基质培养

基质培养（精选十篇）

基质培养 篇1

实验鼠类生育能力强,是取材蜕膜细胞的良好材料。但由于小鼠子宫小,一只小鼠一次获得的蜕膜细胞量太少,而多只小鼠的蜕膜细胞由于免疫排斥的原因,一般不能放于同一个培养器皿中培养。因此,研究大鼠蜕膜细胞的培养十分必要。本研究在参考人类和小鼠蜕膜细胞的培养方法上,对大鼠蜕膜细胞进行了原代和传代培养,并在培养方法的细节上进行了一些改进。

*通讯作者

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验用有生育力的SD大鼠(320~370 g)购自四川大学华西实验动物中心。所有实验动物购回均暂养于本实验室动物房,饲养温度为20~25 ℃,自然光照,自由饮水与摄食。

1.2 实验仪器和试剂

1.2.1 实验仪器

KXS恒温水浴锅(上海科析实验仪器厂),Sartorius电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),生物解剖镜(湖南长沙创高科技有限公司),手提式压力蒸汽灭菌锅(申安医疗器械厂),细胞培养箱(311型,Thermo,USA),超净工作台(SW-CJ-2N 型,哈尔滨东联公司),Nikon倒置显微镜(CHINAYS2-H型,日本)。

1.2.2 主要化学试剂

胰蛋白酶(SIGMA公司),青霉素(华北制药有限公司),庆大霉素(西南药业股份有限公司),D-MEM/F-12 (1∶1)培养基(FD培养基,GIBCO公司),小牛血清(成都哈里),PRL免疫组织化学试剂盒(博士德公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 主要试剂的配制

(1)D-MEM/F-12培养液的配制:D-MEM/F-12干粉15.6 g,用超滤水溶解,加1.2 g NaHCO3混匀,用0.1 mol/L NaHCO3溶液调pH值至7.2~7.4后,定容至1 000 ml,0.22 μm微孔滤器(Millipore)过滤,分装,-20 ℃保存。(2)消化酶的配制:胰蛋白酶干粉0.25 g溶于 D-Hanks液100 ml中,分装后-20 ℃保存。

1.3.2 实验大鼠的预处理

2006年11月至2007年4月,将暂养于本实验室动物房的SD大鼠按雌雄比为1∶1合笼,第二天检查雌性大鼠阴道,以发现阴道内有精子为怀孕第1天,在怀孕第15天时进行蜕膜细胞的取材。

1.3.3 大鼠蜕膜细胞的原代培养

取妊娠15天SD大鼠乙醚麻醉,去毛后断颈处死。迅速将大鼠整体浸入75%酒精中消毒5 s,取出放入超净台,用75%酒精、碘酒消毒腹部和躯干部皮肤后剪开腹腔,无菌取出子宫,放入盛有4 ℃D-Hanks液灭菌培养皿中洗去血污。剪开子宫分离出胚胎,用无菌载玻片刮取子宫蜕膜组织,将蜕膜组织放入无菌小瓶中剪碎。在小瓶中加入适量0.25%胰蛋白酶液,37 ℃温浴30 min,然后加入含10%小牛血清的D-MEM/F-12培养液停止消化。用带5#针头的注射器吸取单细胞液,1 000 r/min离心10 min。用含10%小牛血清D-MEM/F-12培养液重悬细胞,1 000 r/min离心10 min,留细胞沉淀,加入2 ml含10%小牛血清D-MEM/F-12培养液,细胞混匀计数。调整细胞浓度为5.0×105个/ml,制成细胞接种液。在6孔细胞培养板(Corning-Costar)中种入1 000 μl细胞接种液,移入37 ℃ 5%CO2培养箱,培养24 h换液一次,以除去血细胞和其它不贴壁细胞,然后每48 h换液一次。培养6天后,观察并拍照。

1.4 原代细胞的传代培养

用预热(37 ℃)0.25%胰蛋白酶液酶解(时间3~5 min)原代培养的大鼠蜕膜细胞,加入含10%小牛血清D-MEM/F-12培养液终止酶解,用移液枪轻轻吹打使细胞脱离培养板孔壁,转移细胞至新培养板中进行培养。

1.5 链酶亲和素-生物素-过氧化物酶法

(SABC法)PRL免疫细胞化学染色检测培养细胞 将6孔培养板中的培养液吸净,用30% H2O2和纯甲酸以1∶50混合溶液将培养皿中长成单层的细胞固定15 min,灭活内源性过氧化物酶,PBS清洗3次(每次5 min)后进行PRL免疫细胞化学染色,DAB显色20 min, 倒置显微镜下计数阳性细胞百分比。

2 实验结果

2.1 体外培养的原代和传代蜕膜细胞

原代培养的大鼠蜕膜细胞需培养5~6天才能长满(约80%)培养板底部(见图1)。显微镜下可见几种细胞成分,其中蜕膜基质细胞(DSC)为主要成分,细胞形态呈梭形和不规则形;细胞核大而圆,位于细胞的中央;细胞间界限不明显。另外可见少量上皮细胞、不具有增殖能力的巨噬细胞等。

2.2 蜕膜细胞

PRL免疫细胞化学染色 经SABC法染色后,93%的蜕膜细胞PRL染色呈阳性,胞浆内为细小棕色颗粒,靠近细胞核染色较深。

3 讨论

3.1 通过原代细胞过夜换液的方法清除污染红细胞和不贴壁细胞成分,通过传代处理使DSC获得自然增殖优势,简化了DSC的提纯程序。

3.2 本实验用无菌载玻片刮取子宫蜕膜组织,用适量0.25%胰蛋白酶液,37 ℃温浴30 min酶解,然后用带5 #针头的无菌注射器吸取单细胞液,离心获得蜕膜细胞悬液。此方法用无菌注射器代替过滤网,过程简单、方便、经济,获得的细胞成活率高、接种后容易贴壁、生长迅速。

3.3 在6孔培养板中直接进行免疫染色和检测,缩短了检测的时间。

4 结论

本方法具有简单、快速和经济的特点,一次能获得数量较多的蜕膜基质细胞。

参考文献

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[4]陈浩宏,顾芝萍,游根娣,庄临之.人蜕膜细胞培养作为抗早孕药物筛选模型的研究.上海铁道大学学报,1998,19(11):1～3.

