农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展（精选6篇）

篇1：农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

农杆菌介导的floral-dip转基因方法是近年发展起来的一种简便、快速、高效、重复性好、稳定性高的.非组织培养转基因方法.介绍了该方法的发展、转化原理、转化条件、后代遗传学分析,并讨论了其存在的问题,展望了其在基因工程中的应用前景.

作 者：韦献雅 付绍红 牛应泽 WEI Xian-Ya FU Shao-Hong NIU Ying-Ze 作者单位：韦献雅,牛应泽,WEI Xian-Ya,NIU Ying-Ze(四川农业大学油菜研究中心,四川,雅安625014)

付绍红,FU Shao-Hong(四川农业大学油菜研究中心,四川,雅安625014;成都市第二农业科学研究所,国家油菜改良四川成都分中心,四川,成都611130)

刊 名：中国油料作物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES年，卷(期)：28(3)分类号：Q943.2关键词：农杆菌介导 floral-dip 基因转化

篇2：农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

以沙田柚上胚轴为对象,进行了农杆菌介导的`抗菌肽shivaA基因转入沙田柚影响因素研究.研究结果表明:转化中抑菌抗菌素以羧苄青霉素为首选,最佳转化条件为:菌液稀释至OD6000.5,浸泡时间10 min,共培养3 d,卡那霉素起始选择浓度50 μg/mL.农杆菌再悬浮液与共培养基中加入150 μmol/L阿魏酸可提高转化频率.PCR与Southern杂交证明,外源基因已转入沙田柚基因组中.

作 者：韩美丽 陆荣生 吴耀军 杜晓莉 HAN Mei-li LU Rong-sheng WU Yao-jun DU Xiao-li 作者单位：韩美丽,陆荣生,杜晓莉,HAN Mei-li,LU Rong-sheng,DU Xiao-li(广西农业科学院,植物保护研究所,广西,南宁,530007)

吴耀军,WU Yao-jun(广西林业科学院,广西,南宁,530001)

篇3：农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

1.1 大豆的概述

大豆, 是最重要的高蛋白油料经济作物之一, 但大面积盐碱、干旱土地的存在严重影响到人类对大豆这种农业经济作物的需求。所以利用基因工程手段改良大豆的耐盐碱、干旱性状, 达到利用盐碱、干旱土地的目的已经成为当前研究热点。

1.2 micro RNAs的概述

Micro RNA (mi RNA) 是一类在生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA, 长度约为21~24nt。

1.3 植物遗传转化方法

现代生物技术的研究和发展为通过基因工程改良植物品系提供了必要的前提, 目前应用于大豆遗传转化的方法主要有基因枪转化法、农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导转化 (瞬时转染) 、脂质体介导原生质体转化等[1]。其中应用的最广泛的是基因枪法和农杆菌介导法[2]。农杆菌介导的遗传转化方法, 是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性从而把外援基因导入植物基因组的方法。因为其拷贝数低, 整合完整, 遗传比较稳定, 受目的基因分子量的影响较小以及操作简便, 广泛的应用于植物的遗传转化[3,4]。

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料选择

大豆品种为吉育72。

2.1.2 酶与化学试剂

DNA Marker购自Ta Ka Ra公司, 根癌农杆菌EHA105由本实验室自己提供。

2.2 实验方法

2.2.1 农杆菌介导mi RNA1510a基因转化大豆

2.2.1. 1 大豆转化具体过程

无菌受体制备:用吉育72大豆种子用次氯酸钠与盐酸进行过夜灭菌消毒处理。

种子萌发培养:将灭菌消毒好的大豆无菌外植体放置于装有无菌水的玻璃器皿中浸泡20~30min, 放入无菌培养皿中备用。暗培养3~7d。

农杆菌侵染子叶节

a农杆菌的培养:取出保好的菌液10~15µl, 加入50m1YEP液体培养基中, 放置于28℃, 180rpm摇床, 过夜培养。将菌液加入到50ml离心管中, 置于离心机中4500rpm, 离心20min, 倒掉滤液, 保留沉淀, 用共培养液体培养基溶解沉淀, 用于转化。

b农杆菌侵染及子叶节转化:用灭菌后的刀和镊子将萌发充分的大豆外植体切开, 在下方接近生长点处垂直于外植体边缘轻轻划几下, 外植体在远离生长点去弃去1/3备用。将切好的外植体倒入分装好的农杆菌液体中, 侵染20~30min。

共培养:取出侵入农杆菌的大豆外植体, 放置于装有无菌滤纸的平板上, 吸干多余附着的农杆菌。将共培养培养基上放入无菌滤纸, 然后用灭菌后的镊子将大豆外植体生长点附近划有刀口的一面朝下, 放置于无菌滤纸上, 封口, 暗培养2~3d。

