基质金属蛋白酶13

基质金属蛋白酶13（精选九篇）

基质金属蛋白酶13 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

300例肺癌患者为2003~2008年在河北医科大学第四医院胸外科住院并经外科手术和病理学确诊的原发性非小细胞肺癌患者。术前没有经过任何抗癌治疗,无职业性致癌因素接触史。病理类型按WHO《肺肿瘤组织学分型》(2000)标准进行分类,其中鳞癌161例,腺癌139例。健康对照来自2004~2008年在河北医科大学第四医院体检的健康成人。肿瘤患者及健康对照个体的性别、年龄、吸烟习惯等情况均在采血后由专人询问获得。最终选取年龄、性别与病例相匹配的300名健康个体作为对照。患者及健康对照均为北方人,彼此无血缘关系。现吸烟或曾吸烟每天5支以上并持续两年或两年以上者定义为吸烟个体。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器

主要试剂为100 bp DNA ladder、Taq DNA聚合酶和引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司购得,限制性内切酶XspⅠ由大连宝生物工程有限公司购得。主要仪器为苏州安泰空气技术公司SW-CJ-2FD型净化工作台,德国Eppendorf公司Mastercycler5333型PCR扩增仪、Eppendorf Research移液器,北京市六一仪器厂DYY-III 28A型电泳槽,美国Anlai公司凝胶成像分析仪Alphalmager 2200。

1.2.2 试验方法

(1)采集每位研究个体的静脉血5m L,经枸橼酸钠抗凝,置4℃冰箱保存,并于采血后1周内提取外周血白细胞DNA。DNA提取采用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法。(2)采用PCR-RFLP方法进行MMPs SNPs基因分型。MMP-13基因启动子区PCR反应体系为20μL,其中模板DNA 100ng,10×PCR缓冲液(Mg2+free)2μL,Mg2+溶液(25mmol/L Mg Cl2)1.2μL,Taq DNA聚合酶2.5 u,d NTPs 0.5μL,MMP-13上游引物(5'-GATACGTTC TTACAGAAGGC-3')、下游引物(5'-GACAAATCAT CTTCATCACC-3')各2 m L。PCR反应条件为:94℃预变性10 min,然后94℃变性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸45 s,35个循环后,72℃继续延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳为445 bp,经限制性内切酶XspⅠ(大连宝生物工程有限公司)于37℃酶切16 h后,进行2%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。A/A基因型存在XspⅠ的识别位点,经酶切后产生244 bp和201 bp两条DNA片段,而G/G基因型缺乏XspⅠ的识别位点仅有一个445 bp的片段,A/G基因型则表现为445 bp、244 bp和201 bp 3条片段(见附图)。为进行基因型检测的质量控制,每一批PCR反应均以灭菌蒸馏水替代模板DNA作为阴性对照,随机挑取10%的DNA标本进行重复实验。

1,7:A/G杂合子;2,5:A/A纯合子;3,6:G/G纯合子;4:阴性对照;8:100 bp DNA marker

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 13.0软件(SPSS Company,Chicago,Illinois,USA)进行统计学分析,P<0.05为差异有显著性。比较各位点基因型频率的观察值与预期值并进行卡方检验行Hardy-Weinberg平衡分析。非小细胞肺癌病例组与健康对照组的基因型、等位基因频率分布比较均采用行×列表卡方检验。单体型频率分析采用EH软件。以非条件Logistic回归法计算经年龄、性别、吸烟状况校正的相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌病例组及健康对照组的一般特征

病例组与健康对照组间性别、年龄构成比均差异无显著性(P>0.05)。病例组中吸烟个体的比例(62.00%)明显高于健康对照组(36.30%)(χ2=39.54,P=0.00),提示吸烟可显著增加非小细胞肺癌的发病风险,经年龄、性别校正后的OR值为3.74(95%CI=2.451~5.705)。见表1。

注:1)卡方检验P值;2)t检验P值;3)年龄及性别调整OR=3.74,95%可信度(CI)=2.451~5.705

2.2 MMP-13基因启动子区-77A/G SNP分布与非小细胞肺癌发病风险的关联分析

MMP-13基因启动子区-77A/G SNP基因型分布在健康对照组中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.86,P>0.05)。MMP-13-77A/G SNP的A等位基因频率在NSCLC病例组为50.33%,显著高于健康对照组的44.33%(χ2=4.332,P=0.037),其基因型频率总体分布在NSCLC病例组与健康对照组之间亦差异有显著性(χ2=8.638,P=0.013),与G/G基因型相比,A/A基因型显著增加肺癌的发病风险,经年龄、性别、吸烟状况校正后的OR值为1.309(95%CI=1.033~1.659)。根据吸烟状况分层分析发现,与G/G基因型相比,A/A基因型有增加吸烟个体NSCLC发病风险的趋势,经年龄、性别校正后的OR值为1.410(95%CI=0.992~2.003)。根据肺癌病理类型进行分层分析发现,A/A、A/G与G/G基因型频率与对照组相比在腺癌中差异有显著性(χ2=10.668,P=0.005),与G/G基因型相比,A/A基因型可以显著增加NSCLC中腺癌的发病风险,经年龄、性别和吸烟状况校正OR值为1.512(95%CI=1.128~2.028)。见表2和3。

注:1)卡方检验P值;2)肺癌组与对照组A等位基因比较

注:1)A/G vs G/G;2)年龄、性别及吸烟状况调整;3)A/A vs G/G;4)年龄与性别调整

3 讨论

MMP-13又称为胶原酶-3,亦是MMP家族的重要成员之一MMP-13存在于多种组织器官中,作用底物广泛,几乎可降解基底膜及细胞外基质的所有成份,参与细胞外基质代谢,在诸多生理过程及病理过程中起着重要的作用[4]。MMP-13的表达增强有利于细胞外基质降解,与多种恶性肿瘤浸润、转移及预后密切相关[5,6,7]。

MMP-13基因定位于人类染色体11q22,包括10个外显子和9个内含子,长12.5 kb。其A-77G单核苷酸多态性为MMP-13启动子区转录起始点上游77 bp处核苷酸出现的G→A改变。本研究结果显示:MMP-13 A-77G SNP的A/A、A/G、G/G基因型频率分别为18.30%、52.00%和29.70%;与PA-TRICIA等[8]报道的西班牙人群的分布频率(52.40%、39.40%和8.20%)不同(χ2=116.14,P<0.001),这提示MMP-13基因多态性在人群中的分布可能存在地域、种族差异。

目前发现MMP-13启动子区转录起始点上游77 bp处存在A/G多态,而体外实验表明此处的SNP可改变该基因的转录活性,即A等位基因的启动子活性大约是G等位基因的两倍[9]。这些多态可能影响某些肿瘤的遗传易感性,增加个体的肿瘤发病风险。张晓娟等[10]报道MMP-13基因A-77G SNP可能与河北省磁、涉县人群的食管癌、贲门癌发病风险无关;但A/G基因型对吸烟人群的GCA发病可能具有防护作用。HSU等[11]应用Western blot方法检测了肺癌组织中MMP-13蛋白的表达,认为MMP-13表达可能与肺癌骨转移相关,为肺癌预后不良的独立因子。本研究结果表明:MMP-13启动子区A-77G SNP的基因型频率总体分布在NSCLC病例组与健康对照组之间有显著性差异(χ2=8.638,P=0.013)。与G/G基因型相比,A/A基因型显著增加肺癌的发病风险,经年龄、性别、吸烟状况校正后的OR值为1.309(95%CI=1.033~1.659)。这与LI等[12]关于MMP-13-77A/G的A/A基因型与中国妇女的卵巢上皮细胞癌有关的研究结果一致。但是,PA-TRICIA研究结果表明西班牙人群中MMP13-77A/G SNP与肺癌的发病风险无关。

本组资料显示,非小细胞肺癌病例组吸烟个体比例明显高于健康对照组(χ2=39.5,P<0.001),吸烟可以使个体患非小细胞肺癌的风险增加3.74倍。(经年龄、性别校正后的OR=3.74,95%CI=2.451~5.705)。本研究以吸烟状况对非小细胞肺癌病例组和健康对照组进行了分层分析。分析后发现:在吸烟组中,与MMP-13-77A/G多态位点的G/G基因型相比,A/A基因型有增加吸烟个体NSCLC发病风险的趋势,经性别、年龄校正后的OR值为1.410(95%CI=0.992~2.003)。此结果表明,吸烟与MMP-13-77A/G多态可能有协同作用共同影响非小细胞肺癌发病风险。