花生康替代基质研究 篇2

漂浮育苗是目前国内外烤烟生产中通用的先进育苗方式，也是今后一段时期我国烤烟育苗的发展方向。但是，烤烟生产中制约漂浮育苗大面积推广的因素主要有：一是生产成本举高不下，成为制约推广的瓶颈因素；二是烟苗生育前期长势较弱且不均匀；三是还存在死苗和草荒现象。为有效解决漂浮育苗上述问题，国内有的专家学者进行了烤烟漂浮育苗基质选材及不同基质材料配比对烟苗生长发育及成苗质量的影响之类的研究，这些研究大都因地制宜，从当地选择低廉的原料如玉米秸、腐殖土、褐煤、甘蔗渣等来替代育苗基质中的草炭。但是从未见有本课题采用花生糠发酵腐熟后替代原有基质中草炭的报道。

本课题基于科学发展观，从烟区实际生产条件出发，就地取材廉价的花生壳，打碎成糠后进行发酵腐熟、并进行高温蒸汽消毒，随之与蛭石、珍珠岩按照比例配制漂浮育苗新型基质进行培育烟苗，观察对烟苗生长发育及大田生育的影响，研究其作为基质主要原料的可行性；在多次试验的前提下，经考察和充分论证提出了按照80%花生糠+10%珍珠岩+10%蛭石配置新型育苗基质的最佳配方以及工艺流程；最后选址建厂，“产、学、研”相结合，将成果转化为生产力。

与目前商品基质相比，新型基质同时还具有原有基质所不具备的优点，即其创新性表现在：其

一、摆脱了育苗基质对草炭的依赖，节约了国家资源，维持了生态平衡；其

二、大大降低了生产成本；其

三、解决了苗床病害和草害；其

四、提供了烟苗适宜的生长环境；其

五、其价格的低廉性和较好的使用性能加速了漂浮育苗技术的普及，加快了相关农业如蔬菜、花卉种植业的发展。

浅析容器育苗基质 篇3

关键词 容器育苗；基质；成分；配比

中图分类号：S791.15 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）24-0-02

随着林业产业的发展与节能、减排、降耗和环保的关系日益突出，花卉、林业等高附加值的农业正向现代化、工厂化、规模化、机械化、经济化和市场化的现代化产业转变。且随着我国设施园艺的发展和种植业结构的调整，设施基质栽培逐步在全国各地迅速发展[1]。荷兰的基质栽培占无土栽培总面积的90%以上，法国81%，加拿大80%，而中国作为世界第一的设施园艺大国，无土栽培却少之甚少。故发展容器育苗显得尤为重要。

1 容器育苗基质

1.1 容器育苗

容器育苗是工厂化育苗的主要技术之一，具有操作简便、生产效率高、定植缓苗快等优点，特别适合工厂化和规模化生产的需要。容器育苗作为基质栽培的一种形式，是采用各种容器装入配制好的基质进行育苗，其造林成活率高、缓苗、生长快，是当今世界各国广泛应用的先进育苗技术。20世纪70年代，容器育苗在我国南方已广泛推广应用于国外松、木麻黄、相思和银合欢等树种[2]。基质最初起源于无土栽培的概念，是指作物周围的土壤环境已经不能满足作物对养分的吸收利用，严重影响了作物的产量和品质，人们转而寻找替代品，用固体基质来固定植物，并给植物提供营养及良好的水气环境的固体介质。容器苗培育是在装填有基质的容器中培育苗木的方法。苗木的根系与基质在有限的容器内形成“根团”能够做到在运输及起苗中布上苗木根系，在育苗时带着完整的苗木根系。这样，在容器中育成的林木容器苗，在自然条件比较恶劣的栽植地的造林成活率较高，对于加快荒山绿化，以及某些速生丰产林的培育，采用容器苗造林有着重要的意义[3]。尤其在立地条件差的地方，采用容器苗对提高造林成活率起到极为重要的作用。

1.2 容器育苗优点

容器育苗优点有：一是容器育苗占地面积少，能够提高土地的空间利用率；二是可节省种子，比大田播种育苗可节30%～50%的种子，尤其是有利于优良稀有珍贵树种的育苗；三是可缩短育苗周期，利用容器育苗只需3～6个月就能出圃造林，且没有缓苗期；四是可延长造林季节，由于容器苗带土移栽，对造林地适应性强[4]。在雨量充沛的地方，全年大部分时间均可造林；五是容器苗造林后先缓苗期，造林时不伤根，造林以后能正常生长；六是适合于实行机械化育苗，因容器育苗营养条件和管理一致，苗木生长整齐，使机械化和自动化作业成为可能；七是其能够代替传统土壤来创造人工的根系坏境；八是在苗木的管理方面易于控制苗木所需要的水分，养分、氧气和有机物质等，使苗木的根系处于相对适宜的根系环境，促进生长发育，从而发挥更大的生产潜力；九是设施基质污染率低，病虫害较少，而且便于控制，处理比较方便；十是利用工农业废弃物作为设施基质可以降低生产成本，提高植物的质量和产量。

1.3 基质的添加剂

基质的添加剂是指为满足苗木的生长需求，在基质中添加一些物质。张润花[5]等研究表明，草酰胺施肥处理能够促进番茄幼苗对氮、磷、钾营养元素的均衡吸收，利于干物质的快速积累，幼苗生长较快，株高、茎粗和叶绿素含量显著高于尿素处理，幼苗生长健壮。李长斌等研究表明生物保水剂可以提高酶的活性，使土壤微生物的生育率提高17.0%，土壤密度降低了2.9%。介晓磊[6]等研究表明，在土壤低吸力段（0～80 kPa），随着保水剂用量的增加，土壤持水容量增大，土壤容重下降，总孔隙度和毛管孔隙度则呈上升趋势。

1.4 基质的理化性质

育苗效果直接取决于基质的理化性质。基质的化学性质能够通过施肥等外部条件来调控，使其达到苗木生长的理想范围，但基质的物理性质不能通过外界环境的调控，故在进行育苗基质的选择上，应注意其孔隙特性是否满足苗木的生长需求。张沛健[7]等研究表明，桉树的育苗取决于育苗基质的化学性质。

1.5 容器种类

用于容器育苗生产的容器种类很多，大体上可分为塑料容器（塑料薄膜、硬塑料杯）、泥容器（营养砖、营养体）、纸容器3大类。最近几年，在育苗领域又出现了几种复合型的育苗容器。这些容器兼有各种优点，在育苗方面得到了很好的推广。育苗容器的形状有圆柱形、棱柱形、方形、锥形和蜂窝状等。其规格因树种、培育时间的不同差异较大。薄膜容器用于培育3～6个月苗木，使用规格为（4～5 cm）×（10～12 cm）的育苗杯即可。

2 常用的基质种类

2.1 泥炭

泥炭是国内外公认的理想无土栽培基质，泥炭具有适合植物生长理想的理化性质，对于植物的保水、保肥、提供养分、固定植株、质地轻以及透气等性能相对优于其他的无土栽培基质，因此倍受国内外的追捧。近年来，无土栽培基质越来越倾向于环保，无公害、轻质、品质好和管理方便等方面，基质的研究是无土栽培的第一步，同时也反映了无土栽培的水平。国内外对此给予了充分的重视[8]。现在即使泥炭资源丰富的国家很早就开始限制泥炭资源的利用。2010年3月初，英国环境部部长赫拉里·本（Hilary Benn）宣布了将于2020年实现无泥炭的新目标，英国园艺商贸协会（The Horticulture Trades Association，HTA）及其专家组，生长介质协会（The Growing Media Association，GMA）欢迎政府关于园艺业减少泥炭使用新目标的声明。

2.2 树皮

目前，以树皮为基质在国外的研究比较成熟。在美国的加利福尼亚州应用最多是松树皮。松树皮作为育苗基质，其理化性质的研究成果也比较成熟。研究表明，松树皮最为育苗基质，其理化性质在育苗过程中比较稳定。在我国，也有学者研究以树皮为育苗基质。李秋艳[9]等研究表明，多年腐熟的松树皮基质作为油松容器育苗基质，其育苗前后，基质的理化性质均在基质的理想范围之内。张沛健[10]等研究表明，粒径<2 mm的按树皮适宜做育苗基质。

