转基因技术研究论文

中央农村工作领导小组办公室副主任韩俊前不久表示，今后我国要加强农业转基因生物技术研究、安全管理和科学普及，推动公众和媒体理性全面地看待转基因技术和产品。韩俊是在国务院新闻办公室日前就《关于加大改革创新力度加快农业现代化建设的若干意见》解读等情况举行的发布会上作上述表示的。下面小编整理了一些《转基因技术研究论文(精选3篇)》，希望对大家有所帮助。

转基因技术研究论文 篇1：

玉米转基因技术研究现状及发展趋势

摘要 自1990年可育的转基因玉米问世以来，玉米转基因技术一直是国内外作物转基因研究的热点之一，并在玉米育种中发挥了巨大作用。使用农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法等转化技术，将不同来源的单个和多个功能基因转入玉米，对玉米重要农艺性状进行遗传改良，在培育抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆等转基因新品种方面取得了巨大进展。论述了玉米转基因技术的研究进展，并对育种中存在的问题提出了一些看法。

关键词 转基因技术；玉米；现状；趋势

Key words Transgenic technology； Maize；Status； Tendency

玉米作为世界上三大粮食作物之一，又是重要的粮食、饲料作物，同时也是现代工业的重要原料，其在农业生产中占有非常重要的地位。随着世界人口的不断增长和畜牧业、工业的发展，玉米的总需求量将不断攀升，其生产面临巨大挑战。一直以来，玉米育种学家已经采用常规育种方法，培育出了很多优良杂交种，并且对农业生产作出重大贡献。但玉米的常规遗传改良育种方法存在优良亲本自交系当选率低、育种周期长、遗传连锁难以打破、优良组合预见性差等缺点。

而转基因技术在植物育种中的应用，取得了常规育种方法难以达到的效果和效益，随着转基因技术的快速发展，它已经成为作物育种的重要辅助手段，成为农业生物技术的核心领域。近年来，玉米作为转基因技术的主要研究对象，已经受到各国科学家的广泛关注。1990年GordonKamm等[1]首次获得可育的转基因玉米后，相继又有许多实验室成功应用基因枪、电击、农杆菌介导等技术将外源基因导入到玉米细胞中，获得了可育的转基因玉米植株。

1 玉米转基因技术研究现状

玉米的基因导入方法主要包括两大类：根癌农杆菌介导转化和DNA直接导入转化。DNA直接导入转化方法包括基因枪法、电击法、花粉管通道法、聚乙二醇导入法、阳离子转化法、子房注射法等。其中，基因枪法是玉米遗传转化中应用最多且效果最好的方法。

1.1 农杆菌介导转化法

农杆菌介导转入法是目前转基因技术最常用的一种方法。根癌农杆菌属根瘤菌科，是一种能够侵染双子叶植物及部分单子叶植物根或茎部伤口使之形成冠瘿瘤的革兰氏阴性杆菌 [2]。根癌农杆菌通过其含有的Ti质粒DNA直接转到植物基因组上而使植物得到转化，因此，农杆菌是一种天然的植物基因转化系统。农杆菌在双子叶植株中的转化已经非常成功，但由于玉米等单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，单子叶植株转化研究落后于双子叶植株。1987年Bytebier等[3]利用农杆菌Ti质粒转化成功首株单子叶植物石刁柏。1990年Gould等[4]用农杆菌成功转化玉米茎尖组织，并且能够遗传到R1代。

1.2 基因枪法

基因枪法又叫微弹轰击法，其原理是携带了外源基因的金属微弹在高压所产生的推力下高速穿透植物组织或受体细胞，从而使外源基因导入到受体细胞核并整合到植物基因组中实现遗传转化的过程[5]。该技术也是植物转基因技术中常使用的方法之一。基因枪法受体类型广泛，凡是能被基因枪微弹穿透的组织都可以作为其转化的受体，但是具有潜在分化能力的受体细胞更容易接受外源DNA，且转化率更高。该方法的优点不受基因型的限制，缺点是由外源基因整合的拷贝数多、稳定性差。

1987年美国康奈尔大学Sanford等[6]最先建立了基因导入的方法。1989年Klein等[7]第一次将基因枪法应用到玉米转化中并获得了成功。1994年赵天永等[8]利用基因枪法将GUS基因导入到玉米茎尖组织。Wan 等[9]利用基因枪法将 pat和GUS基因转入玉米I型愈伤组织。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法原理是植物授粉后，将外源DNA沿花粉管渗入、经珠心通道进入胚囊，从而转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞[10]。花粉管通道法是针对玉米的开花习性、花器结构和受精过程采用的一种全新的外源基因导入方法。该方法不受植株基因型限制，可以将任何品种的外源基因导入，直接运用到常规育种中；操作简便，无需建立愈伤组织诱导，易于实现规模化转化；经济适用，省时省力，成本低。