为了进一步明确MMP-13-77A/G多态性和非小细胞肺癌各病理类型之间是否相关,本研究按病理类型进行了分层分析。分层后的结果显示:MMP-13-77A/G多态与肺腺癌的发病风险相关(χ2=10.668,P=0.005),而与肺鳞癌的发病风险无关(χ2=3.091,P=0.213)。与G/G基因型相比,A/A基因型可以显著增加NSCLC中腺癌的发病风险,经年龄、性别和吸烟状况校正OR值为1.512(95%CI=1.128~2.028)。这可能反映了肺腺癌和肺鳞癌之间病因学的差异。但是分层后的病例数相对较少,有待增加病例数进一步研究证实。

摘要：目的 探讨基质金属蛋白酶13基因(MMP-13)启动子区-77bp A/G单核苷酸多态性(SNP)与我国北方人非小细胞肺癌(NSCLC)遗传易感性的关系。方法 采用基于医院的病例-对照研究方法,收集300例非小细胞肺癌患者(其中鳞癌161例,腺癌139例)和300例健康对照个体的静脉抗凝血5 mL,以蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法对MMP-13-77A/G SNP进行基因分型,比较NSCLC病例组与健康对照组之间等位基因及基因型分布。结果NSCLC病例组中吸烟个体的比例(62.00%)明显高于健康对照组(36.30%)(χ2=39.54,P=0.00),经年龄、性别校正后的OR值为3.74(95%CI=2.4515.705)。健康对照组中的MMP-13基因启动子区转录起始点上游77bp处A/G SNP的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。MMP-13基因-77A/G多态性位点的A等位基因频率在病例组为50.33%,显著高于健康对照组的44.33%(χ2=4.332,P<0.05)。MMP-13基因-77A/G SNP基因型分布在NSCLC病例组和健康对照组之间亦有显著性差异(χ2=8.638,P<0.05)。与G/G基因型相比,A/A基因型能显著增加NSCLC的发病风险,(OR=1.309,95%CI=1.0331.659)。根据NSCLC病理类型进行分层分析发现MMP-13基因-77A/G SNP与肺腺癌的发病风险相关;与G/G基因型相比,A/A基因型能够显著增加肺腺癌的发病风险,经年龄、性别和个体吸烟状况校正后的OR值为1.512(95%CI=1.1282.028)。结论 吸烟可以显著增加NSCLC的发病风险。MMP-13基因SNP与NSCLC的发病风险相关,与G/G基因型相比,A/A基因型可显著增加NSCLC尤其是肺腺癌的发病风险。

关键词：非小细胞肺癌,基质金属蛋白酶基因,多态性,单核苷酸,易感性

参考文献

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基质金属蛋白酶13 篇2

目的 研究急性β射线皮肤损伤创面愈合过程中基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA和蛋白表达的变化,探讨表皮细胞生长因子(EGF)在急性β射线皮肤损伤创面愈合过程中的作用.方法 雄性SD大鼠60只,随机均分为3组.A组:15Gy β射线照射组;B组:45Gy β射线照射EGF治疗组;C组:45Gy β射线照射生理盐水对照组.采用直线加速器产生的.β射线照射大鼠臀部皮肤,面积20mm×40 mm.观察创面出现及愈合的时间;光镜观查创面愈合过程中组织学改变;以RT-PCR法和Western blot法检测创面愈合过程中MMP-2 mRNA和蛋白表达的变化.结果 A组未形成创面,B组和C组出现深Ⅱ度烧伤创面.B组创面愈合速度明显比C组快(P<0.05).A组5、6、8周时MMP-2的表达逐步减弱,B组和C组5、6、8、10周时MMP-2的表达由强到弱,而后由弱到强;B组在6、8周时MMP-2的表达均高于C组.结论 EGF在β射线皮肤损伤创面愈合过程中起重要作用,EGF可促进MMP-2的表达与合成,从而促进创面愈合.

作 者：沈国良 陆兴安 唐俊 王修珍 吴士良 田野 作者单位：沈国良,陆兴安,唐俊(215006,苏州大学附属第一医院烧伤整形外科)

王修珍,吴士良,田野(苏州大学基础医学部)

浅谈基质金属蛋白酶与眼部疾病 篇3

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类金属依赖的水解酶家族，是细胞外基质(extracelluarmatrix，ECM)降解的主要介质，其主要功能是降解细胞外基质，在细胞迁移、组织重建和修复等病理生理过程中发挥作用。MMPs的蛋白水解活性主要靠与其抑制剂(tissueinhibitor ofMMPs，TIMPs)之间平衡来调节。

关键词白酶明胶酶分泌调节

一、MMPs与TIMPs家族及分类

自20世纪80年代初以来，人们对MMPs酶类研究后已发现MMPs至少有20多种，按照这些酶的基本结构和主要作用底物的不同共分为五类，第一类胶原酶：间质胶原酶(MMP—1)、多形核细胞胶原酶(MMP—8)、胶原酶3，4(MMP—13，MMP—18)，其主要作用底物为纤维性胶原；第二类明胶酶：明胶酶—A(MMP—2)、明胶酶—B(MMP—9)，其主要作用底物为明胶、Ⅳ 、V型胶原和纤连蛋白等；第三类间质溶素：间质溶素1，2，3(MMP—3，MMP—10，MMP—11)和基质溶素(MMP—7)，主要水解层粘蛋白、非纤维性胶原和纤连蛋白；第四类膜型金属蛋白酶：膜型金属蛋白酶—1，2，3，4(MT—MMP1，2，3，4)，主要水解底物为MMP—2前体、胶原和明胶；其他类：MMP—12、MMP—4，5，6等，其水解底物亦相当广泛。MMPs是以酶原形式分泌的，一旦全部被激活，几乎可以降解所有的细胞外基质，因而在体内严格控制MMPs的活性显得尤为重要。MMPs的天然抑制剂主要是基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)，TIMPs家族主要有TIMP—1，2，3，4。其中TIMP—1是MMP—9的特异性抑制因子，TIMP—2是MMP—2的特异性抑制因子，TIMP—3的表达则不仅受到细胞有丝分裂的诱导，同时也受细胞周期的调节。研究表明，TIMP—4与TIMP—1在蛋白结构上有37%的同源性，而与TIMP—2，3则有51%的同源性。在实验条件下，TIMP—1和TIMP—2可抑制肿瘤生长、浸润和转移。 因此TIMPs在其功能上有着许多共同点，同时也有一些不同的特点，近来也有其他MMPs抑制剂不同于TIMPs的报道，但进一步研究表明这些抑制因子多是已知TIMPs的变异型。

二、TIMPs的表达调节

MMPs的活性在多种不同的水平上受到调节，包括：(1)转录水平调节：信号系统中所有成分均可通过MMPs基因调控序列中的转录因子影响其表达变化，其中最重要的是蛋白激酶／C。转录因子NF—kB、AP—1、SP—1、Egr—1等在某些MMPs基因启动子上有其特异性结合位点，当细胞外信号激活这些转录因子后即可诱导MMPs的表达；(2)酶原活化调节：在合成之后，MMPs以酶原的形式分泌到细胞间质。其活性的封闭是由于在锌离子活性中心附近结合有该MMPs前肽链内所含的一个半胱氨酸，后者阻断了活性中心与底物结合。MMPs的激活是将其前肽区劈开，使半胱氨酸与锌离子分离，从而暴露出锌离子活性中心。血浆纤溶素和间质溶解素是MMPs生理性激活因子。血浆纤溶酶由血浆纤溶酶原在尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)或组织型纤溶酶原激活物(tPA)作用下激活。因此，丝氨酸蛋白酶在MMPs活化中起决定性作用；(3)TIMPs：特异性地抑制MMPs活性。TIMPs不是前酶，不需活化。

三、基质金属蛋白酶及其抑制剂与眼部疾病

长期角膜上皮细胞损伤可引起角膜基质溃疡形成。近些年来，国内外很多学者在MMP—1及TIMP—1的研究上取得了一定的进展。1969年Brown SI等提出碱烧伤后角膜溃疡很大程度上是蛋白水解酶降解角膜细胞外基质的结果。此后BennanMB (1980)、Burns FR (1989)等也相继发现MMP—1可能与角膜溃疡的发生发展有着密切关系。另有研究表明，纤溶酶原／纤溶酶系统(PA／Plasmin)也参与了碱烧伤后持续性上皮缺损和基质溃疡的发生，在调整MMP—1的合成，分泌及活化过程中起到重要的作用。1995年，Kigasawo K等对于MMP—1的来源作出进一步的研究后认为：MMP—1主要来源于多形核自细胞(PMNs)，PMNs的破坏作用被认为是碱烧伤后溃疡形成和发展的主要原因 。此外，MMPS也可来源于M，纤维母细胞及角膜本身的细胞成分。Paterson(1994)等通过观察TIMP—1对家兔角膜碱烧伤的疗效发现接受TIMP—1治疗的碱烧伤角膜，溃疡的发生发展比单独应用赋形剂治疗者要明显减轻。