2.3 蘑菇渣

蘑菇渣作为一种农业废弃物，已被广泛的应用在林业容器育苗中。蘑菇渣的EC值较高，不宜直接作为容器育苗基质，作为容器育苗基质之前，应先淋容，降低盐分。蘑菇渣作为育苗基质，能够为苗木的生长提供较多的营养。研究表明，蘑菇渣的pH值较高，在作育苗基质前，应添加一些碱性添加剂中和基质的酸碱性。陈恩波[11]等研究表明以6∶1∶1（蘑菇渣∶珍珠岩∶炉渣）的基质无论是在物理、化学、养分性状，还是播种姜柄瓜的壮苗指数、G值，均较其他处理和对照为好，可以初步确定为育苗替代基质。

2.4 废弃物

基质用秸秆、牛粪、菌棒等原料发酵后加工而成，主要用于瓜果、蔬菜、花卉和水稻育苗。用基质育苗可省工、省时、省力、省种、壮苗、降低成本及增产增收。同时，有利于改变农民焚烧秸秆的习惯，将其全部综合利用，焚烧秸秆现象“销声匿迹”。

3 容器育苗的发展趋势

3.1 基质的循环利用

随着生态建设的发展，林业容器育苗基质的要求也日趋严格。由于林业容器育苗基质具有成本低、便于运输、成活率高、无缓苗期等特点，容器育苗的量也随之不断的增加，这就对容器育苗基质提出了质的要求和量的需要。根据环保的要求，容器育苗基质要想实现可持续发展，就必须坚持基质的循环利用和无公害处理。

3.2 使用复配基质

由于长期使用单一的育苗基质可能会导致基质的养料不足、基质的持水孔隙过低，通气性差等现象的发生。使用复配基质，有助于改善基质的理化性质，是育苗的基质均能满足苗木的生长需要。选择无污染、能循环利用及育苗效果的复配基质是基质育苗的发展方向。

3.3 使用农林废弃物

国内外在研究利用各种有机废弃物开发合成性状稳定的经济型人工基质，并有了较好的进展。例如，利用椰子壳可发酵合成性状稳定的椰绒基质、食用菌菇渣是良好的基质合成材料、作物秸秆、稻壳等的有效利用[12]。相对成本低，材料来源广，基质理化性状稳定，育苗效果较好的环保型人工合成基质将是理想的容器育苗基质。现在生产所用的设施基质大都是生活垃圾的重新利用，不仅可保护环境免受污染，还可节约能源。

4 结语

容器育苗的栽培环境由多种基质共同营造，基质的物理性质、化学性质对容器苗生长具有决定性作用。研究容器育苗基质能够促进我国容器育苗产业的发展，实现容器育苗的精准调控。

参考文献

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[3]李继承，李玉文，葛剑平，等.红松容器苗的培育技术[J].东北林业大学学报，2000，28（3）：13-17.

[4]刘吉刚，费素娥，刘冬梅，等.育苗基质中氮磷比及其含量对番茄穴盘苗生长及营养状况的影响[J].西南农业学报，2007，20（1）：84-86.

[5]张润花，段增强.不同配比菇渣和牛粪基质的性状及其对幼苗生长的影响[J].安徽农业科学，2011（9）.

[6]刘忠珍，刘世亮，介晓磊，等.土壤环境中重金属形态区分方法的新进展及其应用[J].中国农学通报，2005（4）.

[7]张沛健，彭彦，谢耀坚，等.基于桉树皮的有机基质腐熟处理研究[J].热带作物学报，2011（3）.

[8]Montville M.E，WennyD.L.Application of ForliaFertil-izerDuring Bud Initiation Treatment to Container-grown Co-niferSeedlings[A].Roseburg Orgon.USDA，ForestService，GeneralTechn.Report RM-200[C].1990.

[9]李秋艳，毕君，武亚敬，等.松树皮复配基质的理化性质[J].林业科技开发，2015（3）.

[10]张沛健，谢耀坚，彭彦，等.桉树皮基质理化性质变化对苗木生长的影响[J].广东农业科学，2011（5）.

[11]陈恩波，钟建明，梁文芳，等.蘑菇菇渣不同配比基质的性状及其对姜柄瓜幼苗影响的初步研究[J].中国农学通报，2010（3）.

[12]乌丽雅斯，刘勇，李端生，等.容器育苗质量调控技术研究评述[J].世界林业研究，2004，17（2）：9-13.

兔骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定 篇4

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

新西兰大白兔(福建医科大学大学动物中心);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclon公司);0.25%胰酶加EDTA(Gibco公司);Percoll分离液(Sigma公司);超净工作台(DCM-1300,苏州);自动台式离心机(LD25-2,北京);CO2孵箱(Thermo forma 311,美国);倒置显微镜(Olympus);透射电镜(HU-12A,日立公司);细胞培养板、培养瓶(Sigma公司);荧光标记CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC单克隆抗体(美国PharMingen公司);流式细胞仪(Beckman counter Epics XL,美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔MSC的原代培养

新西兰大白兔(福建医科大学动物实验中心提供),6周龄,体重约1.5kg,雌雄不限。3%戊巴比妥钠静脉麻醉,于无菌条件下在双侧坐骨棘处用18号骨髓穿刺针接5m L注射器,内含肝素钠0.2mL(100U/mL),各抽吸骨髓液2mL,抽吸完毕迅速将注射器内液体均匀混合,注入培养皿,用1m L注射器反复吹打培养皿中的骨髓液约5min,置入离心管,1000r/min离心10min,弃去脂肪和上清,用PBS重悬制成细胞悬液,小心加入至2倍体积1.073g/m L的Percoll分离液上层,室温下以2000r/min离心25min。收集中间乳白色的有核细胞层,再用PBS洗涤2次,加入适量的含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液,置于离心管中,1000 r/min离心15min。弃上清液,加入3mL含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液,反复吹打,稀释成细胞悬液,以1.0×104/cm2接种于50cm2培养瓶中。于37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养,3d后首次半量换液,将未贴壁的细胞全部弃掉,以后每2~3d全量换液1次。

1.2.2 兔MSC的传代

在原代培养的细胞接近铺满培养瓶底时,用0.25%胰蛋白酶消化,倒置显微镜观察,待50%细胞变为圆形时,将胰酶倒掉,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液中止消化,再以1×104/cm2传代培养。

1.2.3 细胞形态观察

每天在倒置相差显微镜下观察MSC原代和传代细胞的生长情况及形态特征,并适时拍照。

1.2.4 细胞超微结构观察

细胞在培养皿中增殖满单层后,0.25%胰蛋白酶消化,移入离心管,1000r/min离心5min,洗涤细胞2次,末次离心后弃上清,取样行透射电镜观察。

1.2.5 流式细胞仪检测兔MSC的表面标志

取第3代MSC用PBS重新悬浮后,调整细胞浓度1×106/cm2,取100μL细胞悬液与CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD90-FITC单抗室温避光孵育30min后,用流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 MSC的生长情况及形态学特点