花粉管通道法最初是由周光宇等[11]提出并发展起来的，他首先在棉花的基因转化上获得成功。祁永红等[12]利用花粉管技术将外源总DNA成功导入到玉米自交系，获得了广泛变异不同类型的自交系。

1.4 其他方法

除上述3种导入方法外，还有聚乙二醇导入法、电击法、超声波介导法、阳离子转化法、子房注射法等，都是转基因玉米研究中使用过的导入方法，且都有成功的报道。

2 转基因技术在玉米中的应用

2.1 抗除草剂转基因玉米

除草剂是现代农业育种中不可缺少的一部分，其对节省劳动力、提高劳动效率、保护土壤结构等方面起到了较好的作用，但除草剂也会不同程度地对农作物造成一定的伤害，且玉米对除草剂极为敏感。因此，筛选出对各种除草剂有超强抗性的基因整合到玉米中，培育出新型的抗除草剂转基因玉米是控制杂草的高效、低成本、无公害新手段。

目前，就世界范围看，抗除草剂转基因玉米已经进入了商业性生产，国外一些转基因育种公司都推出了抗除草剂转基因玉米品种，包括美国孟山都公司的抗草甘膦玉米、艾格罗公司的抗草铵膦玉米、氢氨公司的抗咪唑啉酮玉米等。

2.2 抗虫转基因玉米

虫害是导致玉米减产的一个重要因素，目前，化学杀虫剂是控制玉米虫害的主要方法，但化学杀虫剂不仅杀死害虫，也杀死了害虫的天敌，长此以往，环境污染日益严重，生态平衡遭到破坏。其次，化学杀虫剂还会导致玉米中有农药残留、害虫产生抗药性等负面问题。抗虫转基因玉米是解决杀虫剂负面影响的有效方法。目前，Bar基因在抗除草剂基因中应用最广泛。

Schnepf等[13]首次从苏云金芽孢杆菌成功地克隆了一个编码杀虫晶体蛋白的毒蛋白Bt基因。1996年，Bt基因玉米正式进入商品化生产，截止目前，已商业化种植了很多抗虫转基因玉米。2003年，美国孟山都公司引入了防治鳞翅目害虫的抗虫基因cry1Fa2和抗根叶甲虫防治基因cry3Bb1。中国农业大学刘桂玲等[14]将Bt基因转入玉米获得抗虫转化体，且在后代分离出了能正常遗传的家系。王国英等[15]利用基因工程法成功把Bt基因导入到玉米幼胚中，Cry1A（b）基因在再生植株中得到表达，育成了稳定的抗虫转基因玉米。王景雪等[16]利用花粉管通道法分别将Bt毒蛋白基因和几丁质酶基因导入玉米。

2.3 抗病转基因玉米

影响玉米生长的病害主要可分为三大类：病毒性病害（玉米粗缩病、矮花叶病等）、真菌性病害（玉米纹枯病）和细菌性病害[17]。这些病害也是导致玉米品质和产量下降的重要因素之一。研究发现，玉米抗矮花叶病毒能力与矮花叶病毒外壳蛋白基因互补的hpRNA发夹结构的长度有关[18]；大肠杆菌的核糖核酸内切酶基因能有效增强玉米对粗缩病的抗性[19]；沉默胱抑素基因（CC9）对玉米黑粉病有一定的抗性[20]；兔防御素基因（NP-1）转入玉米可有效防治玉米大斑病[21]。

2.4 抗旱、耐盐转基因玉米

我国水资源紧缺，多数为干旱和半干旱土地，甚至有大片盐渍土壤，因此，提高玉米抗逆性，培育抗旱、耐盐转基因玉米是保证玉米稳产的一个重要手段。何锶洁等[22]将甜菜碱醛脱氢酶基因导入玉米中，获得耐盐植株；刘岩等[23]将大肠杆菌6磷酸山梨醇脱氢酶基因导入玉米，转化体可在2%盐浓度中生长；任晓燕等[24]将山菠菜胆碱单加氧酶（AhCMO）导入玉米自交系，玉米耐盐性明显提高；Amara等[25]在玉米中大量表达的LEA Rab28蛋白，Wang等[26]转入玉米的编码磷脂酰肌醇磷脂酶ZmPLC1基因，玉米的抗旱性增强。