参考文献

基质金属蛋白酶13 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选择健康3月龄雌性SD大鼠30只,体重(210±32)g(河北联合大学实验动物中心,Ⅱ级)。按体重随机分为三组,每组10只,其中,基础对照(BL)组,实验前处死大鼠取标本;去卵巢手术(OVX)组采用10 m L/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,在无菌条件下大鼠行背部入路双侧卵巢切除手术;假手术(sham)组大鼠暴露卵巢但不切除。术后3 d每日1次肌注青霉素20万单位/只,所有大鼠在同等条件下饲养,喂养12周后脱颈椎处死,处死前第10天和第4天分别皮下注射盐酸四环素(30 mg/kg)和钙黄绿素(6 mg/kg)。

1.2 标本处理

分别按“1.1”中时段对动物进行脱颈椎处死,切开大鼠背部皮肤,锐刀分离所有的软组织,切除棘突、横突等附件组织,切取L2椎体,用低速锯在近端作矢状面剖开骨髓腔,置于10%福尔马林中性缓冲液中准备硬组织切片,L4~5椎体及椎间盘置于10%福尔马林中性缓冲液中准备行HE常规染色、特殊染色及免疫组化。

1.3 硬组织切片制作

将刀片和标本块用40%的酒精适当浸润,碳化钨钢刀控制切片速度,用软毛刷和把针将切片放置载玻片展平,用75%酒精将载玻片适当湿润,放置塑料薄膜,酒精纸吸干多余的酒精,推压切片使之进一步平整、贴附,加盖一张载玻片保护首片,置于40℃~50℃烤箱中过夜,次日晨取出,荧光标记切片避光保存,每个标本切3张片,其中,两张进行Von Kossa、Gemisa染色,另一张行荧光指标测量,并采用Leica Dmlb2荧光/光学显微镜及Leica DC300数码摄像系统进行观察并摄取图像。

1.4 VG特殊染色方法

组织常规脱蜡至水,采用Weiger铁苏木素染液染5~10 min,稍水洗,1%盐酸酒精迅速分化,流水冲洗数分钟;Van Gieson染液染1~2 min,倾去染液直接用95%的酒精急速分化数秒,无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

1.5 椎间盘退变程度评分

根据Wang等[1]的评分方法对大鼠的退变椎间盘进行评分。见表1。

1.6 骨密度测量

①应用Norland-XR36双能X线骨密度测量仪(DEXA,美国),采用小物体扫描模式,准确度为0.01%,扫描速度为60 mm/s,分辨率(resolution)为1.0 mm×1.0 mm,扫描宽度为5.0 cm的参数值,进行L2~4腰椎整体骨密度的测量。②为了评价精确度,随机选取1例,在位置不变的情况下,连续测量t BMD 5次。③精确度用变异系数(CV)表示。

1.7 统计学方法

实验数据建立EXCEL数据库,采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差表示,各组数据经过Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐次检验后,利用单因素方差分析(ANOVA)和t检验比较各组之间的差异,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组大鼠骨密度比较

骨密度测量的CV值为0.51%,这与Wang等[1]测量的精确度基本一致。OVX组较sham组骨密度显著下降(P<0.05)。见表2。

注:与sham组比较,aP<0.05

2.2 骨形态计量学比较

与sham组相比,OVX组大鼠的静态骨形态学的骨量指标显著性下降(BV/TV和Tb.N),而骨小梁分离度(Tb.Sp)和反映破骨细胞指标的Oc.No/BV和Oc.Pm/BS显著性提高(表3);反映矿化骨表面(MS/BS)和骨形成率(MAR,BFR/BS和BFR/BV)的动态指标,OVX组明显高于sham组(表4)。

2.3 组织学表现和椎间盘组织学评分

BL组软骨细胞分层排列清晰,关节软骨终板由多层成熟软骨细胞组成的透明软骨,胞质丰富,髓核由大量细胞核清晰的脊索细胞组成,主要集中在髓核中部,纤维环胶原纤维排列规则,内层纤维环较薄。sham组软骨细胞排列规则,与椎体相邻部有大量软骨组织舌样突出,关节软骨终板透明,组织结构清晰,细胞排列有序,软骨陷窝存在,与继发性骨化中心相连的透明软骨钙化,潮标清晰可见,虽然较BL组出现软骨下骨班板增厚和部分软骨终板骨化,但软骨终板内分布有大量粗大的血管,髓核内脊髓细胞呈羽毛状或团块样分布,细胞形态完整,纤维环内层纤维软骨较BL组有显著的增生变厚,外层纤维环胶原纤维排列规则。OVX组关节软骨终板成熟软骨细胞变性坏死,数量较对照组减少,细胞排列紊乱,关节软骨终板厚度变薄,在软骨终板和髓核之间的过渡区内的软骨细胞被纤维环内层增生的纤维软骨细胞所代替,基质内出现大量排列的胶原纤维,在靠近次级骨化中心的关节软骨基底层出现大量增生活跃的小软骨细胞,次级骨化中心增生并向终板中央侵入,使透明软骨终板面积减少,骨化增加,增厚的骨板血管腔明显减少,与之毗邻的髓核脊索细胞明显减少,被软骨样细胞取代或发生黏液样变。

sham组、OVX组椎间盘组织学评分较BL组显著性提高(P<0.05),OVX组的评分较sham组提高,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

2.4 MMP-13、IL-1蛋白表达情况

光镜下观察显示,MMP-13蛋白的表达在胞浆,呈棕黄色颗粒状,OVX组的表达明显高于sham组和BL组(P<0.05),sham表达组高于BL组,但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化平均灰度值结果,见表6。

注:与sham组比较,aP<0.05

注:与sham组比较,aP<0.05

注:与BL组比较,aP<0.05;bP<0.05

注:与sham组比较,aP<0.05

3 讨论

3.1 雌激素与椎间盘退变

多项研究证实,雌激素缺乏使破骨细胞的功能处于活跃状态,破骨增强,成骨细胞的功能由于缺乏雌激素的刺激处于部分抑制状态,导致骨代谢转换率增加,由此带来骨的分解代谢,使骨小梁变薄变细,其结果为骨组织减少,引起骨质疏松。雌激素可抑制由成骨细胞产生IL-1、TNF-α、IL-6等炎性因子对破骨细胞的增殖、分化和活化[2]。在失去雌激素的作用后,软骨骨基质成分减少,软骨细胞合成Ⅱ型胶原的能力下降,整个软骨层产生退变现象。同时破骨细胞大量生成,吞噬软骨下骨,使骨小梁变细,排列紊乱,使骨的强度下降。钙化软骨层出现破骨细胞,可能是加速软骨退变的主要因素之一[3]。OVX大鼠由于骨量丢失,椎间盘应力发生变化,从而导致椎间盘退化。

本研究结果表明:OVX组SD大鼠的子宫体和子宫角较sham组明显萎缩,发育不全;大鼠腰椎骨密度的变化显示,OVX组椎体骨量下降,成功复制了卵巢切除大鼠骨质疏松动物模型,并验证卵巢切除大鼠的骨量丢失是由于雌激素缺乏导致骨形成和骨吸收均明显增加,但破骨细胞活力增强,导致骨吸收大于骨形成,使骨量丢失。本研究发现:OVX组大鼠腰椎间盘发生严重退变,表现在椎间盘髓核脊索细胞数量减少,出现软骨样细胞,髓核黏液变,裂隙生成,软骨终板变薄,软骨细胞数量减少、钙化,甚至完全骨化,纤维环后部结构排列紊乱,厚度变薄,间隙增宽,椎体边缘骨赘增生,椎间盘组织学评分提高。