骨髓细胞经密度梯度离心后,接种于50cm2的培养瓶,倒置显微镜下观察培养液中存在大量大小不一的圆形细胞;24h后可见多数贴壁的圆形细胞中散在有少数多角形或短梭形细胞,有数个突起类似成纤维细胞;3~4d后梭形细胞和多角形细胞显著增多;5~6d后形成细胞集落方式生长,数量明显增多,呈现长梭形、纺锤形,细胞轮廓清晰,排列较紧密;7~9d后,细胞的生长明显加速,逐步形成大小不一、分散的细胞集落,呈放射状向四周扩展,细胞呈漩涡状或平行排列(图1);第10~12天,贴壁单层生长的细胞铺满整个培养瓶底,放射状或漩涡状生长方式更趋明显,非贴壁细胞通过换液己逐渐被清除,基本完成原代单层生长。传代细胞的细胞贴壁时间和增殖速度比原代培养要快,大约2h开始贴壁,培养约8~11d互相接触形成单层。传代细胞分裂相多见,胞体大,细胞边界不清楚,胞浆内颗粒多,显示细胞功能活跃,处于活跃的基质合成状态。传代至第10代后,细胞增殖速度减慢,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。

2.2 MSC透射电镜观察

透射电镜示:细胞胞体较大,表面有微绒毛,核大而不规则,核内以常染色质为主,核仁可见,部分细胞内有多个核仁。胞浆内见中等量线粒体,其体积较小,密度较高,可见中等量粗面内质网、部分粗面内质网束状扩张,可见少量高尔基复合体,有些细胞内可见较多次级溶酶体,细胞间未见连接(图2)。

2.3 MSC的表面抗原鉴定

经流式细胞仪检测第3代细胞样本(图3),CD34、CD45、CD29、CD90分别为0.79%、0.18%、96.8%、84.2%。CD34、CD45基本不表达,证实这些细胞是非造血干细胞;CD29、CD90表达阳性,表明分离的细胞具有MSC的特征。

(1)CD34检测为阴性;(2)CD45检测为阴性;(3)CD29检测为阳性;(4)CD90检测为阳性。

3 讨论

MSC是一种存在于骨髓的非造血干细胞,骨髓中绝大多数是造血干细胞,MSC的数量较少,一般认为MSC只占骨髓有核细胞的1/104~1/105[3~4],为了得到组织工程学需要的单一细胞,人们尝试用各种方法分离、纯化MSC。目前用于分离MSC的方法主要有贴壁筛选法和密度梯度离心法[5]。贴壁筛选法是根据MSC贴壁生长,而造血系细胞等因无法贴壁,则随培养液的更换而被清除[6]。但是,由此获得的MSC纯度不高,混合有较多的杂细胞,比如成纤维细胞、脂肪前体细胞等,所以体外培养特性不稳定[7]。密度梯度离心法是利用MSC与骨髓中其他细胞的密度不同,用特定密度的淋巴细胞分离液将MSC分离出来。这种方法应用梯度离心分离细胞,骨髓中的细胞按密度差别得以分离,所以可快速获得大量的高纯度细胞[8]。本实验用密度梯度离心法来分离培养MSC取得较好的效果。

目前尚没有十分理想的方法来鉴定MSC,主要通过细胞形态学特征如呈纺锤形、贴壁、成集落生长以及作为干细胞多分化潜能的确定(在不同的条件下,向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等分化的特性)来证明其干细胞的属性。我们分离培养的MSC从显微镜下观察,90%以上为梭形或呈纺锤形的细胞;电镜观察,细胞表面有微绒毛结构,细胞核大,核浆比例较正常细胞大,胞浆内细胞器以线粒体、内质网、溶酶体为主,说明细胞蛋白合成和分泌能力旺盛,能够大量摄取营养物质,功能活跃,显示了干细胞的幼稚特性,与成纤维细胞和血细胞等明显不同,这和文献相一致[9]。Pittenger等[10]认为,MSC细胞体积小,核浆比大,不表达分化相关标志如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶和osteopontin;在细胞贴壁附着后则细胞均一致地表达SH2,SH3CD29,CD44,CD71,CD90,CD106,CD120a,CD124等多种表面蛋白。MSC缺乏造血干细胞标记,不表达造血细胞抗原,如造血前提细胞标志抗原CD34,白细胞标志抗原CD45,淋巴细胞表面抗原CD11a,单核巨噬细胞表面抗原CD14,同时不表达分化抗原HLA-DR[10~11]。我们采用1.073g/m LPercoll密度梯度分离法,从兔骨髓中分离出单个核细胞,3d后首次半量换液,经多次换液,去除大量为贴壁的杂细胞,7~9d后细胞呈长梭形,漩涡状生长。经传代细胞逐渐纯化,至3代时采用流式细胞仪检测分离培养的细胞只表达CD29和CD90,而CD34、CD45均呈阴性表达,这表明我们分离培养的细胞是成分较为单一的MSC,而不是造血干细胞和成纤维细胞。

总之,实验结果表明利用本实验方法提取、纯化和扩增的MSC,MSC增殖能力较强,纯度高,可以作为组织工程的种子细胞,为组织工程骨的构建提供依据。

参考文献

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花卉栽培基质的土壤消毒技术 篇5

1、药剂消毒

每100㎡土壤撒施500克嗅甲烷，并与土壤充分拌匀;然后用塑料薄膜盖严，熏蒸4～5天后除膜，翻动土壤，散去药味，经15天后即可栽花。

2、高温消毒

①蒸汽法。把培养基质放在蒸笼里，在100℃左右高温下，经过1小时即可杀灭病菌和害虫。

②炒土法。把培养土放在铁锅里炒，保持温度90℃以上高温，炒作20～30分钟即可。

③烧土法。把培养土平摊在地上，厚约30厘米，在土上堆放秸杆和干草，燃烧20～30分钟;或在燃烧的柴草和秸干上，慢慢加土进行堆捂闷烧消毒。

3、土壤消毒剂

中药巴布剂基质配方的研究 篇6

巴布剂作为外用贴剂，具有使用简单、既可避免肝脏的首过效应及胃肠道反应，又延长药物作用时间等特点；与传统的黑膏、橡胶膏相比，具有生产中无“三废”，透皮效果较好，对皮肤无刺激性及致敏性，并能反复揭贴等诸多优点。有专家预测，巴布剂将成为21世纪药品中的新宠。

一、中药巴布剂的基本构成

中药巴布剂系指药材提取物、药材和或化学药物与适宜的亲水性基质混合后，涂布于无纺布上而制成的外用贴剂。从构成上来看，主要包括支持层、膏体层、背衬层三层结构。支持层又称底层或裱褙，主要起承载膏体的作用；膏体层即基质和主药部分，是巴布剂的核心，在贴敷中产生适度地粘附性使之与皮肤密切接触，以达到治疗疾病的目的；背衬层即膏体表面的覆盖物，起到保护膏体、防止膏体粘连的作用。

二、中药巴布剂基质的研究

1.基质常用原料及用量

基质对主药和巴布剂的成型影响很大，所以基质原料的选择显得至关重要。根据《中国药典》2005年版一部通则附录所载，巴布膏剂常用的基质原料按其作用大致可分为粘性剂、骨架材料、保湿剂、填充剂四部分。

粘性剂：外用贴剂首先应当具备一定的粘附性，才能满足临床需要。目前，最常用的高强度粘性剂当数聚丙烯酸及其钠盐；一般用量约占基质的3～10%。

骨架材料及增稠剂：骨架材料有天然、半合成和合成高分子聚合物，在基质中起赋形及增稠作用；一般用量约占基质的20%。常用的有明胶、羧甲基纤维素及其钠盐（CMC-Na）、卡波姆（Carbopol）、聚丙烯酸钠(PAA-Na)、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。