2.5 改良玉米品质

转基因玉米还可改良玉米品质，Bicar等[27]利用基因枪法在玉米自交系中导入alactalbumin基因，提高了玉米胚乳中醇溶蛋白的含量；关淑艳等[28]利用花粉通道法导入sbe2a基因，提高了玉米胚乳中直链淀粉的含量；丁明忠等[29]将大豆总DNA导入玉米，提高了玉米种子中的蛋白质含量；张秀君等[30]将马铃薯花粉特异水溶性蛋白的cDNA导入玉米，提高了玉米种子干重中的赖氨酸含量。

利用基因工程技术对玉米进行分子育种，除在抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱、改良玉米品质等方面进行探索，获得预期效果外，还在获得高蛋白基因、雄性不育基因、抗寒基因等方面作了研究。

3 玉米转基因技术研究发展趋势

3.1 发展多基因转化和基因聚合的技术

发展玉米多基因转化和基因聚合技术，使其具有复合性状是未来玉米转基因技术研究的明显特点。孙越等[31]将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS基因同时导入玉米，获得了兼抗虫、抗除草剂、抗干旱优良复合性状的转基因玉米新材料。

3.2 发展基因打靶或基因定点重组技术

由于转基因技术插入位点和插入拷贝数的不确定性，基因表达效果不可预知。基因打靶技术可使外源基因定点整合到核基因组上，避免基因随机插入导致的表达不确定性和对原基因组的损害，该技术避免了传统育种步骤的繁琐，可快速精确培育出新品种。但该技术打靶效率低，目前，可利用嵌合寡核苷酸介导单碱基置换、利用高效正负筛选同源重组子或利用ZFNs在染色体DNA上引入定点断裂，促进同源重组介导的基因定点整合和置换。

3.3 发展安全的转化系统

转基因玉米的安全问题涉及目的基因及整合基因，整合基因的安全性主要是筛选标记的安全性。近年来，人们越来越重视这些筛选标记基因对生态系统和人类的影响。因此，培育无选择标记的转基因玉米将是未来发展的方向。

4 小结

转基因育种是一项复杂的工程，还需要不断完善转基因技术，从扩大群体、淘汰选择最终向着精确插入、稳定表达的方向研究。相信，随着更多高价值基因的发现、育种转化技术的发展以及政府政策和监督管理制度的完善，转基因玉米将会更好地服务于农业生产。

参考文献

[1]GORDONKAMM W J，SPENCER T M，MANGANO M L，et al.Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants[J].Plant cell，1990，2：603-618.

[2]尹祥佳，翁建峰，谢传晓，等.玉米转基因技术研究及其应用[J].作物杂志，2010，3（6）：1-9.

[3]BYTEBIER B F，DEBOECK F，GREVE H D.TDNA organization in tumor cultures and transgenic plants of the monocotycledon Asparagus officinalis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1987，84：5345-5349.

[4]GOULD J H，DEVEY M，HASEGAWA O.Transformation of Zea mays L.using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex[J].Plant physiology，1991，95：426-434.

[5]黄敏，杜何为，张组新.玉米转基因技术研究进展[J].安徽农业科学，2004，32（5）：1017-1020

[6]SANFORD J C，KLEIN T M，WOLF E D，et al.Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process[J].Particulate science and technology，1987，5：27-37.

[7]KLEIN T M，WOLF E D，WU R，et al.High velocity microprojectiles for delivering nucleid acids into living cell[J].Nature，1987，327：70-73.

[8]赵天永，黄忠，王国英，等.影响玉米基因枪转化效率的几个因素[J].农业生物技术学报，1997，5（1）：35-39.

[9]WAN Y C，WIDHOLM J M，LEMAUX P G.Type I callus as a bombardement target for generating fertile transgenic maize（Zea mays L.）[J].Planta，1995，1：7-14.

[10]王景雪，孙毅，崔贵梅，等.花粉介导法获得玉米转基因植株[J].植物学报，2001，43（3）：275-279.

[11]周光宇，翁坚，龚蓁蓁，等.农业分子育种授粉后外源DNA导入植物的技术[J].中国农业科学，1988，21（3）：1-6.

[12]祈永红，韩玉珠，李春秋，等.用基因枪将Bt毒蛋白基因转入玉米机转基因植株再生[J].中国科学B辑，1995，25（1）：71-76.

[13]SCHNEPF H，EHITELEY H R.Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，1981，78（5）：2893-2897.

[14]刘桂玲，陈举林，李平海.转基因玉米的研究进展与展望[J].中国农学通报，2004，20（4）：36-38.

[15]王国英，张宏，谢友菊，等.玉米胚性愈伤组织转化及转Bt基因植株的抗虫性[J].农业生物技术学报，1995（3）：50-53.

[16]王景雪，孙毅，崔贵梅，等.花粉介导法获得玉米转基因植株[J].植物学报，2001，43（3）：275-279.

