约2 m L的冷RPMI1640完全培养液洗1次, 接种于培养瓶中, 待细胞贴壁后更换培养液。T24细胞在含10%胎牛血清、青霉素100 u/m L、链霉素100μg/m L的RP-MI1640完全培养液中以37℃、5%二氧化碳条件下培养, 隔天更换培养液1次。细胞长成单层后, 用0.25%的胰蛋白酶消化, PBS洗涤2次后吹打成单细胞悬液, 用吸管分别移至含RPMI 1640完全培养液的培养瓶中 (按1∶2传代) 继续培养。

1.2.2 MTT实验和倒置相差显微镜观察细胞形态

取对数生长期的T24细胞悬液并将密度调整为5×104个/m L接种于96孔板, 每孔100μL, 培养24 h。吸去培养液, 加入含不同浓度 (0、0.1、0.5、1、5、10、100和1 000μg/m L) 的BB培养液200μL继续培养24 h, 每组设5个复孔。将96孔板置于倒置相差显微镜下, 观察细胞生长状况及形态变化。每孔加MTT 20μL (5 mg/m L) , 再培养4 h, 弃上清, 每孔加DMSO 150μL, 作用15 min并振荡, 于波长为490nm酶标仪检测吸光度 (OD) 值。根据公式计算细胞存活率 (%) = (实验组平均OD值-空白对照组平均OD值) / (阴性对照组平均OD值-空白对照组平均OD值) ×100%;细胞抑制率 (%) =1-细胞存活率[4]。实验重复3次。

1.2.3 流式细胞仪 (PI单染法) 检测细胞周期

取对数生长期的T24细胞, 用胰酶消化后按每孔4.0×105个细胞接种于6孔板2 m L, 24 h后换液, 分别加入含有不同终浓度苯扎溴铵 (0、0.5、1、5和10μg/m L) 的培养液4 m L继续培养24 h后收集细胞。PBS洗涤1次, -20℃预冷的75%乙醇固定24h, PBS洗涤1次后各管加入600μL PI和RNA酶混合液, 避光染色30 min, 然后利用流式细胞仪 (FCM, 美国Beckman Coulter) 检测, 并进行细胞周期分析, 各周期细胞分布以百分数 (%) 表示。每组设3个复孔, 实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪 (Annexin V FITC/PI双染法) 检测细胞凋亡

细胞培养、接种、分组及作用时间同细胞周期测定, 不同终浓度苯扎溴铵 (0、0.5、1、5和10μg/m L) 作用T24细胞24 h后收集细胞, 预冷PBS洗涤2次, 用100μL Annexin V Binding Buffer重悬细胞, 加入Annexin V FITC和PI溶液各5μL, 室温避光孵育15 min, 加入200μL Annexin V Binding Buffer, 于1 h内利用流式细胞仪 (FCM, 美国Beckman Coulter) 检测, 并进行细胞凋亡分析, 各期凋亡细胞以百分数 (%) 表示。每组设3个复孔, 实验重复3次。

1.3 统计学方法

所有实验结果数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析处理, 结果均以 (±s) 表示。各组结果组间比较采用方差分析, 以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 人膀胱癌T24细胞复苏后的正常形态

倒置相差显微镜下, 观察人膀胱癌T24细胞复苏贴壁后的形态。可见细胞紧贴瓶底生长, 增殖活跃, 数量多;细胞间连接紧密, 相邻细胞生长融合成片。单个细胞饱满透亮, 体积较大, 形态呈多边形或不规则形, 胞膜完整, 细胞内可有单个或多个细胞核, 见图1、2。

2.2 苯扎溴铵对T24细胞增殖的抑制作用

MTT法检测不同浓度苯扎溴铵作用于T24细胞24 h后, 对细胞增殖的抑制作用结果显示, 苯扎溴铵浓度<0.5μg/m L时, 对T24细胞的增殖无明显的抑制作用 (抑制率<10%) ;浓度>0.5μg/m L时, 细胞增殖抑制曲线变陡, 抑制率随着药物浓度的增加而增加, 组间比较差异具有显著性 (P<0.05) , 呈浓度依赖性。当浓度为100μg/m L时, 抑制率达95.35%, 随着药物浓度增加, 抑制率增加不明显, 呈现平台效应, 见表1和图3。

