头孢菌素C高产低耗发酵菌株的选育

近年来, 随着社会对环境的重视, 作为排放危险废弃物 (废菌丝) 的行业, 越来越受到制约, 同时, 市场竞争也愈演愈烈, 使各大厂家不得不尽量降低生产成本。我们建立快速测定发酵液中头孢菌素C的方法, 初步确定筛选高产低耗菌株的最佳方法, 为头孢发酵生产实际提高检测速度和菌株筛选方法的优化提供新的思路。

一、快速测定头孢菌素C的方法

头孢菌素C的检测方法有多种:碘量法、260nm萦外分光法、生物测定法、高压液相法等。在这些方法中都较慢, 难以快速的处理较大数量的样品。因此, 不能直接的用于高通量方法中的检测。我们通过多次试验, 对碘量法进行改良, 使其能够快速的检测显色, 用于通量菌种选育。

1. 碘量法的原理

完整的头孢菌素分子不能与碘起作用, 若用碱将头孢菌素分子的内酰胺环破坏而生成青霉噻唑酸, 就能与碘起作用, 加入一定量的碘, 其中一部分碘与头孢菌素噻唑酸起作用, 剩余的碘则用硫代硫酸钠滴定, 从头孢菌素的消耗碘量, 便可算出效价。碘与青霉噻唑酸在一定条件下 (p H4.4-4.5, 温度25℃) 一分子头孢菌素破坏成的青霉噻唑酸, 能与8个碘原子起作用。

2. 实验试剂和仪器

试剂:硫代硫酸钠 (0.01077mol/L) 、盐酸 (1mol/L) 、氢氧化钠 (1mol/L) 、碘液 (0.005mol/L) 、醋酸钠缓冲液 (p H=4.4~4.5) 、可溶性淀粉 (0.5%)

仪器:碘量瓶 (100m L) 、容量瓶 (100m L、150 m L、200m L、250m L) 、取样枪 (0.01m L、0.1m L、1m L) 、自制加碘装置 (20m L酸式滴定管25m L碱式滴定管25m L

3. 实验方法

精密称取定量头孢类抗生素产品, 采用不同的稀释倍数, 液相色谱仪进行定量检测, 计算头孢类抗生素发酵单位或效价, 记录结果。用已知效价的稀释液, 采用间接碘量法进行测定, 用硫代硫酸钠 (Na2S2O3) 标准液进行滴定, 记录已知效价的稀释液消耗碘液量。建立限量检测方法, 用淀粉做指示剂。

我们吸取定量的稀释液, 加入一定量的碘液, 加入3-4滴淀粉指示剂, 如果显色, 效价低于已知效价, 如果不显色, 效价等于或大于已知效价

二、高产低耗菌株的优选工

1. 实验材料和设备

菌种:顶头孢霉菌 (Cephalosporium acr—emonium) RR9

培养基:固体培养基 (斜面、分离平板) p H 7.0±0.2

液培培养基: (g/L) :麦芽汁24.0、麦芽糖40.0、蛋白胨10.0

菌种选育诱变剂、融合剂:15W紫光灯、1%氯化锂、30%的聚乙二醇

菌种保护剂:20%的甘油

实验设备:诱变箱、SPY-50上海摇床、高压液相

2. 实验方法

(1) 原生质体制备

取培养至节孢子成熟期的茄子瓶斜面, 加无菌水10m L, 取其中1m L接种于500m L的三角瓶中, 温度25℃、湿度50%、摇床转速110r/转, 培养至对数生长期 (36小时左右) 使用纤维素酶。蜗牛酶处理。

(2) 紫外诱变、氯化锂处理

制备顶头孢霉菌的原生质体, 使原生质体的含量为106-107个/m L, 照射距离为15cm。取照射过的原生质体悬液进行梯度稀释、涂布梯度平板、恒温培养, 同时以未经处理的孢子液作为对照。同样方法, 进行1%氯化锂处理。

(3) 低溶氧菌株的筛选

选择形态丰满、色泽及大小适中的菌落, 分别编号, 制作冷冻管, 保存于-80℃冰箱中。同时, 按配方配制种子瓶, 按常规方法进行接种、培养。配制发酵培养基, 将摇床转速调整由280r/min调整为120 r/min震荡培养, 以筛选出低溶氧菌株。

(4) 废菌丝水利用菌株的筛选

选择形态丰满、色泽及大小适中的菌落, 分别编号, 制作冷冻管, 保存于-80℃冰箱中。同时, 按配方配制种子瓶, 按常规方法进行接种、培养。配制发酵培养基, 用发酵液过滤末端的菌丝水 (超滤膜过滤) 替代发酵培养基中的玉米浆、花生饼粉、谷朊粉等物质, 以筛选出低菌丝水回收利用菌株。

(5) 融合及低溶氧、菌丝水回收利用菌株的筛选

将所得几株低溶氧条件下 (转速由280r/min调整为120 r/min) 的高单位菌株、废菌丝水替代菌株及出发菌株在30℃温控下, 用30%PEG处理, 涂平板、恒温培养。从中筛选即低溶氧又回收利用废菌丝水的菌株。

小结

1.由于快速显色检测效价方法的建立, 使得菌种选育速度得到很大的提高, 摇床处理摇瓶最多100个, 而处理离心管可达5000支以上。使用高压液相测定菌株培养液效价, 每支样品需要6分钟, 而使用改良的碘量法显色测定40支的培养液效价 (使用排枪取用样品) , 一共需要30分钟即可。

2.筛选出低消耗、回收利用废菌丝水的菌株。通过以上实验得到低溶氧且回收利用菌丝水的菌丝DJ-228, 其相对于出发菌株RR9, 在发酵单位及质量指标持平的情况下, 溶氧消耗 (电能节约) 降低50%以上, 过滤岗位以2-3倍冲水比情况下的末端菌丝水可替代基础料中的玉米浆20%以上。

摘要：本文通过建立头孢菌素快速显色测定方法和生产菌株的适宜的诱变方法, 建立了头孢菌素C菌株选育的高通量方法, 从而选育出低溶氧同时又使用废菌丝的高产低耗发酵菌株。

关键词：效价测定,菌种选育,诱变,高产低耗