[17]王良发，张守林，卢瑞乾，等.转基因技术在玉米育种中的运用[J].安徽农业科学，2014，42（31）：10875-10876.

[18]ZHANG Z Y，YANG L，ZHOU S F，et al.Improvement of resistance to maize dwarf mosaic virus mediated by transgenic RNA interference[J].J Biotechnol，2011，153（3/4）：181-187.

[19]CAO X L，LU Y G，DI D P，et al.Enhanced virus resistance in transgenic maize expressing a dsRNAspecific endoribonuclease gene from E.coli[J].Plos One，2013，8（4）：60829.

[20]VAN DER LINDE K，HEMETSBERGER C，KASTNER C，et al.A maize cystatin suppresses host immunity by inhibiting apoplastic cysteine proteases[J].Plant cell，2012，24（3）：1285-1300.

[21]张文河，赵倩，于静娟，等.转兔防御素基因（NP1）玉米植株的获得及其抗病性分析[J].农业生物技术学报，2003，11（4）：342-346.

[22]何锶洁，董伟，李慧芬，等.转甜菜碱醛脱氢酶基因玉米及其耐盐性研究[J].高技术通讯，1999（2）：50-52.

[23]刘岩，王国英，刘俊君，等.大肠杆菌gutD基因转入玉米及耐盐转基因植株的获得[J].中国科学（C辑），1998，28（6）：542-547.

[24]任晓燕，杜建中，孙毅.转AhCMO基因玉米后代的获得及耐盐性鉴定[J].分子植物育种，2013，11（3）：332-338.

[25]AMARA I，CAPELLADES M，LUEVID M D，et al.Enhanced water stress tolerance of transgenic maize plants overexpressing LEA Rah28 gene[J].J Plant Physiol，2013，170（9）：864-873

[26]WANG C R，YANG A F，YUE G D，et al.Enhanced expression of phospholipase C 1（ZmPLC1）improves drought tolerance in transgenic maize[J].Planta，2008，227（5）：1127-1140.

[27]BICAR E H，WENDY W C，VARAPOM S，et al.Transgenic maize endosperm containing a milk protein has improved amino acid balance[J].Transgenic research，2008，17：59-71.

[28]关淑艳，王丕武，刘广娜，等.玉米淀粉分支酶sbe2a基因反义载体的构建及其转基因初步研究[J].吉林农业大学学报，2009，31（4）：360-363.

[29]丁明忠，潘光堂，荣廷昭，等.大豆总DNA直接导入法培育优质高蛋白玉米材料的初步研究[C]//21世纪玉米遗传育种展望：玉米遗传育种国际学术讨论会文集.北京：中国农学会，2000：159-166.

[30]张秀君，刘俊起，赵倩，等.用基因枪将高赖氨酸基因导入玉米及转基因植株的检测[J].农业生物技术学报，1999，7（4）：363-367.

[31]孙越，刘秀霞，李丽莉，等.兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定[J].中国农业科学，2015，48（2）：215-228.

作者：张彦琴

转基因技术研究论文 篇2：

我国加强转基因生物技术研究私自种植将受严惩

中央农村工作领导小组办公室副主任韩俊前不久表示，今后我国要加强农业转基因生物技术研究、安全管理和科学普及，推动公众和媒体理性全面地看待转基因技术和产品。

韩俊是在国务院新闻办公室日前就《关于加大改革创新力度加快农业现代化建设的若干意见》解读等情况举行的发布会上作上述表示的。根据《意见》，我国将加强农业转基因生物技术研究、安全管理和科学普及。

据悉，我国现在已经批准进行商业化种植的转基因作物主要是棉花和木瓜。同时，我国批准进口了一些国外转基因农产品，主要为大豆，以及油菜籽、棉花和玉米。2014年我国进口大豆超过7100万吨，大部分是转基因的。

据介绍，我国已经建立了跟国际接轨的农业转基因生物技术安全管理的法律法规体系、技术规程体系和政府行政管理体系，覆盖了从研究、试验、生产、加工、进口许可到产品标识的各个环节。对于未经批准、私自种植的行为，行政主管部门一经发现，将依法给予严厉处置。

韩俊表示，今后我国将加强转基因科学普及，希望社会公众，包括媒体对转基因技术的发展历史、现状、安全性、风险，以及国内国外的安全管理体系能有全面客观的了解。“要揭开转基因技术神秘的面纱，在尊重科学的基础上，理性地看待转基因技术和产品。中国作为一个大国，农业转基因产品市场不能都让外国产品占领。”