2.3 苯扎溴铵对人膀胱癌T24细胞形态的影响

图4显示, 倒置相差显微镜下观察可见正常阴性对照组T24细胞紧贴瓶底生长, 增殖活跃, 数量多, 细胞间连接紧密。单个细胞饱满透亮, 体积较大, 形态呈多边形, 胞膜完整, 细胞内可有单个或多个细胞核。浓度0.1μg/m L的苯扎溴铵干预组细胞形态与阴性对照组基本无差别。浓度0.5μg/m L的苯扎溴铵干预组细胞出现皱缩改变, 随着苯扎溴铵浓度增高 (1~10μg/m L) , 细胞形态变化更加明显, 逐渐出现皱缩、体积变小、变圆, 细胞膜完整, 胞质浓缩, 伴有凋亡小体出现, 呈现出凋亡细胞的形态学改变。高浓度100μg/m L及1 000μg/m L苯扎溴铵干预组, 细胞数目少, 细胞间失去连接, 细胞核固缩, 细胞膜裂解成碎屑状, 培养液浑浊, 呈现出坏死细胞的形态学改变。

A:阴性对照组, B:0.1μg/m L苯扎溴铵组, C:1μg/m L苯扎溴铵组, D:10μg/m L苯扎溴铵组, E:100μg/m L苯扎溴铵组, F:1000μg/m L苯扎溴铵组

注:覮与对照组 (0μg/m L) 比较, 差异有显著性, P<0.05

2.4 苯扎溴铵对T24细胞周期的影响

流式细胞术 (PI单染法) 检测发现随着苯扎溴铵浓度增高 (0.5~10μg/m L) , G2/M期细胞的比例也逐渐增高, S期细胞比例逐渐减少, 见表2。

注:覮与对照组 (0μg/m L) 比较, 差异有显著性, P<0.05

2.5 苯扎溴铵对T24细胞凋亡的诱导作用

注:覮与对照组 (0μg/m L) 比较, 差异有显著性, P<0.05

流式细胞术 (Annexin V FITC/PI双染法) 检测发现, 0.5~10μg/m L浓度的苯扎溴铵作用人膀胱癌T24细胞24 h后, 早期凋亡细胞比例、晚期凋亡细胞比例及总凋亡细胞比例与阴性对照组相应的各期细胞凋亡率相比, 差异均有显著性, 呈浓度依赖性增高 (P<0.05) , 见表3。

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。每年膀胱癌新诊病例中, 约75.00%~80.00%为非肌层浸润性膀胱癌, 组织学的主要类型为移行细胞癌[5]。目前, 非肌层浸润性膀胱癌的治疗方法, 首选TURBt术后, 经膀胱腔内灌注药物。术后膀胱内灌注药物治疗可降低和延缓肿瘤复发, 预防肿瘤发生浸润, 提高患者的生存率和生活质量[6]。理想的膀胱内灌注药物应具有对肿瘤细胞敏感性高, 能在膀胱上皮内迅速达到有效药物浓度、全身吸收少、副作用小、价格低的特点。目前, 临床用于预防膀胱肿瘤复发的灌注药物主要分为抗癌化疗药物及免疫制剂, 但由于存在较高的毒副作用和价格昂贵的特点, 患者往往难以耐受。