保湿剂：保水、保湿是基质制备过程中的重要环节，加入适当的保湿剂，可防止水分的挥发，且能溶解活性成分和分散高分子材料；其一般用量为基质的30～50% 。常用有甘油、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇等，也可以用它们的混合物。

填充剂：可以适当增加膏体的稠度、强度及着色，用量一般为基质的5％。常用的填充剂有微粉硅胶、高岭土、皂土、氧化锌等。

此外，透皮促进剂和交联剂对基质的成型也有很大的影响。促透剂可增加药物的透皮吸收速率，一般用量为基质的5%左右。常用的促渗透剂有二甲基亚砜、氮酮、冰片、桉叶油等；其中氮酮对机体皮肤的刺激小，有效浓度低，对亲水亲油性药物均有促进作用，尤其适合中药成分多而复杂的巴布剂选用[3]。交联剂是高价金属离子，可与骨架中的羧基形成三维网络结构，使巴布剂获得适宜强度。交联剂含量高，基质的内聚力增强，但粘性变差；可以通过增减螯合剂（如EDTA）的用量来调节交联反应的速度，使其与生产工艺相适应，又确保基质在较短的时间内达到适宜的强度。国外多选用甘氨酸铝做为交联剂，一般用量为0.1～0.5%。

总之，基质原料的具体选择应具备以下条件：①对主药稳定性无影响，无副作用；②有适当弹性和黏性；⑧对皮肤无刺激和过敏反应；④皮肤上无残存，能保持巴布剂的形状；⑤不因汗水作用而软化，在一定时间内具有稳定性和保湿性。

2.中药巴布剂基质的配方研究

基质的配方是巴布剂研究的基础与核心，配方设计合理与否，是能否制备出好的基质膏体的关键[4]。从近几年的文献报道来看，基质配方研究主要围绕粘性剂、骨架材料、保湿剂的配比展开，也有对交联剂的选择进行研究的。需要指出的是，基质配方研究要选择恰当的试验方法和评价指标才能达到目的。目前进行基质筛选的方法主要有正交设计法和均匀设计法；选用的评价指标主要分为两类：第一类为综合感观评价指标，诸如巴布剂的外观、涂展性、对皮肤的贴敷性、活动关节的追随性、对皮肤的刺激性等；第二类为仪器检测评价指标，主要包括巴布剂的黏着性、剥离强度、持粘力等物理性状指标和化学指标、生物指标。林桂涛等以成型巴布剂的剥离强度为衡量指标，采用正交试验法考察了乳康巴布剂基质的配比组成，最后确定基质制备最优配比为聚乙烯醇∶明胶∶聚丙烯酸钠∶丙二醇 = 0.1∶5∶5∶6。韩冬等通过均匀设计实验以剥离强度、黏着力和制剂外观作为考察指标，对卡波姆和聚丙烯酸钠作为凝胶骨架进行巴布剂基质研究，结果认为，此类巴布剂的最优处方为卡波姆 U10∶聚丙烯酸钠7S∶甘油∶丙二醇∶高岭土∶柠檬酸∶乙醇∶三氯化铝 = 0.5∶6.5∶27∶7∶1.6∶0.2∶8∶0.4.

除基质处方组成外，基质原料的不同规格、产地，甚至不同厂家生产的同一品种，均对基质的成型有所影响，其原因可能与聚合物分子量立体构型不同有关。

三、中药巴布剂的发展前景

据世界卫生组织预测，在20～30年内，大约有30％以上的药物将改成经皮给药制剂，势必掀起一个内病外治的新高潮。而我国拥有丰富且疗效确切的中药贴敷剂资源和悠久的中医外治法历史，我们相信，随着基质原料品种的不断增加，中药巴布剂研究的日益深入，它潜在的巨大市场将被开发，其产生的经济和社会效益将不可限量。

【参考文献】

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[2]催福德主编.药剂学[M].北京:人民卫生出版社,2003.

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[6]韩冬,崔黎丽,李国栋.巴布剂透皮给药基质的研究[J].第二军医大学学报,2005,26(5).

[7]刘淑芝.中药巴布剂研究现状分析及展望[J].中医外治杂志,2005,10,14(5).

基质培养 篇7

养基质泥炭固体基质是容器苗培育的基础。国内外经多年的研究认为, 容器苗基质应具备:弱酸性, pH 5～6之间;低肥性, 以利通过营养调节控制苗术规格;适当的容重和大小孔隙的平衡, 有形成稳定根团的性能;重量轻, 便于各项操作处理和进行两次试验。供试树种为兴安落运输。而在大兴安岭林区容器育苗叶松, 育苗容器为蜂窝状纸杯生产买践中, 长期采用林下表土做 (以每个育苗育苗基质。这种基质透气性差, 重量盘为单位 (内有88个单杯) , 随机区大而不便于运输。为改善这一现状, 组试验设计, 四次重复。不同基质配我们借鉴有关容器育苗基质研究的方见表1。

成果, 选用当地贮量丰富的泥炭醉2结果与讨论做为基础性基质, 并配以不同的添将不同基质配方培育的苗木、加物, 开展了本项试验。

1 材料和方法

可以看出, 不同基质于2011年及2012年生长季内组合对兴安落叶松容器苗生长的影响存在着显著性差异。进一步从生长性状的多重比较看出, 苗木高和地径生长明显受培养基质中N、P元素有效含量多少的影响。如在N、P含量较高的e号基质中生长的苗木苗高、地径长势最佳或次之, f号处于中庸, 三种大量元素含量均较低的g号生长最差。苗木根系生长受N、P有效含量的影响不如地上部分明显, 而主要是受基质组成成分的影响。本次试验使用的基础性基质为苔辞泥炭, 其干重的90%为有机物, 除含有大量的N、P、K元素外, 还含有较高的腐殖酸 (30%) 。腐殖酸为一种胶体物质, 表面积大, 粘度高, 吸附能力强, 本身具有植物激素的作用, 能吸附大量的无机养分, 但单纯使用泥炭做育苗基质, 总孔隙度低于混有蛙石的基质, 且有较高的饱和含水量 (b号) , 浇水后的一段时间内, 降低基质内部的氧气供应, 影响苗木根部呼吸及生长, 混有一定比例的有机肥后有所改善 (e号) 。f号基质中含有38%的蛙石。

蛙石的层状孔隙以及颗粒间的间隙可贮存大量的水分和养分, 本身还含有镁、锰等微量元素。f号基质虽本身容重仅为0.119 cm, 但混合后的f号基质容重上升为0.129cm3, 增加了对植株根系的固持力。适当的容重和大小孔隙的平衡 (总孔隙度92.12%, 在各组合中最高) , 为苗木的生长创造了良好的墓质条件, 兼有保水透气的双重特性, 故f号内生长的苗木侧根数量多, 根系体积最大, 是一种理想的墓质配方, 今后应适量增加N、P含景.以改善营养条件。另一含有蛙石成份的d号配方, 苗木根系生长表叹的位次较高, 径生长也有所提高。号、h号基质中, 混有一定比例的树皮碎屑或锯末, 与a号相比, 减少了林下表土含量, 物理性状有所改善。从对苗木生长影响上看, 树皮碎屑又优于锯末, 在蛙石非廉价可得的地区, 可用树皮碎屑为代拭品。以林下表土为主的g号基质, 除养分含量较低外, 物理性状也最差, 且比重较大, 不便于运输。