作者：于文静　王宇

转基因技术研究论文 篇3：

抗虫转基因水稻检测技术研究综述

摘  要：近年来，随着抗虫转基因水稻研究的进一步发展，世界各地实验室在抗虫转基因水稻研究方面均有收获，抗虫转基因水稻检测随之成为众多科学家的关注点。该文综述了抗虫转基因水稻检测技术的研究进展，为进一步开展转基因水稻检测的研究工作提供参考。

关键词：抗虫 Tail-PCR;转基因水稻;基因芯片;检测技术

稻米是全世界近一半人口消费的主要粮食作物，对于人类的生存和发展起着极其重要的作用，是我国食用人口比重最大的粮食作物。研究表明，当前制约水稻稳产、高产以及稻米品质的主要是各类害虫，所以防治虫害成为了重中之重。在防治害虫时，使用生物防治手段，不仅制约因素多、还不易控制，而使用化学农药不仅破坏生态平衡、还可以使螟虫产生抗性;培育抗虫水稻新品种，增强水稻的抗虫性，是一种更经济环保的方法。然而，传统的抗虫水稻育种周期长，有限的遗传资源，不明确的抗虫机制，还会产生新的生物型害虫，导致抗虫性不稳定，极大地制约了水稻抗虫育种的进程。因此，利用基因工程技术获得转基因抗虫水稻，是水稻防虫侵害的最有希望和前途的方法。

1 抗虫转基因水稻简介

抗虫转基因水稻就是利用转基因技术将抗虫基因导入水稻的受体细胞中，使寄主在水稻细胞内抗虫基因得到表达并遗传，使水稻自身产生抗虫蛋白，进而形成抗虫的新型水稻品种。在水稻转基因抗虫研究中，被广泛应用的水稻抗虫基因是从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中发现的Bt基因。1989年，人类第一次培育转基因水稻植株，此植株是由中国农業科学院杨虹等将Bt基因利用原生质体电融合技术导入粳稻台北309的基因组DNA中培育出的新型水稻[1]。现至今已有多个实验室成功培育出转基因水稻新品种。金永梅等[2]将 Cry1C*、 Cry2A*这2个不同的Bt抗虫基因利用农杆菌介导法同时导入到水稻品种吉粳88中去，获得了二价抗虫转基因水稻。2005年华中农业大学张启发院士课题组，将水稻Actin启动子驱动的融合型Bt抗虫基因cry1A（b）/cry1A（c）导入籼型恢复63中，得到了一些基本不用药物防治螟虫危害的转化植株[3]。2009年底，2个由华中农业大学研发的抗虫转Bt基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”，首次获得农业部为转基因水稻颁发的安全证书，标志着转Bt基因水稻以成功进入中国。2015年1月5日，“转基因抗虫水稻“再次获得由农业部颁发的农业转基因生物安全证书（生产应用），2018年，转基因抗虫水稻华恢1号获得美国FDA的商业化许可。2002年，我国农业部和卫生部同时发布了《农业转基因生物标识管理办法》、《转基因食品卫生管理办法》2部法规，内容规定强制进行转基因食品标识[4-5]。表明抗虫转基因水稻的培育和应用需要转基因水稻的检测技术。就转基因基因检测技术来说，发达国家技术水平高于发展中国家，美国等发达国家向发展中国家出口了大量抗虫转基因产品。中国已经加入了WTO，必然面临着转基因产品贸易和安全监控的挑战[6-8]。

2 抗虫转基因水稻检测技术研究进展

抗虫转基因水稻检测主要内容是检测抗虫基因（Bt基因）是否存在以及含量，还要确定其是否能成为合格的转基因新品种等[9]。随着科技的不断发展，植物基因工程技术领域里不断研究出新的转基因植物检测技术，检测范围发展到DNA水平、RNA水平和蛋白质水平3个方向。检测方法主要有PCR检测方法、Souther杂交、Tail-PCR、基因芯片、RT-PCR检测、实时荧光定量PCR检测、Nouther杂交、ELISA方法、试纸条检测法等。

2.1 蛋白质水平检测

2.1.1 ELISA检测法 通过欧洲多个实验室研究结果可以确定，运用ELISA方法检测Bt蛋白含量结果可信度几乎达到100%，目前普遍应用ELISA检测法检测抗虫转基因水稻Bt蛋白含量。2018年黑龙江大学李荣田等使用ELISA方法检测出不同Bt基因在植物细胞蛋白质层面的表达量（或最高表达量）是有差别的[10]。ELISA检测法是通过实验结果是否发生颜色反应及生成物质颜色变化的深浅来判定检测信号的存在和含量的。抗虫转基因水稻表达的目标蛋白（抗原）和抗体存在特异性反应，结合了酶和底物之间高效催化作用，也就是说加入酶催化底物后，底物就会发生反应并且生成有颜色的物质，酶含量和生成物质颜色深浅呈正比，间接显示了目标蛋白含量的多少。因此，ELISA检测法即可以定性检测抗虫基因是否存在，也可以定量分析抗虫基因表达量[11]。该方法现在已经推广试剂盒的应用，可快速实验并且准确度高。