3.2 MMP-13、IL-1与椎间盘退变

MMP-13主要来源于软骨细胞,主要降解Ⅱ型胶原。虽然都是胶原酶,但是MMP-13对Ⅱ型胶原的催化效率大概是MMP-1对Ⅱ型胶原催化效率的5倍。MMP-13在退变椎间盘中的表达增强机制目前还不清楚,但是一系列的研究结果提示,MMP-13在椎间盘中的表达受到多方面因素的调节。以前的研究己经证明应力负荷可以诱发椎间盘退变,而最近的很多研究提示应力负荷可能与椎间盘退变中MMP-13的表达增强有关。MMP-13与椎间盘内的其他作用也可能具有协同效应,产生放大作用。有实验证实在人的正常椎间盘内存在MMP-2、MMP-3的表达,而且在退变椎间盘中MMP-2、MMP-3的表达更为明显。而MMP-2、MMP-3可以提高MMP-13的活性,因此,它们之间可能具有一定的协同作用。国外学者在动物及人体实验中发现,退变椎间盘的MMP-13阳性率明显较正常椎间盘高[4,5]。正是因为MMP-13对软骨细胞的Ⅱ型胶原有重要的降解作用,所以研究其在椎间盘退变中的表达可能具有重要意义。本实验结果有力地支持了这一设想。本实验结果表明:退变腰椎间盘中MMP-13的蛋白表达较对照组明显增强,说明MMP-13在腰椎间盘退变中具有重要调节作用。

IL-1是炎症反应的关键酶,可促进前列腺素、白三烯、血栓素、血小板活化因子等重要炎性介质的分泌,另外以通过酶解细胞膜磷脂,可直接造成细胞膜损害。IL-1可促进体外培养的椎间盘细胞产生PGE2且呈一定程度的剂量依赖关系,后者被认为在疼痛产生中起到相当重要的作用。另外IL-1又可影响基质中的蛋白多糖的代谢,小剂量的IL-1对软骨基质中的蛋白多糖的合成具有抑制作用,而较大剂量对蛋白多糖的降解具有刺激作用。Shinmei等[6]用免疫组化方法观察到退行性骨关节病患者软骨IL-1染色为阳性反应。本实验结果也显示,OVX大鼠椎间盘组织中IL-1表达高于其他组。

MMP-13、IL-1在退变椎间盘中表达增强的机制目前还不清楚,在椎间盘退变过程中,MMP-13、IL-1分别起到了重要的作用,很多研究也证实了MMP-13、IL-1是椎间盘基质分解的重要因子,MAPKs家族中的P38和NF-κB在MMPs合成过程中发挥重要作用,并可能在椎间盘退变病程中发挥重要作用,证实椎间盘退变可能为细胞因子的减少和致炎因子增多导致MMPS活性增加,加剧细胞退变。IL-1是MMP-13的有效诱导剂,IL-1使处理过的椎间盘细胞中MMP-13的基因表达增强,Ⅱ型胶原基因表达下降[7]。

综上所述,本实验证实了MMP-13、IL-1表达的增加是椎间盘退变的重要因素,为临床治疗提供了理论依据,但具体的信号传导途径还有待于进一步研究。

摘要：目的 探讨基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、白细胞介素-1(IL-1)在去势大鼠退变腰椎间盘组织中的表达及临床意义。方法 将30只3月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为基础对照组(BL组)、去卵巢手术组(OVX组)、假手术组(sham组),每组各10只;BL组在手术开始前处死大鼠,其余两组术后3个月处死大鼠,并与处死前10 d和4 d分别给予显色双荧光标记;L24椎体进行骨密度及硬组织切片分析,L45进行HE常规染色、VG特殊染色及免疫组化检测MMP-13、IL-1的表达,观察椎间盘的病理学改变并据评分标准对腰椎间盘的退变程度(LVD)进行评分。结果 大鼠腰椎骨量的下降及椎间盘的退化,OVX组较Sham组严重(P<0.05);免疫组化结果显示,OVX组与sham组比较,大鼠椎间盘中MMP-13、IL-1表达明显升高(P<0.05)。结论 MMP-13、IL-1表达量的增加是腰椎间盘退变形成和发展的重要因素。

关键词：椎间盘退变,免疫组化,基质金属蛋白酶-13,白细胞介素-1

参考文献

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[3]Szuwart T,Kierdof H,Kierdof U,et al.Histochemical and ultrastructuralstudies of cartilage resorption and acid phosphatase activity duringantler growth in fallow deer[J].Anat Rec,2002,268:66-72.

[4]Anderson DG,Izzo MW,Hall DJ,et al.Comptsaration gene expressionprofiling of normal and degenerative discs:analysis of a rabbit annularlaceration model[J].Spine,2002,27:1291-1296.

[5]Roberts S,Caterson B,Menage J,et al.Matrix metalloproteinases and ag-grecanase:their role in disorders of the human intervertebral disc[J].Spine,2000,25:3005-3013.

[6]Shinmei M,Masuda K,Kikuchi T,et al.Production of cytokins by chon-drocytes and its role in proteoglycan degradation[J].Rheumato(Suppl),1991,27:89-91.

基质金属蛋白酶13 篇5

1材料与方法

1.1材料

Wistar大白鼠由中国医科大学实验动物中心提供,导管2 F Fogarty购自美国Baxter health corpo- ration,OPN兔抗大鼠多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology USA,MMP-2、MMP-14兔抗大鼠多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司,总RT- PCR提取试剂盒、RT-PCR逆转录试剂盒、RT-PCR引物购自大连宝生物工程有限公司,根据Gene Bank信息,确定大鼠OPN c DNA序列(NM_012881),合成3对可能有效的OPN-si RNA(委托广州锐博生物科技有限公司合成)。通过笔者之前的研究[8],应用实时RT-PCR检测OPN-m RNA的表达水平,选择其中沉默效果最好的si RNA序列-Si-r-OPN_002, 进行动物实验。正向引物:(5'-3')5'-GGAUGAAUC UGACGAAUCUDTDT-3';反向引物:(3'-5')3'-DTDT CCUACUUAGACUGCUUAGA-5'。

1.2方法

1.2.1实验分组72只Wistar大白鼠随机分为4组, 每组18只。1假手术组:分离出左颈总动脉后,不作球囊拉伤处理;2聚醚对照组:左颈总动脉球囊拉伤后,30%的聚醚(pluronic)200μl凝胶溶液注射于颈动脉损伤部位周围;3OPN-SCR-si RNA对照组:左颈总动脉球囊拉伤后,含OPN-scramble-si R- NA 15μg的30%聚醚胶(pluronic gel)的200μl溶液注射于颈动脉损伤部位周围;4OPN-si RNA-002治疗组:左颈总动脉球囊拉伤后,含OPN-si RNA- 002 15μg的30% pluronic gel的200μl溶液注射于颈动脉损伤部位周围。

1.2.2大鼠颈动脉损伤模型的建立Wistar大鼠, 体重350~400 g,10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后, 颈正中切开,钝性分离左颈总动脉,用血管夹临时阻断左颈总动脉近心、远心端血流,应用2 F Fogarty球囊导管从颈外动脉插入左颈总动脉内,注入生理盐水,反复全程抽拉球囊,重复3次,造成左颈总动脉内膜损伤。术后结扎颈外动脉,恢复血流。分别于术后的不同的实验终点分批处死动物。取出左颈总动脉,分别置于4%多聚甲醛和液氮中,用于HE染色、 免疫组织化学、Western blot及实时RT-PCR检测。

1.2.3在体OPN-si RNA转染左颈总动脉球囊拉伤后,结扎颈外动脉,将200μl转染复合物(含有Cy3-OPN-SCR-si RNA 15μg的30% pluronic gel溶液)注射于颈动脉损伤部位周围,缝合颈部创口。转染72 h后,即取大鼠损伤段局部血管,放入液氮罐中,制成冷冻切片(片厚5μm),避光置于荧光显微镜下。

1.2.4血管病理形态学检测病变血管标本经石蜡包埋后,从每段血管的横截面随机切下3张切片后, 利用HE染色在光学显微镜下观察其内膜增生情况,并利用计算机图像分析系统,检测血管内膜、中膜厚度的改变,计算内膜/ 中膜(I/M)的面积比。

1.2.5免疫组织化学检查将颈总动脉制成4μm的切片,采用SABC法进行免疫组织化学染色,加DAB显色,苏木素复染。以胞浆见棕黄色颗粒为阳性, 一组切片标本用PBS代替一抗作为空白对照组。

1.2.6实时RT-PCR法检测血管壁组织的OPN、 MMP-2和MMP-14 m RNA表达采用Trizol一步法提取颈总动脉的总RNA。取各组总RNA 3μl逆转录合成c DNA,逆转录反应根据逆转录试剂盒要求的标准进行,反应总体积为20μl,反应条件为37℃、15 min,85℃、5 s,4℃、7 min。应用ABI 7500扩增仪进行PCR扩增反应,20μl反应体系组成如下:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)10μl,PCR正向引物(10μmol)0.8μl,PCR反向引物(10μmol)0.8μl, ROX Reference DyeⅡ 0.4μl,c DNA模板2μl,d H2O 6μl。反应条件为:95℃活化30 s,95℃变性5 s,然后60℃退火和延展30 s,共40个循环。引物序列和扩增产物长度见表1。β- 肌动蛋白作为参考。按2-△△（T）法计算目的基因相对于对照基因的表达量[9]。 实验重复3次,取均值。