2 结论

2.1 以纯泥炭为基础性基质, 总孔隙度降低, 饱和含水量过大, 不利于苗木根系呼吸, 影响苗木生长。

2.2 以泥炭与蛙石体积比6:4的荃质组合 (f号基质) , 为较理想的基质配方。该配方重量轻, 固持植株性能好, 且具有良好的通透性和保肥性能。

基质培养 篇8

1资料与方法

1. 1实验动物2月龄新西兰大白兔10只,均单独笼养,正常饮水、饮食。无菌条件剖取兔双膝关节,于超净工作台削取全层软骨,绞碎,于37℃ CO2培养箱采用0. 4% 链霉蛋白酶和0. 025% Ⅱ型胶原酶依次酶解消化获取膝关节全层软骨细胞。

1. 2海藻酸钠凝胶立体培养按每毫升生理盐水加入12 mg海藻酸钠干粉搅拌制备海藻酸钠凝胶,0. 22 μm滤网除菌。将上述细胞悬液与海藻酸钠凝胶充分混匀吹打,保持细胞浓度为4 × 106/ m L。制备海藻酸钠凝胶盘,体积50 μL,圆柱状,高度3 mm、直径4. 5 mm,10% 氯化钙溶液浸泡5 min胶化定形,移入力学加载细胞培养板,每孔加原代培养基3 m L,培养条件: 37℃ ,5% CO2,每3天换液1次。

1. 3力学加载及分组采用Flexcell - 5000基底压缩加载系统( 美国,Flexcell公司) 对海藻酸钠凝胶盘立体培养软骨细胞实现精确的周期性压缩应力。本实验分为两组,即实验组和对照组。对照组行静态培养,未施加任何压力; 实验组: 对海藻酸钠凝胶盘进行周期性压缩应力加载,加载条件: 正弦波, 0. 5Hz,20k Pa,1 h / d。于加载第7、14、21天进行相关分析。

1. 4 RT - PCR检测于加载第7、14、21天收集凝胶盘,,加入10% 乙二胺四乙酸二钠溶液,轻微震荡分离获取软骨细胞。Trizol法提取总RNA,使用Prime Script TM RT试剂盒将RNA反转录为c DNA,采用PCR仪将c DNA进行相应引物扩增。引物设计如下: 蛋白聚糖( aggrecan,AGG) : 5' - TCTACCGCTGTGAGGTGATGC - 3' 和5' - TTCACCACGACCTCCAAGG - 3'; Ⅱ 型胶原: 5' - ACACTGCCAACGTCCAGATG 3' 和5' - GTGATGTTCTGGGAGCCCTC - 3'; Ⅹ 型胶原: 5' AGCCAGGGTTGCCAGGACC - 3' 和5' - CCAGGAGCACCATATCCTGT - 3'; 基质金属蛋白酶 - 13 ( matrix metalloproteinase - 13,MMP - 13) : 5' - CACCGGATCTGCCAAGAGA - 3' 和5' - CTGGAGAACGTGATTGGAGTCA - 3'; GAPDH: 5' GAGCCCTTCCACAATGCCAAA - 3' 和5' - GTCGTGGAGTCTACTGGTGTC - 3'。通过计算机软件测量和计算Ct值,计算目的基因相对转录水平[7]。

1. 5统计学处理采用SPSS 13. 0统计软件进行数据分析, 计量资料结果以( ± s) 表示,不同组间比较采用方差分析, 以P < 0. 05为差异有统计学意义。

2结果

与对照组比较,实验组在第7天AGG及Ⅱ型胶原mRNA的表达明显增高( P < 0. 05) ,随加载时间延长,其表达量逐渐下降,在第14、21天两组比较均无明显差异( 见图1) 。与对照组比较,实验组在早期第7天时,Ⅹ型胶原及MMP - 13的表达无明显差异。在第14天时,实验组Ⅹ型胶原及MMP 13 mRNA的表达与对照组比较明显增高( P < 0. 05 ) 。而在第21天时两组之间Ⅹ型胶原及MMP - 13 mRNA的表达无明显差异( 见图2)

3讨论

软骨细胞作为成体组织来源的组织工程软骨种子细胞, 由于软骨组织来源缺乏,体外大量的扩增培养是目前常用的方法之一[8]。但软骨细胞在体外单层扩增培养的方式极易丧失其分化成熟的表型,基质合成能力降低,退变转化为纤维细胞表型[9]。本课题组前期通过微管吸吮力学分析进一步证实,老年和骨关节炎软骨细胞黏弹性力学特性明显降低[10]。且在体外培养扩增过程中,随着传代次数增加,软骨细胞逐渐失去黏弹性蠕变特性,表现为弹性固体特征,且随传代次数增加,软骨细胞杨氏模量和表面张力逐渐增高,细胞质内细胞骨架( cytoskeleton,CSK) 的空间分布、成分及含量发生明显变化,提示CSK在软骨细胞体外培养失分化过程中的作用[11,12]。

大量研究证实,藻酸钠微球等体外三维立体培养可维持软骨细胞的表型,增强软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和糖胺聚糖类的表达[13]。同时,有研究发现,体外立体培养可明显促进骨髓间充质干细胞( bone mesenchymal stem cells,BMSCs) 向软骨细胞的分化[14]。且立体三维培养能使已经去分化的软骨细胞发生重分化,稳定其表型,恢复去分化软骨细胞表达特异性标志物的表达,恢复其超微结构和维持Ⅰ、Ⅱ胶原表达的作用[15,16]。

在日常活动中,人体关节软骨承受着压力、剪切力等多种力学刺激。大量研究证实,力学环境对软骨细胞生长、分化、表型的维持,对组织工程软骨的修复及重建有非常重要的作用[17,18]。本实验对体外海藻酸钠凝胶立体培养软骨细胞施加0. 5Hz、20k Pa的周期性动态压缩应力,根据力学计算,这种压力更加接近于关节软骨正常状态下的生理压力。 通过实验进一步证实,压缩刺激7天后软骨细胞AGG和Ⅱ 型胶原基因表达水平明显上调,这说明了适当力学刺激促进提高了软骨细胞基质合成能力。但随着力学刺激时间的延长,软骨细胞趋于肥大方向分化,主要表现为X型胶原及MMP - 13基因表达的提高。有研究表明,软骨细胞可通过细胞骨架肌动蛋白的解聚,使细胞本身力学和机械敏感性适应周围的力学环境的变化[19]。长时间超负荷的力学加载, 导致细胞骨架的改变,致使软骨细胞肥大适应力学刺激基质合成能力的退变[20]。

基质培养 篇9

1 资料与方法

1.1 实验动物

8~9周龄清洁级昆明小鼠,雌性,体重18~24 g,由广东药学院实验动物中心提供。

1.2 仪器与试剂

IX51倒置荧光 显微镜(OLYMPUS),Hera cell150细胞培养箱(Thremo),超净工作台(苏州净化实验仪器厂),多功能酶标仪(Thremo)。IMDM培养基和胎牛血清购自Hyclone,MTT购自Sigma,SDS购自Amresco。