2.1.2 试纸条法 试纸条法是将含有特异抗体的蛋白提取液交联到试纸条和有颜色物质上，当纸上抗体和蛋白提取液中特异抗原结合之后，再与特异的带有颜色的抗体进行反应，于是就在试纸条上出现了三明治状的色带。假如没有抗原，就没有三明治色带。中国科学院王彤彤[12]采用快速检测试纸条，仅仅需要5min就可以准确测定出抗虫转基因水稻中Bt蛋白含量。由此可见，试纸条法可以在现场进行检验或初筛时，不需特殊的仪器设备就可以完成实验，将来有着较好的应用前景。

2.2 RNA水平检测

2.2.1 半定量RT-PCR检测 这是一种通过检测特异性mRNA的灵敏度来分析基因表达的快速方法。此方法首先提取抗虫转基因水稻总RNA，然后以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA;再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达产物，最后通过限制性内切酶酶解或者核苷酸测序来进一步鉴定PCR产物[13]。半定量RT-PCR技术虽然快速简便，但是它是一种粗略的估计基因表达量的方法，若要精确计算基因表达量，还需要定量PCR技术。

2.2.2 实时荧光定量PCR检测 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统PCR中不能定量检测的局限性，其原理是在普通PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，然后通过标准曲线就可以对未知模板进行定量分析[14]。中国农业科学院苏长青博士建立了转基因抗虫水稻科丰8号实时荧光定量PCR检测方法，并用此方法确定了科丰8号品系外源抗虫基因为10拷贝[15]。因此，实时荧光定量PCR技术是外源基因定性定量分析先进技术，其优势在于准确性高、假阳性低、特异性好、灵敏度高。因为应用荧光信号检测对样品初始模板浓度进行定量，能够使结果误差小;过程中操作简单、自动化程度高;整个反应在闭管条件下一步反应完成，既不会交叉污染，更保护了实验环境[16]。

2.2.3 Northern杂交 Northern杂交是一种通过检测RNA的表达水平来检测外源抗虫基 因表达的方法。假如整合到水稻染色体上的外源抗虫基因能正常表达，那么转化水稻植株细胞内有其特异转录产物生成。首先，将提取的植物总RNA用变性凝胶电泳分离;然后，将凝胶上不同排布的RNA分子按照原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，特异性标记的探针会与膜上的同源序列进行杂交;最后，通过探针的标记性质就可以检测出杂交体，而且转录的特异性RNA分子量的大小可以直接通过杂交体在膜上的位置来判断。若无杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到水稻细胞染色体上，只是外源抗虫基因在某些部位和特定生理状态下并未有效表达，不能说明外源基因不表达，需要接下来的实验进一步判断[17]。

2.3 DNA水平检测

2.3.1 简单PCR技术 简单PCR技术是抗虫转基因水稻外源基因检测最成熟、基础的一项检测。黄晓西[18]运用简单PCR技術检测了转新型Bt基因抗虫水稻146株，转化率达32.8%。其原理是体外利用极少量DNA模板酶促合成特异DNA片段，设计特异性引物，添加催化DNA聚合酶，经过高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，达到目的基因片段快速扩增的过程。简单PCR技术只能满足一种或少数几个转基因品种的检测需要，并且检测结果一旦出现假阳性的缺陷，就会导致工作程序重复验证，耗费大量时间，现在除简单的定性鉴定之外，已不能满足当前工作中快速通关的要求。

2.3.2 多重PCR技术 多重PCR技术是在常规PCR基础上发展出能够同时扩增多个核算片段的一种新型PCR技术。在应用时要求使用至少两对熔解温度相近、彼此不发生相互作用的2队引物，并且扩增产物分子量大小即相近又能通过电泳分离。反映到植物基因工程应用，水稻中的内参基因、外源基因、355启动子、NOS终止子可以在同一个PCR体系中同时用多套引物分别扩增出来。敖金霞[19]建立了适用转基因大豆、玉米和水稻深加工产品定性检测的5重巢式PCR检测方法，其检测灵敏度为0.005%。此方法简化了操作程序，既节省了模板DNA，又减少费用，是一种非常有发展前景的定性PCR检测方法[20]。