苯扎溴铵是一种季铵盐阳离子表面活性剂类的广谱杀菌剂。既往研究表明其主要通过与细菌细胞膜表面的蛋白质、脂类和G蛋白相互作用, 改变细菌的胞浆膜通透性, 阻碍细菌代谢而起杀菌作用[1]。0.1% (1 000μg/m L) 的苯扎溴铵水溶液 (又名新洁尔灭) 广泛用于手术前皮肤、黏膜、伤口的消毒以及手术器械的消毒;0.005% (50μg/m L) 的溶液可以用作尿道和膀胱灌洗, 0.0025% (25μg/m L) 的溶液用作膀胱保留液, 治疗及预防泌尿系感染[7]。目前, 有临床研究表明0.1% (1 000μg/m L) 苯扎溴铵溶液灌注非肌层浸润性膀胱癌TURBt术后患者, 可以有效地预防肿瘤复发[2]。另外, 有动物实验表明, 0.05% (500μg/m L) 浓度的苯扎溴铵溶液能导致大鼠膀胱黏膜发生炎症反应, 但作用深度不达肌层, 亦不妨碍膀胱黏膜再生, 且对肝肾功能没有影响[8]。因此, 苯扎溴铵有望成为一种安全、有效的、理想的膀胱灌注治疗药物, 本实验研究旨在探讨苯扎溴铵抗膀胱癌可能的作用机制。

膀胱癌的发生、发展与膀胱黏膜上皮细胞增殖和凋亡异常密切相关。任何引起膀胱黏膜上皮细胞过度增殖和凋亡能力下降的因素都可能导致膀胱癌的发生。目前发现, 临床应用的大多数抗肿瘤药物具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用[9,10]。

本研究采用MTT法检测不同浓度 (0~1 000μg/m L) 的苯扎溴铵作用T24细胞24 h后, 对肿瘤细胞的抑制作用。研究发现一定浓度的BB在体外可以抑制膀胱癌T24细胞的增殖, 这种抑制作用呈浓度依赖性, 且最低抑癌浓度为0.5μg/m L, 稍低于MAGDALENA等[3]研究同为季铵盐阳离子表面活性剂类的苯扎氯铵作用于眼结膜细胞最低有效作用浓度为1μg/m L的报道。推测两者出现微小偏差的原因, 可能是肿瘤细胞比正常细胞对化疗药物更加敏感。此外, 随着苯扎溴铵浓度增大到一定程度 (≥100μg/m L) , 抑制率不再增加, 表现为平台效应。笔者推测, 其可能的原因是当干预浓度达到100μg/m L时, T24细胞迅速发生坏死, 几乎所有的细胞失去增殖的能力, 细胞增殖已被完全抑制, 再增加浓度对T24细胞抑制率没有影响。光镜下形态学观察结果也支持了这一观点:浓度为0.1μg/m L时, 细胞生长状况及形态没有明显变化;浓度≤10μg/m L时, 可见细胞密度明显下降, 细胞变圆、核固缩及出现凋亡小体等典型的凋亡形态学表现;浓度≥100μg/m L时, 细胞几乎全部坏死, 细胞膜崩解, 培养皿底部附着细胞残骸, 培养液较浑浊。DEBBASCH等[11]对此的解释是, 高浓度苯扎溴铵诱导肿瘤细胞产生超氧化物阴离子O, 使肿瘤细胞膜的不饱和脂肪酸发生过氧化, 形成过氧化物脂质, 从而使膜的流动性增加, 脂质双层断裂, 细胞膜的完整性被破坏, 导致肿瘤细胞裂解, 而不呈现出在较低浓度时出现的细胞变圆, 核固缩, 呈浓度依赖性的凋亡形态学变化。这种高浓度苯扎溴铵对正常的细胞同样有毒性作用, 这就部分解释了为何高浓度 (500μg/m L) 的苯扎溴铵行大鼠膀胱内灌注时, 会引起正常膀胱黏膜迅速变白并坏死脱落。

细胞增殖是多阶段、多因子参与的精确、有序的调节过程。它包含三个组成部分, 即生长、DNA复制和细胞分裂。这些均体现在细胞的周期进程中。换言之, 细胞增殖是通过细胞周期的调控实现的。

因此, 根据MTT和倒置相差显微镜的结果, 本研究进一步选取0~10μg/m L浓度的苯扎溴铵干预24 h后, 利用流式细胞术 (Annexin V FITC/PI双染法) 检测其对T24细胞周期及凋亡的影响。本研究发现, 随着苯扎溴铵浓度增高, G2/M期细胞的比例逐渐增高;且早期凋亡细胞比例、晚期凋亡细胞比例以及总凋亡细胞比例也呈浓度依赖性增加, 与MTT及光镜结果一致。