1.3 骨髓单细胞悬液制备

参考文献[9],脱颈处死小鼠,70%乙醇浸泡5 min,无菌条件下取小鼠股骨,除去股骨上的肌肉组织,眼科剪剪掉股骨两头,暴露骨髓腔,用1 ml IMDM(10% FBS)冲出骨髓细胞,滤网过滤后,300 g,离心5 min,弃上清液,用IMDM(10% FBS)重悬制备骨髓单细胞悬液。

1.4 条件培养基制备

取小鼠骨髓单细胞悬液调细胞密度至1×107个 /ml,后接种细胞培养皿,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,培养24 h,取上清,300 g,离心5 min,上清即为条件培养基[CM-IMDM(10% FBS)],-20℃分装保存。

1.5 细胞生长状态检测

改良MTT法检测细胞数目[10],基质细胞培养7d后,按10∶1(v/v)的比例每孔加入MTT(5 mg/ml),细胞培养箱孵育4 h,直接加入改进的SDS溶液对Formazan进行溶解,24 h后用酶标仪测570 nm OD值。

1.6 骨髓基质细胞培养

取骨髓单细胞悬液接种96孔板,每孔最终接种细胞数目为1×105个 / 孔、3×105个 / 孔、5×105个/ 孔,每种接种密度又分100、150、200μl培养体系组,每组重复5个复孔,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,每隔3.5 d换液,培养7 d后倒置显微镜观察骨髓基质细胞生长状态,MTT法检测细胞数目。

1.7 自分泌检测

取骨髓细胞接种96孔板,每孔接种细胞数目3×105个 / 孔、5×105个 / 孔,每种接种密度又分正常IMDM(10% FBS)和CM-IMDM(10% FBS)组,每组重复5个复孔,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,每隔3.5 d换液,培养7 d后倒置显微镜观察骨髓基质细胞生长状态,MTT法检测细胞数目。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析进行两两比较,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞接种数目对骨髓基质细胞体外生长状态的影响

骨髓基质细胞体外培养7 d后,培养体系100μl组(图1A,D,G),接种1×105个 / 孔的培养孔基本无基质细胞生长,接种3×105个 / 孔细胞的基质细胞贴壁约30%左右,接种5×105个 / 孔细胞的基质细胞贴壁达90%左右。以上结果表明接种细胞密度太低骨髓基质细胞不能在体外生长,5×105个 / 孔组基质细胞生长状态明显好于其他两组,这一方面可能与基质细胞体外培养时相互之间的接触依赖性有关,也有可能与基质细胞接种密度太低造成自身分泌的胞外因子浓度过低有关。

为了进一步研证以上假设,设计同样细胞接种数目,不同培养基体积组来进行实验,如果自身分泌的胞外因子对自身生长影响不大,那么随培养基体积的增多,基质细胞的体外生长状态应不受影响。结果表明3×105个 / 孔体系组 (图1D,E,F;表1),150μl和200μl培养体系孔骨髓基质细胞的贴壁数目明显低于100μl体系孔(P <0.05),而接种细胞数目为5×105个 / 孔时(图1G,H,I;表1),各培养体系组骨髓基质细胞贴壁数目无明显差异。此结果进一步提示骨髓基质细胞在体外培养时自身会分泌胞外因子来促进自身的生长或者贴壁,而当分泌的胞外因子达到一定浓度后促生长作用将达到平台期。

A 、 B 、 C:细胞接种数目 1 × 105个 / 孔;D 、 E 、 F:细胞接种数目 3 × 105个 / 孔;G 、 H 、 I:细胞接种数目 5 × 105个 / 孔;A 、 D 、 G:培养体系是 100 μl;B 、 E 、 H:培养体系是 150 μl;C 、 F 、 I:培养体系是 200 μl

2.2 条件培养基促骨髓基质细胞体外增殖能力

高密度体外培养骨髓基质细胞来制备条件培养基,此培养基与普通培养基的唯一区别在于包含骨髓基质细胞自身分泌的胞外因子。当细胞接种密度为3×105个 / 孔时(图2A,B;表2),条件培养基组与普通培养基组相比能明显促进骨髓基质细胞的生长(P <0.05),而细胞接种数目为5×105个 / 孔时,条件培养基组细胞贴壁数目与普通培养基组无明显差异(图2C,D;表2)。结果表明条件培养基包含有促骨髓基质细胞体外生长所必须的生长因子来促进自身的生长,并且当胞外因子的浓度达到一定浓度后促生长作用达到平台,因此可以利用条件培养基来进行骨髓基质细胞的体外低密度培养。

注:†与 100μl 组相比,P <0.05

(n =5, ± s)

注:†与 IMDM(10%FBS)组相比,P <0.05

A 、 B:细胞接种数目 3 × 105个 / 孔;C 、 D:细胞接种数目 5 × 105个 / 孔;A 、 C:IMDM(10% FBS)培养基;B 、 D:条件培养基

3 讨论

在骨髓造血的过程中,骨髓基质细胞可通过与造血干、祖细胞直接相互通讯、分泌多种正负性造血调控因子和构筑良好的空间微环境来参与造血的调控过程[11,12,13]。为了更好的研究骨髓基质细胞在调控骨髓造血中的作用机理,必须建立骨髓基质细胞的体外培养方法,同时由于骨髓基质细胞是一群复杂细胞,因此在体外培养时必须最大程度上保留基质细胞的组分和其生物学特性。

已有研究表明,骨髓基质细胞体外接种数目太低时不能生长。原因可能是:1骨髓基质细胞体外培养时相互之间的接触依赖性有关,已有研究表明不同基质细胞存在相互依赖的关系[14];2骨髓基质细胞体外培养时自身会分泌一定的胞外因子来促进自身的生长。为了解释基质细胞低密度接种不能生长的原因以及如何做到在体外低密度培养,笔者设计了相同细胞接种数目,不同培养基体积实验组。结果表明当细胞接种数目3×105个 / 孔时,随培养基体积的增大,骨髓基质细胞贴壁数目明显减少,因此可以推测基质细胞体外培养时自分泌的胞外因子对自身在体外的生长起重要作用。当细胞接种数目5×105个 / 孔时,培养基体积对基质细胞贴壁数目和生长状态无影响,推测基质细胞自分泌的胞外因子有一定的饱和效应浓度。具体是何种胞外因子起作用,以及这种胞外因子在动物体内起何种作用还需后续实验验证。

进一步验证上述结论和探讨体外进行骨髓基质细胞低密度培养的方法。首先体外高密度培养骨髓细胞,培养24 h后离心制备条件培养基,后利用条件培养基来培养基质细胞,发现条件培养基与普通培养基相比能够明显促进基质细胞贴壁数目。条件培养基与普通培养基的区别在于条件培养基中含有骨髓基质细胞自身分泌的胞外因子,结果表明:基质细胞自分泌的胞外生长因子对自身的贴壁生长有促进作用。如果要进行体外骨髓基质细胞的低密度培养可以考虑采用条件培养基进行。

基质培养 篇10

该课题通过探讨淫羊藿苷在高糖培养环境下, 于2015年6月—2016年4月在黑龙江省医院实验室8只大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响, 为淫羊藿苷治疗糖尿病引起的骨病提供理论基础并开辟新的思路。