2.3.3 Southern Blot杂交 Southern Blot通常被用来鉴定外源基因在抗虫转基因水稻中的整合情况，即检测抗虫基因整合在水稻基因组中的拷贝数情况。其基本原理是首先用限制性内切酶将水稻基因组酶切消化，标记目的基因片段为探针备用，然后将消化的基因组DNA与标记好探针在杂交膜上进行杂交，包含目的基因的基因组片段与探针会因为发生同源重组而显示杂交信号，目标基因拷贝数就自然得出。因此，金永梅[21]等利用Southern Blot技术检测出单拷贝抗虫水稻植株，以此为前提，确定出外源抗虫基因的插入位点。该技术虽然操作程序复杂，周期长和成本高，但是因其高度准备性，因此一直以来都被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法[22-24]。

2.3.4 Tail-PCR Tail-PCR是可以确定外源抗虫基因它插入水稻基因组位置的技术。吉林省农业科学院金咏梅马瑞等利用Tail-PCR方法，将转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号的左、右边界旁侧序列，依据旁侧序列确定T-DNA在基因组中的插入位点，并建立吉生粳3号品系特异性 PCR方法。利用农杆菌遗传转化方法导入的外源抗虫基因在宿主水稻基因组的插入位点是随机的，每个转化事件中外源抗虫基因和水稻基因组DNA拼接组成的旁侧序列具有唯一性。T-DNA整合过程是一个复杂的异常重组过程，包括水稻基因组整合位点的删除和重复，T-DNA序列的删除和重复，以及水稻染色体上的易位和到位等现象。染色体步移（Chromosomewalking）是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。分离旁侧序列的染色体步移方法主要采用染色体步移技术中的半随机引物PCR策略。半随机引物PCR策略中的热不对称交错PCR（Tail-PCR）是将目标序列旁的已知序列中设计的3个嵌套的特定引物（specialprimerSP1，SP2，SP3）分别与1个具有低Tm值的随机简并引物相结合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物的方法。根据所分离的旁侧序列，通过与NCBI 的比对分析确定T-DNA在基因组中的整合位点。该序列是不同转基因作物品系的特异性身份标识，根据其建立的品系特异性检测方法能快速、准确地鉴定不同的转基因作物品系[25-26]。利用Tail-PCR技术检测抗虫转基因水稻，保证了抗虫转基因水稻检测的准确性和专一性，为监管抗虫转基因水稻的育种、生产、加工和销售提供了可靠的技术支撑[27-28]。利用外源抗虫基因在水稻基因组上整合位点的唯一性，可以建立抗虫转基因水稻品系特异性检测方法，该方法可以根据外源抗虫基因与旁侧水稻基因组连接区序列为靶标设计引物，使用Tail-PCR方法扩增出对照和抗虫转基因品系特异的PCR条带[29]。目前，我国抗虫转基因水稻安全试验阶段过程中，要求提供转入外源抗虫基因提供插入位点碱基序列。因此，Tail-PCR技术是转基因抗虫水稻商品化不可或缺的一项技术。

2.3.5 基因芯片 当常规的一些检测方法需要操作繁琐的转膜、杂交等，费用高同时不能快速精准的检测，有些方法更不适合大批量样品的检测。最近几年发展起来一种专门用来检测核酸的生物芯片，亦称基因芯片，是多学科交叉融合产生的高新技术产品。基因芯片是利用核酸互补杂交原理研制的，其原理是在一块固相支持介质表面固定已知序列的DNA/RNA片断，形成DNA/RNA微矩阵，即核算探针;将荧光标记分子通过体外转录或扩增等技术掺入到样品RNA或DNA当中，与位于微阵列上的已知DNA核酸探针序列杂交，通过荧光显影法等对杂交信号强度进行检测分析，获得序列完全互补的探针序列，再用计算机软件比较和综合分析数据后，即可获得样品中分子数量和大量基因表达信息[30]。目前，将通用的报告基因、抗虫基因、启动子和终止子的特异片断制成检测芯片与待测产品的DNA进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析，就可以判断待测样品是否为抗虫转基因水稻。

3 小结与展望

转基因抗虫水稻检测涉及到的检测内容主要是蛋白质检测和核酸检测。蛋白质检测主要利用抗原抗体特异性反应原理进行，实验操作简便、快速，结果准确可靠。在核算检测方面，PCR技术经过不断优化后，定性、定量检测检测范围更广，具有特异性好，灵敏度高等优点被广泛使用。近年来发展的Tail-PCR技术，虽然建立在Southern Blot技术基础之上，可是能够定位抗虫基因的位置，这在技术领域上是一大突破。基因芯片技术虽然成本高，数据分析复杂，但是其优势在于高密度、高通量，用量少，快速而且准确。因此，今后转基因检测技术研究的发展趋势必然是将各种检测技术结合起来，建立更加高效、快速、便捷、高通量、低成本的新检测方法。

参考文献

[1]杨虹，李家新.苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因导入水稻原生质体后获得转基因植株[J].中国农业科学，1989，22（5）︰1-5.