1.2.7Western blot法检测血管壁组织的OPN、 MMP-2和MMP-14的蛋白表达提取各组动脉总蛋白后,并将蛋白浓度调至同一水平,每孔加样80μg,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,脱脂奶粉封闭2 h,分别加入一抗OPN(1∶400)、MMP-2(1∶ 400)和MMP-14(1∶400),4℃孵育过夜。洗膜3次, 加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育,显色2~5 min, 凝胶成像分析系统测定条带的平均积分光密度值。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,运用方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1在体OPN-si RNA转染效果观察

转染Cy3标记的SCR-si RNA 72 h后,将转染局部血管制成5μm厚的冷冻切片置于荧光显微镜下,可以发现,残存血管外膜下、中膜及内膜下均有红色荧光分布,以中膜最为明显,说明转染效果满意(见图1)。

2.2血管病理形态学检测结果

假手术组的血管内膜光滑、完整;而在球囊损伤并且给予30% Pluronic gel的对照组和转染OPN- SCR-si RNA对照组14 d,其内弹力板消失,内膜明显增生。转染OPN-si RNA-002与同一时间点对照组相比,内膜增生受到显著抑制,差异有统计学意义(P <0.001)。各组血管新生内膜与中膜面积比见图2和表2。

2.3免疫组织化学染色结果

假手术组血管壁内膜和中膜胞浆内见微弱黄色颗粒,而血管球囊损伤后3、7及14 d,均出现棕黄色颗粒,主要分布于中膜及增厚的内膜的细胞浆及细胞外基质中,MMP-14第3天最强,MMP-2第7天最强;OPN第14天最强。OPN-si RNA-002治疗组在各个时间点的中膜和内膜亦出现棕黄色颗粒,但较两对照组明显减轻(P <0.01)。见图3。

注:I为新生内膜面积,M为中膜面积,I/M为内膜面积与中膜面积比值。1)与假手术组比较,P <0.01;2)与两对照组比较,P <0.01

2.4实时RT-PCR检测

在假手术组,OPN、MMP-2、MMP-14 m RNA仅微弱表达;血管球囊损伤后,OPN、MMP-2、MMP-14 m RNA表达明显升高;MMP-14 m RNA第3天达高峰,第14天时恢复正常水平;MMP-2 m RNA表达第7天达高峰,OPN m RNA表达第14天达高峰。经OPN-si RNA治疗后,同一时间点OPN、MMP-2、 MMP-14 m RNA表达明显减少(见图4),与SCR-si RNA转染及聚醚对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.5 Western blot检测

在假手术组,OPN、MMP-2、MMP-14有微弱的蛋白条带表达;然而,血管球囊损伤后3、7及14天后,OPN、MMP-2、MMP-14蛋白条带灰度逐渐增加, MMP-14第3天最明显,MMP-2第7天最明显, OPN第14天最明显。经OPN si RNA治疗后,同一时间点OPN、MMP-2、MMP-14表达明显减少(见图5), 与OPN-SCR-si RNA转染及聚醚对照组比较差异有统计学意义(P <0.001)见表3。

注:1)与假手术组比较,P <0.01;2)与两对照组比较,P <0.01

3讨论

EMC是血管损伤后新生内膜的主要成分,在PTCA后发生RS的新生内膜中,EMC的含量超过50%[10],因此,EMC是血管再塑形的主要元素,也是形成RS的主要物质。研究发现,许多参与经皮冠状动脉介入治疗(percataneous coronary intervention, PCI) 术后RS的细胞因子都能够刺激VSMC过度表达OPN[11,12]。应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖[13]。前期的研究也证明,使用针对大鼠OPN的反义核苷酸抑制OPN的表达后,可明显抑制VSMC的增殖[14],均表明以OPN为靶点在防治RS发生方面的重要作用。

鉴于si RNA转染过程中容易受核酸的消化作用的影响,半衰期较短,研究人员对si RNA进行甲基化修饰,使其在细胞核内长期稳定存在。转染途径的选择是决定si RNA效果的另一重要因素,血管壁基因转移可经血管腔内和血管外膜两种途经。本研究受到WANG等[15]在血管外膜成功转染si RNA- ADAMTS-7方法的启示,探讨血管损伤后,经血管外膜转染OPN-si RNA抑制血管内膜增生的作用。为了证实经血管外膜的转染效果,本研究应用Cy3- SCR-si RNA,于损伤和转染后第3天,取出局部血管并制成冰冻切片,可以发现,残存血管外膜下、中膜及内膜下均有红色荧光分布,以中膜最为明显,说明转染效果满意。实验结果也表明,转染后第7天,不仅OPN的m RNA和蛋白表达水平与对照组相比出现了明显的下调,而且其内膜增生的程度也被明显地抑制,而且这种抑制作用一直持续到实验结束的第14天。

NAGASE[16]认为MMP-2在细胞的迁移中起到关键作用,MMP-14、MMP-2酶原、TIMP-2在细胞表面形成三元络合物,调节MMP-2的激活,降解ECM, 促进细胞迁移。ECM,尤其是基底膜,是VSMC迁徙必需战胜的生理屏障,其合成及降解失衡并沉积于动脉壁是AS、RS等病变加重的一个关键环节[17]。 ECM合成及降解,以及平滑肌的迁移、增生都取决于MMPs和其组织抑制剂TIMPs之间的动态平衡[18]。 MMPs由VSMC、巨噬细胞及其他一些细胞产生,是降解VSMC基底膜基质的主要酶类,导致血管VSMC由中膜向内膜迁移并增生,进一步分泌大量ECM,从而促进内膜增生、血管重构,最终导致RS的发生[19]。抑制MMPs活性可能降低RS的程度,其中尤以MMP-2最为重要,KUZUYA等[20]用MMP-2基因敲除小鼠进行实验,在动脉损伤模型中发现内膜增生程度比野生型小鼠明显减轻,VSM迁移能力显著下降。MMP-14是一类特殊的蛋白酶,研究认为其以无活性的MMP-2为作用底物,将其氮端剪切掉, 成为中间活化状态,进而转变成完全活化的MMP-2, 参与其酶原的激活反应;由于分布在细胞表面,人们认为其在细胞迁移中的作用更为重要[21,22]。

本研究表明,血管内膜损伤后MMP-14和MMP-2表达增加,MMP-14在第3天达高峰, MMP-2在第7天达高峰,经OPN-si RNA-002治疗后表达相应减少。考虑可能OPN-si RNA-002阻断下游细胞迁移相关基因MMP-14转录激活,从而也间接抑制了MMP-14激活MMP-2促进细胞迁移的作用。这与先前的一项体外研究应用OPN刺激VSMC的增生可以提高MMPs的活性一致[23]。而且另一项体外研究也显示,OPN刺激MMP-2的激活是通过NF-κB介导的MMP-14的诱导产生,OPN诱导MMP-2生成在转录水平得到调控[24]。这些都支持OPN在血管再狭窄的发生中扮演着主角作用。

总之,此次研究成功地证明经血管外膜转染OPN-si RNA能够显著降低颈动脉损伤后OPN的表达,抑制细胞迁移的相关基因MMP-14及MMP-2的表达,减轻新生内膜的形成。该研究为临床治疗RS提供一定实验基础及理论依据,进一步的研究还在进行中。

摘要：目的 观察经动脉外膜转染骨桥蛋白(OPN)的小干扰RNA对大鼠颈动脉损伤后内膜增生及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-14(MMP-14)表达的影响,并初步探讨OPN-si RNA-002抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法 以前期细胞实验筛选出的最敏感的OPN-si RNA-002序列作为动物实验转染基因,在转染试剂聚醚胶介导下,经血管外膜转染OPN-si RNA-002,于术后不同的实验终点处死大鼠,检测内膜增生程度及OPN、MMP-2、MMP-14的表达变化,以及OPN-si RNA-002对它们的抑制作用。结果OPN-si RNA-002组内膜增生显著减轻,OPN、MMP-2、MMP-14的表达减少,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论 OPN-si RNA-002可能通过特异性抑制OPN的表达,进而抑制MMP-2、MMP-14的表达,减轻血管损伤后内膜的增生。