因此, 综上所述, 苯扎溴铵在体外能抑制T24细胞增殖, 诱导细胞发生凋亡和坏死产生抗肿瘤作用, 但其具体机理有待进一步研究探讨。

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膀胱癌干细胞 篇10

1 临床资料

1.1 一般资料

2009年8月~2011年3月我科造血干细胞移植层流洁净病房共参与护理异基因造血干细胞移植患者10例, 其中男6例, 女4例, 年龄11~55岁, 3例病人出现2级出血性膀胱炎, 1例为3级出血性膀胱炎, 均为男性病人, 出现时间在移植后26d~35d。

1.2 临床表现

1.2.1 症状和体征

病人可出现肉眼或镜下血尿、蛋白尿以及尿频、尿急、尿痛、膀胱刺激症状, 严重时血块阻塞尿道可引起排尿困难、尿潴留, 甚至出现肾盂积水、肾功能受损, 继发贫血等。

1.2.2 临床分级

血尿按轻重程度可分为镜下血尿和肉眼血尿。1级为镜下血尿;2级为肉眼血尿;3级为肉眼血尿伴血块;4级为肉眼血尿伴泌尿系梗阻[1]。

1.3 结果

通过采取积极有效的护理措施, 期间发生2级以上出血性膀胱炎病人1周内均肉眼血尿消失, 尿频、尿急、尿痛、膀胱刺激症状消失, 无1例出现出血性膀胱炎相关死亡;1例3级出血性膀胱炎病人因严重急性移植物抗宿主病 (aGVHD) 而死亡。

2 护理

2.1 预处理期间的护理

2.1.1 在预处理前l d开始给病人大剂量的静脉补液, 充分水化, 每日补液量为5000 ml~6000ml, 注意补充电解质, 并保证液体匀速滴入, 对白消安及环磷酰胺代谢产物加以稀释使之迅速排出体外。化疗前l d开始给予病人5%碳酸氢钠250 ml, 12 h静脉输注1次, 以碱化尿液, 使尿液pH保持在7~8, 减少药物的降解产物对肾脏、膀胱的损害。

2.1.2 期间使用呋塞米20mg静脉注射, 每天2次, 并鼓励病人多饮水, 每日保证饮水2000ml以上, 采用强迫性利尿, 使病人有足够的尿量, 要求每小时尿量在250ml以上, 如果尿量少应遵医嘱酌情加用利尿剂。

2.1.3 解毒剂的应用美司钠为特异性的解毒剂, 是一种含有半胱氨酸的化合物, 能与重复活化的环磷酰胺的毒性代谢产物丙烯醛相结合, 形成非毒性产物自尿中迅速排出体外, 预防出血性膀胱炎的发生。在白消安/环磷酰胺方案中使用环磷酰胺的同时遵医嘱给予0.9%氯化钠20ml加入美司钠0.4 g静脉注射, 并在环磷酰胺使用的4 h、8 h、12 h重复使用美司钠, 环磷酰胺停药后美司钠常规再使用1d。

2.2 造血干细胞回输后粒细胞缺乏期的护理

由于HSCT回输后病人在造血重建前会处于粒细胞缺乏期, 易受到自身及各种外源性感染。某些病毒感染, 如腺病毒、流感病毒、巨细胞病毒感染等均可引起出血性膀胱炎的发生, 在护理过程中应严格执行无菌操作技术, 加强病人五官及皮肤、肛周清洁卫生, 准确按医嘱皮下注射粒细胞集落刺激因子。如有病毒感染遵医嘱使用抗病毒药物 (阿昔洛韦、更昔洛韦等) , 做到准时间、准剂量、准浓度给药, 并应监测药物的不良反应。2.3加强病情监测, 每日监测体重、腹围和血压的变化, 保持出入量平衡。补液应均匀滴入病人体内, 如病人心肺功能较差者, 可在心电监护下进行补液, 严密监测心律、呼吸和血压, 并备齐各种抢救物品。遵医嘱定期监测血常规、血电解质的变化, 及时予以纠正和补充电解质和红细胞、血小板等血制品;每日观察尿液的颜色、性质, 每次小便后用试纸监测尿液pH值, 使尿液pH值保持7~8, 呈弱碱性。定期监测尿常规, 同时倾听病人的主诉, 注意有无尿频、尿急、尿痛等尿路刺激症状。