[2]金永梅，马瑞，于志晶，等.利用农杆菌介导的共转化法获得含双 Bt基因转基因水稻[J].吉林农业科学，2014，（5）︰26-29.

[3]陈浩.三种Bt基因（cry1Ac、cry2A*和cry9C*）抗虫水稻的培育及评价[D].武汉：华中农业大学，2005.

[4]农业部农业转基因生物安全管理办公室.农业转基因生物标识管理办法[EB/OL].[2010-11-12].htto：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/zefg/2010007/t20100117-1601302.htm.

[5]中华人民共和国卫生部令.转基因食品卫生管理办法[EB/OL].[2011-11-12].htto：//www.chingrain.gov.cn/n16/nll07/n2309/n2309/n2609/90945.html.

[6]邓汉超.转基因植物DNA成分检测技术研究进展[J].中国种业，2016（11）：19-21.

[7]侯大军，李洪军.转基因食品的发展历史与未来趋势[J].四川食品与发酵，2007（5）：24-27.

[8]杨铭铎，张春梅，华庆，等.转基因食品快速检测技术的研究进展[J].食品科学，2004，25（11）：424-427.

[9]唐丁，郭龙彪，钱前.水稻转基因技术与转基因水稻[J].中国稻米，2005（5）：5-7.

[10]李荣田，王宇新，等.转cry1C*及cry2A*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性[J].作物学报，2018，44（12）：1829-1836.

[11]LIPPM.IUPAC.collaborative trial study of a method to deteet genetieally mod ified oybeans and maize in dried Powder.JAOAC Int，1999，82：923-928.

[12]王彤彤.农杆菌介导转抗虫基因粳稻转化材料的培育[D].北京：中国农业科学院，2014.

[13]吴影.Bt基因的组织特异性表达及转基因水稻分子检测方法的研究[D].合肥：安徽农业大学，2006.

[14]柳爱春，赵芸，刘超，等.双重一步法RT-PCR检测两种主要兰花病毒[J].杭州农业与科技学报，2009，03.

[15]苏长青.适合转基因抗虫水稻和棉花PCR检测标准质粒的构建及适用[D].北京：中国农业科学院，2011.

[16]蒋春燕.实时荧光定量PCR技术[J].动物医学进展，2005，26（12）：97-101.

[17]宫本贺.转基因苾蔴的分子检测和抗虫鉴定[D].北京：中国农业科学院，2010.

[18]黄小西.转新型Bt基因水稻的获得和初步筛选[D].雅安：四川农业大学，2017.

[19]敖金霞，高学军，于艳波，等.转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测[J].中国农业大学学报，2010（2）：93-99.

[20]N.Crickmore，D.R.Zeigler，J.Feitelson，et al.Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins[J].Microbiologyand molecular biology reviews，1998，62（3）： 807-813.

[21]金永梅，馬瑞.转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测[J].生物技术通报，2018，07：88.

[22]Xu D，Xue Q，McElroy D.Constitutive expression of a cowpea trypsin inhibitor gene，CpTi，in transgenic rice plants confers resis-tance to two major rice insect pests[J].Mol Breeding，1996，2：167-173.

[23]Lee S I，Lee S H，Koo J C，et al.Soybean Kunitz trypsin inhibitor （SKTI） confers resistance to the brown planthopper （Nilaparvata lugens Stal） in transgenic rice[J].Mol Breed，1999，5： 1-9.

[24]李桂英，許新萍，李宝健，等.水稻抗虫基因工程新进展[M].中国稻米，2004，4：12-13.

[25]Dong Y，Jin X，Tang Q，el al.Development and Event-specifiec detection of transgenic glyphosate-resisant rice expressing the G2-EPSPS gen[J].Front Plant SCI.，2017，8：885.

[26]Yang L，Yang Y，Jin W，et al.Development interlaboratories validation of event-specific real-time  PCR method for geneticaiiy modified rice G6HI event [J].J Agric Food Chem.，2018，66（30）：8179-8186.

[27]张大兵，郭金超.转基因生物及其产品检测技术和标准化[J].生命科学，2011，23（2）：195-204.

[28]魏岁军，邓力华，肖国樱.转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立[J].农业生物技术学报，2014，22（5）：621-631.

[29]金永梅，马瑞，于志晶，等.转基因水稻吉生粳2号的外源基因旁侧序列分离及事件特异性PCR检测方法[J].东北农业科学，2016，41（1）：14-19.

[30]Clark M.S[英]，主编.顾红雅，瞿礼嘉，主译.植物分子生物学[M].北京：高等教育出版社，1998：21-41.

（责编：张宏民）

作者：向阳