浅论基质金属蛋白酶与心肌纤维化 篇6

1 基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶 (MMP) 是一组锌离子依赖性内肽酶, 包括多个结构相似、能够消化基质和基膜的酶, 目前至少已确定了18种。根据结构域及酶与底物亲和力的不同分为胶原酶、明胶酶、间质溶解酶和膜型金属蛋白酶[2]。MMP表达下调和酶激活过度受抑, 可能参与了许多表现为ECM过多沉积的病理过程 (如动脉粥样硬化、多种结缔组织疾病和重要脏器纤维化形成过程等) [3]。此外, 细胞外基质金属蛋白酶诱导物 (EMM-PRIN) , 具有诱导MMP基因表达的作用[4,5,6,7]。MMP主要以酶原的形式分泌到细胞外, 需经过蛋白酶的水解才能活化, 已发现MMP有3种不同的激活方式, 第一种是细胞外由血清蛋白酶所介导, 即通过丝氨酸蛋白酶 (如血清酶、胰蛋白酶、尿激酶等) 分解酶原, 使金属蛋白酶中半胱氨酸序列的Zn-Cys断裂而具有部分活性, 再通过别的金属蛋白酶如MMP-3进一步分解, 形成具有完全活性的MMP;第二种是原生质膜上由膜型MMP所介导, 这一机制被认为在细胞转移、降解细胞周围基质过程中起着重要作用;第三种是细胞内激活。文献也证实MT-MMP也存在着细胞内激活, 但其机制有待进一步研究[8]。

2 基质金属蛋白酶与心肌纤维化

心肌纤维化是指在许多病理状态下 (如心肌梗死、高血压和扩张性心肌病等) 导致心肌间质成份-成纤维细胞增殖, 有研究表明, 肥大细胞的增多和减少参与心肌纤维化的进程[9]。以往对纤维化形成机制的研究多聚焦在对ECM合成的调节方面。近年来, 人们注意到ECM降解也与心肌纤维化形成关系密切, 其中基质金属蛋白酶 (MMP) 与基质金属蛋白酶组织抑制因子 (TIMP) 的调节起着重要的作用。

基质金属蛋白酶13 篇7

关键词：胎膜早破,早产,基质金属蛋白酶,细胞外基质

胎膜早破(premature rupture of membranes,PROM)是指临产前胎膜破裂,而胎膜早破在足月前发生则称为足月前胎膜早破,是产科常见并发症,是早产及围生儿死亡的常见因素,宫内感染、产后感染及围生儿死亡率均升高[1],但其发病机制尚未明确。近年来随着研究的深入,有观点认为胶原合成、分泌和溶解过程中的代谢失衡导致胎膜早破,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)作为一类主要降解细胞外基质成分的蛋白酶,在胎膜早破中发挥重要作用,本文将就此做一综述。

1 胎膜的结构及胶原构成

胎膜有外层的绒毛膜和内层的羊膜组成,含有丰富的胶原及其他非胶原的成分,如氨基葡聚糖、纤维结合素、层粘连蛋白、弹性蛋白等。绒毛膜起源于中胚层,共分为4层:(1)滋养细胞为2~10层滋养细胞;(2)基底膜层由致密网状结构构成,其胶原主要为Ⅲ型胶原;(3)网状层为绒毛膜的主要组成部分,其胶原成分丰富,为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原和蛋白多糖;(4)细胞层在孕晚期非常薄,只有一层细胞厚度。随孕龄增长胶原含量渐减少,弹性和张力减弱。绒毛膜含有血管,通过弥散作用为羊膜提供营养成分。

羊膜为附着于绒毛膜表面的半透明膜,起源于外胚层,共分为5层:(1)海绵层主要含有Ⅲ型胶原,富含液体,与绒毛膜间有一定的空隙,两层不致紧贴而可以相互移动;(2)纤维母细胞层有间质细胞和巨噬细胞构成,是羊膜中最厚的一层,其胶原和非胶原的糖蛋白一起形成疏松的网状结构;(3)致密层薄而致密,羊膜的张力取决于此层的结构,其胶原有纤维母细胞层的间质细胞分泌,主要为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原;(4)基底层为无结构的网状纤维,由上皮层分泌的Ⅲ型、Ⅳ型胶原和非胶原的糖蛋白组成;(5)上皮层为单层立方型。羊膜具有弹性,是无血管、淋巴、神经的半透明薄膜,所需营养直接由羊水供给。羊膜层胶原含量丰富,决定胎膜的弹性和张力强度。胎膜的张力决定于ECM内的胶原类型,提供张力的主要是疏松的Ⅰ、Ⅲ型胶原,少部分是Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型胶原。羊膜的厚度不及绒毛膜,但羊膜中单位面积的胶原含量比绒毛膜多,特别是Ⅰ、Ⅲ型胶原,因而胎膜的弹性主要由羊膜决定,这与羊膜能保持一定的弹性和张力强度以适应妊娠期羊膜腔内压变化密切相关[2]。

2 MMPs的生物学特性

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族,是降解基底膜和细胞外基质的内肽酶。MMPs的主要作用为降解基质蛋白,避免其在细胞外堆积,根据其降解底物的不同分为:(1)胶原酶(MMP-1、8、13、18)主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等。(2)明胶酶(MMP-2、9)主要降解明胶变性胶原、Ⅳ型胶原。(3)基质溶素(MMP-3、7、10、11、12)主要降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶、蛋白聚糖和糖蛋白等,也可作用与其他MMPs及生长因子,细胞因子等。(4)膜型MMPs(MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP)主要降解明胶,Ⅵ型胶原,也对MMP-2的活化起调节作用。目前,MMPs至少有26种,构成一个超家族。所有MMPs家族成员均具有以下共性:(1)可降解细胞外基质成分;(2)以酶原形式分泌,在发挥溶蛋白作用时需要被活化;(3)在活性位点含有Zn2+,且需要Ca2+促进其稳定性;(4)在中性pH时发挥作用;(5)均可被特异的金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)抑制。胎盘、胎膜中MMPs主要为1、2、3、8和9型,分布于羊膜上皮细胞、平滑绒毛膜、蜕膜细胞内,其中对MMP-8、9研究较多[3]。

3 MMPs与胎膜早破

在妊娠过程中,随着孕周增加,子宫腔内压力不断增大,而胎膜却保持完整。说明胎膜基质胶原在妊娠过程中处与一种动态平衡,不断合成和分解以适应宫腔压力增大,维持胎膜完整。目前的观点认为在胶原合成、分泌和溶解过程中的代谢失衡是胎膜破裂的最终机制[4]。胶原是子宫和宫颈组织细胞外基质的主要成分,子宫中胶原的含量随妊娠及分娩的变化,从早孕期到分娩,宫颈和胎膜中胶原的含量逐渐减少。宫颈中胶原及氨基葡聚糖的减少,含水量的增加是宫颈成熟扩张的生理基础,胎膜中的胶原的代谢在妊娠的进展和结局中具有重要作用。近来有研究认为胶原含量的减少是由于妊娠组织中MMPs的活性增加,胶原降解增加所致。因此胶原的代谢在妊娠的进展和结局中具有重要作用。PROM患者胎膜中胶原的含量低于正常同孕周妇女,这与其胎膜中胶原合成减少和分解增加有关,还与感染有关。感染过程中产生的细胞因子及细菌产生的脂多糖等诱导基质金属蛋白酶的合成和活化,水解胎膜的细胞外基质,降低了组织的张力强度,使胶原纤维Ⅲ减少,胎膜的脆性增加。感染的微生物内毒素可诱导产生前列腺素(PG),引起宫缩,致使PROM。Mogami等[5]研究发现纤连蛋白可导致MMP-9、COX-2、PGE2升高,导致胎膜早破,引起早产。

4 MMP-8与胎膜早破

MMP-8也称中性粒细胞胶原酶或胶原酶Ⅱ,是一种相对分子质量为75 000~80 000的糖蛋白。MMP-8主要由中性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、成牙质细胞等合成。它主要通过对维持胎膜弹性和张力的Ⅰ、Ⅱ型胶原进行降解,在妊娠、分娩、生理破膜和胎膜早破中起重要的生理、病理作用[6]。正常妊娠状况下,胎膜的完整性始终维持不变,其原因可能与低水平的MMP-8和相对较高的TIMP-1共同作用有关[7]。