1 实验材料与方法

1.1 材料及设备

1.1.1 材料

取100 g左右3个月健康雄性SD大鼠 (黑龙江省医院动物饲养室提供) 8只, 颈椎脱臼处死。传三代培养, 获得颌骨骨髓基质细胞[4]。

1.1.2 试剂

Super M-MLV反转录酶 (20151221, 0.5mmol/L, 武汉) , 高纯总RNA快速提取试剂盒 (20151221, 0.5 mmol/L, 武汉) , RNase固相清除剂 (20152123, 0.01 mmol/L, 武汉) Powder琼脂糖 (20154211, 0.6 mmol/L, 武汉) 50×TAE2×Power Taq PCR Master Mix (201519876, 0.5 mmol/L, 武汉) 。

1.1.3 仪器

超速冷冻离心机 (湖南湘仪, K1000) , 微量移液器 (BIOHIT, s120) , 真空干燥箱 (SYSBERY, 100) , 紫外分光光度计 (Thermo, p900) , 荧光定量PCR仪 (BIONEER, TR232)

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

正常组 (2%胎牛血清+DMEM培养的细胞) , 高糖组 (2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞) , 淫羊藿苷组1 (2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) , 淫羊藿苷组2 (2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) 每组进行5个复孔平行实验。

1.2.2 总RNA提取

反转录得到c DNA。

1.2.3 实时荧光定量分析

反应体系如下。

用dd H2O补足至20μL

反应条件如下。

该实验利用韩国BIONEER公司生产的Exicycler TM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。

1.2.4 分析方法

RNA提取:按照实验方法中的步骤进行RNA提取, 并利用紫外分光光度计对提取的RNA浓度进行测定。RNA浓度见样本信息表。实时荧光定量分析如下。

(1) 分析方法:本实验分析方法利用2-△△CT方法。

(2) 结果:荧光定量分析仪得到的数据见附表 (本实验每种样本每个基因进行5个复孔平行实验, 实验数据的选取, 是舍去误差较大的数值, 取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据) 。利用2-△△CT方法分析数据见附表。

(3) 统计分析方法:选用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。采取的数值格式为 (Mean±SD) , 以正常组为参照组数值为1, 以上数据统计均经SPSS 13.0软件统计完成, 采取3次独立实验的单因素方差分析 (*表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001) 。

2 结果

2.1 荧光定量检测实验测定结果

BMP2荧光定量结果见图1, OPN荧光宣结果见图2, BSP荧光宣结果见图3。

荧光定量结果显示, 淫羊藿苷组1BMP2、OPN和BSP基因表达明显高于其它组, 淫羊藿苷组2基因表达高于高糖组和正常组, 说明, 淫羊藿苷增强高糖环境下颌骨BMCs的成骨能力。

3 讨论

糖尿病可引发骨代谢异常, 进而导致多种糖尿病骨病 (比如, 骨量下降、骨折率上升等) 。如上文所述, 口腔骨丢失会对患者产生两种重要影响, 其一为牙齿存留, 其二为义齿修复。此外, 糖尿病可引发牙槽骨丧失, 还会导致粘膜损伤, 所以患者往往都对修复治疗无法忍受[5]。当糖尿病患者人数逐渐上升, 而相关医疗水平也日益提升时, 糖尿病治疗亦日趋复杂化。近年来的相关研究表明, 糖尿病与牙周病二者之间存在一种双向调节关系。根据大量科学数据可知, 当人发生急性感染后, 其内分泌状态以及其代谢状态都会发生变化, 因此血糖控制很差, 所以牙周感染会对糖尿病患者造成影响, 使其无法很好地控制血糖[6]。有鉴于此, 糖尿病治疗应注重牙周病的防治, 否则可增加治疗难度。但在现实生活中, 口腔医生对于糖尿病所引发的口腔并发症往往是较为忽视的。此外, 对于糖尿病患者而言, 维护口腔健康是一件十分重要的事情, 假如牙科医生不能充分重视这一点, 那么口腔健康也无法得到保障[7]。不过, 对糖尿病患者口腔疾病的诊疗维护需要有足够的糖尿病知识作后盾, 而口腔科医生在这方面最为欠缺, 这些都是亟待解决的。

淫羊藿苷是中医治疗骨质疏松症最常用的药物之一, 大量临床治疗证明了该药物的效果。作为淫羊藿的精华部分, 淫羊藿苷在近年来被广泛的应用于成骨、破骨细胞的干预研究中[8]。现有的研究成果显示, 淫羊藿苷在临床应用过程中能够有效的促进成骨细胞的发育和增殖。淫羊藿是一种药用植物, 可归入小檗科淫羊藿属的范畴, 是我国医学常用的传统补益中药[9]。根据《本草纲目》可知, 这一味中药有多种功效, 比如祛湿补肾、强心益精、强筋健骨, 等等。在临床上, 这味中药常用于骨折治疗, 以及多种骨代谢相关疾病的治疗, 且具有很不错的疗效。通过相关研究结果可知, 这味中药具有诸多药理活性, 包括提高免疫力、抑制癌症细胞、调节内分泌、提高性腺功能、延缓机体衰老进程、以及对心血管系统产生有益影响等等。这味中药之所以具有如此重要的药用价值, 都归功于其有效活性成分, 也就是一种黄酮类化合物———淫羊藿苷。这种物质是一种结晶粉末, 外观呈淡黄色针状, 很难在水中溶解, 但却能在乙醇中溶解, 也能在乙酸乙酯中溶解[10]。

该实验研究表明, 高糖可以导致大鼠BMCs成骨相关基因表达下降 (包括BMP2, BSP, OPN) 由于成骨相关基因表达和ALP活性是成骨细胞早期分化标记, 细胞钙结节形成是成骨细胞晚期分化标记, 所有实验结果说明高糖抑制了BMCs向成骨细胞的早期和晚期分化, 当在高糖环境下加入淫羊藿苷后, 相关基因表达增强 (包括BMP2, BSP, OPN) , 与马晓妮等人对成骨细胞的分化研究结果一致[11]。

BMP2, OPN, BSP和Runx2作为成骨能力评定指标, 一般在BMCs向成骨细胞分化的过程中, 伴随着全部或者部分的表达升高[12]。通常的研究会选取以上的几个指标作为判定细胞成骨能力及是否向BMC分化的指标。该实验选取了以上这些成骨相关基因, 通过荧光定量的方法检测, 淫羊藿苷组1的BMP2, OPN, BSP和Runx2的表达均明显高于其它组, 淫羊藿苷组2基因表达高于高糖组和正常组, 说明, 淫羊藿苷能增强高糖环境下BMCs的成骨能力, 这与谢晓伟等人研究的干细胞的成骨分化结果一致[13]。

由以上可知, 淫羊藿苷增强高糖环境下颌骨BM Cs的成骨能力。但其具体通路机制还有待于进一步研究。

摘要：目的 探讨淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响。方法 选取2015年6月—2016年4月黑龙江省医院实验室的8只大鼠, 实验分组 (每个基因进行5个复孔平行实验) :正常组 (2%胎牛血清+DMEM培养的细胞) , 高糖组 (2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞) , 淫羊藿苷组1 (2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) , 淫羊藿苷组2 (2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞) , 每组进行5个复孔平行实验。荧光定量测定成骨相关基因BMP2、OPN、BSP基因的表达。结果 淫羊藿苷组1 (1.78±0.10) 与其它组比较:BMP2 (1.37±0.04) 、OPN (1.38±0.09) 、BSP (1.50±0.05) 基因的表达均高于其相应的对照组 (P<0.05) 。结论淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力有加强作用。