2.4 行膀胱冲洗病人的护理

2级以上出血性膀胱炎病人可酌情行膀胱冲洗。膀胱冲洗可稀释膀胱内的血块, 增加尿量, 促使血块排出, 使膀胱的炎症性出血得以缓解。可根据病人的实际情况选择合适的三腔气囊导尿管行膀胱灌注, 灌注液可选择0.9%氯化钠溶液, 也可膀胱内注射止血药物, 根据病情选择持续或间歇冲洗, 一般3000ml液体按500ml/h进行冲洗, 速度不宜过慢, 否则达不到冲洗效果。在病人行留置导尿冲洗期间, 应注意每日更换集尿袋, 保持尿道口及会阴部的清洁卫生, 留置导尿管不超过l周, 观察引流液的颜色、量和性质, 血块堵塞出现引流不畅时可用0.9%氯化钠溶液50ml进行反复冲吸。有的病人在留置导尿期间会出现短暂轻微尿道痉挛性疼痛, 可安慰病人, 无需特殊处理, 严重者可用利多卡因纱布进行局部湿敷, 当尿红细胞阴性后24 h可拔除尿管, 拔除尿管前可行粒一单核细胞集落刺激因子300μg~600μg膀胱内给药, 并夹管尽量保留30min以上以促进膀胱黏膜的恢复[2]。

2.5 心理护理及健康宣教

向病人强调多饮水的重要性, 饮食清淡易消化, 也可食用水果或蔬菜汤、红豆汤等以增加尿量。督促指导并协助病人保持尿道口及会阴部的清洁, 每日用1:5000高锰酸钾溶液坐浴2次。如病人已出现出血性膀胱炎, 应安慰病人, 嘱其勿紧张, 告知此为自限性疾病, 鼓励病人积极配合水化、碱化及止血治疗, 强调多饮水、勤排尿的重要性, 尤其在病人留置导尿期间应给予病人必要的生活帮助, 防止意外事故的发生。

3 小结

出血性膀胱炎是指某些药物或化学制剂在尿中产生对膀胱的急性或慢性的损伤, 导致膀胱广泛的炎症性出血。出血性膀胱炎是HSCT的常见并发症之一, 目前尚无十分有效的药物治疗, 国外报告发生率3%~35%, 无预防措施者可达68%.其中严重者占2%~5%, 然而这些严重者病死率则可高达30%~40%。出血性膀胱炎可在HSCT的早期或晚期出现, 早期出血性膀胱炎多由于药物或其代谢产物损害膀胱黏膜所致, 大剂量环磷酰胺是出血性膀胱炎的主要原因;晚期出血性膀胱炎多见病毒感染有关, 偶见a GVHD[3]。出血性膀胱炎的预防很关键, 护士应充分了解出血性膀胱炎的病因和发生的危险因素, 熟悉其预防及治疗措施, 掌握出血性膀胱炎的监测和病情观察要点, 配合采取积极有效的治疗措施, 对提高移植成功率、减轻病人痛苦及经济负担、避免出血性膀胱炎相关死亡是非常重要的。

参考文献

[1]黄峻.陈吉庆, 李建勇, 等.血液疾病诊断与治疗策略[M].北京:科学出版社, 2007:383-384.

[2]王恒湘, 纪树茎.粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子膀胱灌注治疗骨髓移植术后出血性膀胱炎的疗效观察[J].临床血液学杂志, 2003。16 (6) :255-256.