MMP-8在胎膜早破中起重要作用。MMP-8通过降解细胞外基质中的Ⅰ、Ⅱ型胶原,导致胶原纤维含量下降,胶原、氨基葡聚糖和层粘连蛋白等成分排列极其紊乱、模糊和总量急剧减少,从而胎膜抗张力及弹性变形能力下降,对破裂的敏感性增加,易在临产后破裂或发生胎膜早破。Maymon等[8]研究发现MMP-8在胎膜已破早产组和胎膜未破早产组相比羊水中浓度明显增加(P<0.05);马文革等[6]研究发现PROM孕妇羊水中MMP-8水平升高,并可以反映羊膜腔感染,但是血清中MMP-8水平升高不明显(P>0.05),所以临床上不能用血MMP-8水平预测胎膜早破和绒毛膜羊膜炎。但是贺喜风等[7]研究发现在PROM患者胎膜中MMP-8表达异常升高,TIMP-1水平降低,可能是导致PROM的重要发病机制。

MMP-8是感染的敏感和特异性指标。当机体受到趋化性刺激或处于炎症状况时,可诱导中性粒细胞等合成MMP-8酶原,而促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-8、花生四烯酸代谢产物等刺激细胞释放MMP-8酶原并将它激活[9]。局部炎症反应的刺激,可以产生大量的细胞因子如IL-6、IL-8等,发生炎症时,活化的中性粒细胞释放MMP-8,同时炎症细胞因子IL-6通过诱导MMP-8的基因表达,从而激活MMP-8降解胎膜和宫颈的细胞外基质,使宫颈基质内结缔组织松弛、解离,宫颈扩张度增加,导致胎膜早破。IL-8作为中性粒细胞的化学趋动因子,可以增加胶原酶的活性,增加白细胞MMP-8的合成,从而在宫颈成熟及分娩发动中起作用[10]。Andrys等[11]研究发现在有绒毛膜羊膜炎的胎膜早破孕妇中,脐血中IL-6,IL-8,MMP-8的浓度明显升高,活化的MMP-8可降解胎膜中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原,从而使胎膜易在临产时破裂。

5 MMP-9与胎膜早破

MMP-9是一种锌依赖性肽链内切酶,属于Ⅳ型胶原酶,且又有明胶酶的活性,在体内可由多种细胞合成,以无活性的酶原形式分泌,经血浆酶切断其N2端被激活,主要参与细胞外基质的降解与重塑,是降解Ⅳ、Ⅴ型胶原和弹力蛋白的主要酶。胎膜的细胞外基质主要由Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原组成的,Ⅳ型胶原是羊膜基底膜的主要成分。MMP-9能特异性地降解胎膜的主要成分Ⅳ型胶原,促进包括Ⅳ型胶原在内的胞外基质的快速崩解引起细胞发生形态学变化和引发凋亡。Lei等[12]研究了孕鼠妊娠和分娩过程中羊水、胎膜中MMP-9水平和孕鼠基底膜中Ⅳ型胶原含量的变化,基底膜Ⅳ型胶原的丧失与MMP-9水平的改变密切相关;发现MMP-9在胶原降解、胎膜结构的弱化中有着重要的作用。MMP-9在胎膜的高表达导致了局部胶原降解加速,基底膜破坏,胎膜强度、韧性下降,从而在宫颈部胎膜发生了局部破裂。Maymon等[13]研究,通过对PROM患者和正常妊娠者胎膜中胶原含量的比较,发现PROM组胶原的含量明显低于正常组,并且与MMP-9水平上升一致。伍玲等[14]研究表明,早产组孕妇血清及羊水中MMP-9的含量均高于对照组(P<0.05),孕妇血清及羊水中MMP-9的水平与早产有相关性。

陈春莹等[15]研究发现,MMP-9主要表达于胎膜滋养层细胞浆中,在胎膜早破组滋养层中高表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),但足月胎膜早破组与未足月胎膜早破组中的表达差异无统计学意义。这与笔者的研究结果相一致,笔者通过对胎膜早破组(包括足月胎膜早破和足月前胎膜早破)患者与正常对照组孕妇胎膜组织中MMP-9 mRNA的表达进行研究发现,发现胎膜早破组的MMP-9 mRNA的表达显著高于正常对照组(P<0.01),说明MMP-9的表达增高与胎膜早破有关。因此,MMP-9水平异常升高促使胎膜中胶原降解的量和速度增加,通过加速局部胶原的降解,使基底膜受到破坏,改变胎膜本身的结构,使胎膜的脆弱性增加、强度和韧性下降而发挥作用[16,17]。

6 展望

基质金属蛋白酶13 篇8

关键词：基质金属蛋白酶-9,缺氧性脑损伤,大鼠,早产儿

早产儿脑损伤日益成为近年来新生儿科的热点和难点问题。但是早产儿脑损伤的发病机制尚不明确,探讨早产儿脑损伤的相关发病机制以及进一步探索有效的治疗方法,对于早产儿脑损伤的早期有效治疗、降低早产儿脑损伤的并发症发生率、提高早产儿生存质量、减轻社会经济负担有极其重要的意义。研究发现,缺血再灌注刺激之后的脑组织内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞以及渗透的中性粒细胞可以刺激基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达[1,2,3,4]。活化的MMP-9能够降解神经血管的细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)、血管板层膜(如胶原Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ和Ⅻ等)、血脑屏障的紧密连接、脑白质成分等,并能够通过破坏细胞-基质信号通路和稳态来启动神经元的损伤或脑细胞的死亡[4,5,6,7,8]。因此,MMP-9在缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury)时的血脑屏障破坏以及脑损伤过程中发挥关键性的作用。然而,MMP-9在早产儿缺氧缺血性脑损伤中的作用机制仍然不是十分明确。敲除研究表明,MMP-9的缺失对于9日龄的缺氧缺血小鼠发挥保护作用[9]。MMP-9除了能够介导损伤的发生,其在缺氧缺血性脑损伤阶段的血管生成以及脑组织修复和功能重塑过程中亦发挥着至关重要的作用。因此,笔者相信,MMP-9的表达和活性的调节对于早产儿缺氧缺血性脑损伤的发展和进程是关键性的,同时又能够协助其从脑损伤中修复和康复。在动物模型以及人类缺血性脑损伤时,大脑局灶性或整体性的缺血也能够引发MMP-9表达和活性的升高。

1 材料与方法

1.1 材料

由北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2007-0001]提供3日龄的SPF级SD大鼠乳鼠(雌雄不计,体重8～10 g),充入的混合气体(8%O2+92%N2)由北京友谊医院提供,充入混合气体所用的封闭容器自制。

1.2 缺氧模型的建立

3日龄SPF级SD大鼠乳鼠共72只,饲养条件如下:温度24℃,湿度40%,光照时间∶黑暗时间=12 h∶12 h。将所有乳鼠随机分为正常对照组和缺氧组,正常对照组乳鼠不做任何处理,将缺氧组乳鼠放入自制封闭容器,持续充以8%O2+92%N2的混合气体(于37℃水浴中),气体流量为0.5～1.0 L/min,持续充气时间为90 min,回笼,继续母乳喂养。

1.3 标本获取

于缺氧模型建立后1、3、7、14、21和28 d处死缺氧组和正常对照组大鼠,每组大鼠的左侧脑组织立即放入中性福尔马林溶液中固定,冰冻切片,备用,右侧脑组织立即放入液氮冷冻保存,用于Western blot检测。

1.4 HE染色

将脑组织用10%中性福尔马林固定6 h,放入30%蔗糖中过夜,观察脑组织是否沉降到容器底部,沉底之后进行冰冻切片,切片厚度为12μm。HE染色主要步骤详见参考文献[10],拍照。

1.5 Western blot检测

按组织重量∶裂解液体积=1∶9比例加入裂解液,Fluka电动组织匀浆器15 000 r/min进行匀浆,每次10 s,间隔10 s,进行3次匀浆(冰上)。冰上孵育20 min后,13 000 r/min(4℃)离心20 min。取上清,分装-80℃保存,待测。按照BCA蛋白定量试剂盒(sunbio)使用说明操作,测定蛋白浓度;之后进行蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE),分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%。浓缩胶电泳电压90 V,分离胶电泳电压为120 V,电泳至分离胶底部;300 mA恒流/60 min转移到PVDF膜上,将膜完全浸没于5%脱脂牛奶-TBST中,水平摇床孵育1 h(RT)。将膜与MMP-9一抗或β-actin(购自Santa Cruz公司,用封闭液稀释)一起孵育,MMP-9的工作浓度为1∶200,β-actin的工作浓度为1∶1 000,4℃过夜。次日,洗膜:TBST洗3次,每次10 min。用HRP标记的二抗孵育:山羊抗兔IgG(H+L)HRP1∶20000,室温孵育40 min。洗膜:TBST洗膜3次,每次10 min。ECL滴加到膜的蛋白面,反应3～5 min;胶片曝光,显影2 min,定影。将显色后的膜或底片照相,并用LabWorkers软件对图像进行灰度分析,分别取每个样品的MMP-9与相应的β-actin的灰度值的比值进行计算。

2 结果

2.1 缺氧后表现

缺氧后早期(5～10 min)大鼠表现兴奋症状如烦躁不安、呼吸加深加快(10～15 min),约1 h后出现抑制现象如反应淡漠等,以及间断发作的痉挛、抽搐甚至角弓反张。之后进入比较稳定的反应淡漠期,直至缺氧处理完成。

2.2 脑组织HE染色结果

与正常对照组相比,缺氧组大鼠脑组织出现神经元核固缩、碎裂、融解,核仁不清或消失、基质疏松或消失,正常对照组脑组织结构完整、清晰,多数核居中,见图1。

A:正常对照组1 d时间点,脑组织结构清晰,核仁清楚;B:缺氧组1 d时间点,缺氧组脑组织出现神经元核固缩、碎裂、融解,核仁不清或消失、基质疏松或消失

2.3 Western blot结果

缺氧组MMP-9表达呈现动态性变化,缺氧后3 d MMP-9表达开始升高,7 d达到高峰,之后出现表达情况的下降,14 d后表达最低,表达情况的降低一直持续到21 d,28 d时表达又有所升高。见图2、3。

3 讨论

缺氧缺血性脑损伤以及缺氧缺血性脑病对于早产儿以及足月新生儿来说仍然是一个很严重的问题,因为这一类损伤引发的后果包括脑损伤、脑病甚至更严重的死亡,此种原因的新生儿脑病的发生率为0.3%～0.9%,这其中有1/3到1/2的患儿会发生严重并发症或者死亡[11]。缺氧性脑损伤的病理发生是一个多因素的复杂过程,在此过程中,众多分子参与其中,包括许多转录因子如缺氧诱导因子1α、少突胶质细胞系基因1等。

基质金属蛋白酶13 篇9

关键词：基质金属蛋白酶,基质金属蛋白酶抑制剂,肿瘤侵袭,肿瘤转移

恶性肿瘤的进程包括:正常细胞某些基因的改变、恶性表型的形成、侵袭邻近正常组织、远距离及全身组织扩散 (转移) 。据临床统计, 约有80%以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭与转移, 故此方面的研究一直受到很多人的关注。其中, 对基质金属蛋白酶类及其组织抑制因子的研究最多。

1 MMPs、TIMPs的一般特性

1.1 基质金属蛋白酶 (MMPs)

M M P s是一组蛋白水解酶。根据作用底物的不同把M M P s分为6类。

1.2 基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs)

T I M P s是多基因家族的编码蛋白。它是M M P s的天然抑制剂, 在肿瘤组织与间质细胞中均可表达。

2 TIMPs、MMPs的功能及其在肿瘤侵袭转移中的作用

2.1 MMPs的功能

2.1.1 降解细胞外基质ECM是肿瘤转移的主要屏障, MMPs

通过降解E C M及基底膜, 使肿瘤细胞沿基底膜缺损和基质空隙侵入周围组织及血管。

2.1.2 在新生血管形成中的作用

肿瘤血管形成的机制有:已有血管的出芽生殖;骨髓中内皮细胞前体的动员;淋巴管转变而成[1]。在这一过程中, MMPs除了在基底膜降解、细胞运动和管腔形成中起重要作用, 还能使多种生长因子释放增多[1]。

2.1.3 对细胞凋亡的作用

有研究表明MMP-7能降解细胞膜上的Fas配体, 促进肿瘤生长, 还能分解胰岛素样生长因子结合蛋白释放IGF-I, 促进肺癌、乳腺癌、肠癌等的生长[2]。

2.1.4 对细胞增殖的作用多种MMPs对肿瘤细胞增殖有促进作用。

2.2 TIMPs功能

2.2.1 抑制MMPs活性

研究表明, TIMPs对MMPs的抑制作用既有一定的交叉性又有特定的选择性, 在调节细胞外基质的代谢中起重要作用。

2.2.2 对血管生长的作用

研究表明TIMP-2可通过减少VEGF释放而抑制乳腺癌血管生长, TIMP-3通过抑制VEGF与受体K D R的结合而抑制血管生长[3]。

2.2.3 对细胞凋亡的作用TIMPs家族不同成员对不同的细胞

系凋亡的作用是不相同的。

2.2.4 对细胞增殖的作用

有研究表明TIMP-1能刺激红细胞系和肿瘤细胞系的增殖, 也能促进动脉平滑肌细胞增殖。T I M P-2也具有红系增生活性。

2.3 MMPs、TIMPs与肿瘤的侵袭和转移

M M P的活性上调与肿瘤侵袭、转移有关, T I M P是M M P的天然抑制物, 可下调M M P s活性。在正常生理状态下, M M P与T I M P协同产生, 维持动态平衡, 这种平衡关系是维持E C M内环境稳定和完整的决定因素, 也就是说M M P在肿瘤浸润中所起的作用取决于两者间的比例关系。当活化的M M P s与T I M P s的平衡关系受到破坏, 趋向有利于ECM降解的一边, 且失去可调控性, 则提示有肿瘤侵袭和转移的可能性。

3 MMPs与TIMPs在肿瘤诊断、预后中的作用

M M P s是肿瘤发展过程中的重要酶类, 几乎在所有的肿瘤组织中均呈高表达。许多研究表明, M M P s的表达与肿瘤的分化程度分期等有关, 可用作诊断及判断预后的指标。在大肠癌患者局部肿瘤组织中的M M P-9表达与肿瘤的临床分期、浸润深度及淋巴结转移的关系密切, 其表达越高, 肿瘤的侵袭转移潜能越强, 恶性程度越高, 预后越差。

T I M P s作为M M P s的抑制剂, 与肿瘤发生、侵袭和转移密切相关, 也是肿瘤诊断的一项有效指标。有研究证实在胰腺癌中, T I M P-3的表达明显下降或不表达, 可以作为胰腺癌的早期诊断指标, 具有较好的敏感性和特异性[4]。

随着TIMPs与MMPs的平衡关系在肿瘤发病过程中被重视, 有人提出M M P/T I M P似乎更能作为肿瘤浸润转移的一个预后指标。

4 MMPs、TIMPs与肿瘤的治疗

4.1 合成基质金属蛋白酶抑制剂 (MMPIs)

M M P I s是一种低分子合成物, 结构与作用底物的M M P s结合区域相似, 能与M M P s的锌活性位点可逆性结合, 竞争性抑制其水解活性。巴马司他 (Batimastat BB-94) 是较早研制出的合成基质金属蛋白酶抑制剂。大量的动物模型试验表明, M M P I s能有效地抑制肿瘤的生长和转移, 与细胞毒性药物联用能增强药物的作用。目前, 大多数学者仍然在进行进一步研究, 并乐观的认为基质金属蛋白酶抑制剂终会成为有效的抗肿瘤药。

4.2 TIMPs在治疗中的应用

TIMPs是MMPs的天然抑制剂, 研究发现肿瘤组织中TIMPs的表达增高能抑制肿瘤的生长和转移。近来, TIMPs基因活体内转染治疗肿瘤技术, 已作为一种新的基因治疗法大量用于体外试验及动物模型体内试验。Rigg AS等通过腺病毒载体将TIMP-1和TIMP-2分别导入荷瘤 (人胰腺癌) 裸鼠体内肿瘤组织, 结果表明肿瘤的生长及侵袭性都受到抑制, 与对照比较生存期明显延长。人们已试图将T I M P s制剂用于肿瘤的治疗, 并取得一定效果。同时在肿瘤的基因治疗方面, TIMPs也显示出其独特的优越性, 因为其只需转染有限的细胞便足以阻止基底膜及E C M的降解, 故其对肿瘤治疗有潜在价值。

4.3 疫苗治疗

M M P s尤其是M M P-2在肿瘤生长转移中有重要作用, 因此有研究人员设想利用主动免疫打破M M P-2的免疫耐受也可以成为肿瘤治疗的一种有效方法。Su JM, Wei YQ等将鸡同源MMP-2作为抗原转入小鼠体内, 结果发现小鼠血清中自身抗体生成增加, 对M M P-2及M M P-2前体均有抑制作用。

总之, 研究MMPs及TIMPs与肿瘤的侵袭转移的关系已为我们人类认识肿瘤进程的机理提供了有力的依据, 随着这一领域研究的深入, 将为临床肿瘤的诊断预防提供可信的指标, 也为临床治疗肿瘤提供新的策略与方向。

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参考文献

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