生芽及芽伸长培养:共培养2~3d后, 在超净工作台中, 用灭菌后的镊子取出大豆外植体, 将生长点附近划有刀口处朝下, 45°角倾斜将外植体插入加有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素的生芽培养基中, 封口, 光照培养待生长点处长出子叶。观察在含有BASTA的生芽培养基中, 存活下来的植株, 就是具有抗BASTA抗性植株。

生根培养:等到外植体生长点处的真叶完全长成, 不定芽长至1cm以上时, 可以将生芽培养的外植体转移到生根培养基中, 放置于24℃/20℃16h光照的环境中培养15d左右, 待长出不定根。

炼苗及移栽:待再生植株根系计较发达时, 从培养基中将其拿出, 移栽到灭菌后的蛭石和土壤的混合土花盆中, 若获得转基因植株, 可用于后续的分析实验。

2.2.2 转基因大豆初步检测

提取转基因大豆基因组DNA, 进行PCR检测, PCR扩增产物用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测, 初步确定mi RNA1510a基因已转入大豆中。

2.2.2. 1 大豆基因组DNA的提取

利用TPS法快速提取植物DNA:剪取新鲜大豆叶片2cm, 放入1.5ml的离心管中, 加入400µl TPS提取液, 用1ml枪头捣碎。将捣碎的叶片放入75℃水浴20min。12000rpm离心10min。将上清转入1支新的1.5ml离心管, 加入等体积异丙醇, 沉淀一会, 5000rpm离心10min。弃上清, 保留沉淀, 加入200µl70%乙醇, 5000rpm离心5min。弃上清, 将沉淀干燥, 加灭菌水30~40ul回溶DNA, 放于-20℃备用。

2.2.2. 2 PCR检测

将提取好的mi RNA1510a转基因大豆基因组DNA作为模板, 以设计好的Bar基因引物F和R为引物进行PCR扩增。设置3个对照组, 分别为:Maker对照;N阴性对照;P以质粒为模板的阳性对照。整个反应体系中, 其他组成成分相同。

2.2.2. 3 琼脂糖凝胶电泳

PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测, 步骤如下:

制备1%琼脂糖凝胶 (大胶50ml, 小胶30ml) :称取0.3g琼脂糖于100ml锥形瓶中, 加入30ml (1×TAE) , 塞上瓶塞。微波炉加热2min, 待琼脂糖全部融化后, 取出摇匀, 室温冷却至约60℃。

胶板的制备:将电泳胶模置于电泳槽中水平位置, 固定好制胶梳子。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时, 滴加入1/10000核酸染料, 缓慢倒入电泳胶模中, 使琼脂糖凝胶的厚度约在3~5mm。室温下静置直至凝胶完全凝固, 垂直轻拔出梳子, 将凝胶及内槽一同放入电泳槽中。往电泳槽中添加1×TAE电泳缓冲液直至没过胶板3mm以上为止。

加样:将7ul DNA样品和3µl的6×Loading Buffer混合均匀。用微量移液器将混合液小心加入至加样孔内, 再加入适当大小的DNA marker。

电泳:电泳时DNA从负极向正极移动。电泳结束后戴一次性塑料手套小心取出凝胶, 尽可能地将电泳缓冲液淋干, 凝胶成像系统拍摄照片保存。

3 结果与分析

3.1 农杆菌介导

mi RNA1510a基因转化Micro RNA1510a基因向大豆的转化过程中, 经过预培养, 侵染, 共培养后, 转化的大豆生长旺盛。然后将转化后的大豆在含有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素 (抑制农杆菌生长) 的生芽培养基中上进行选择培养, 以及生根培养, 移栽等, 最后获得24株转基因大豆抗性苗。

3.2 转基因大豆PCR及电泳检测结果

由BASTA筛选得到的阳性植株, 并不能充分说明就是转基因植株。因为不同再生个体间的BASTA抗性也有差异, 所以需用分子生物学手段来检测。待转基因大豆长到5~6片叶片时, 对大豆的抗性植株进行检测。提取转基因大豆基因组DNA, 将提取好的mi RNA1510a转基因大豆基因组DNA作为模板, 以设计好的Bar基因引物F和R为引物进行PCR扩增, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。结果表明, 经PCR检测, 共有3株转基因大豆在959bp处出现了特异性扩增条带, 说明目的基因mi RNA1510a已转入吉育72大豆中。

4 讨论

4.1 本研究采

用以大豆子叶节为外植体的农杆菌介导遗传转化体系, 具有操作简便, 外植体的获得不受季节影响, 组培周期比较短等特点, 与基因枪转化和传统的农杆菌介导的大豆体细胞胚再生系统的方法相比, 相对比较容易操作难度较小, 成本更低, 转化周期大大缩短, 分化效率高, 获得抗性植株比较容易。本实验通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将mi RNA1510a转入大豆, 最终经PCR鉴定获得3株T0代转基因阳性植株。

4.2 本研究转

化的mi RNA1510a基因是生物反应器中心抗逆实验室mi RNA课题组前期从大豆逆境胁迫mi RNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA, 并成功构建mi RNA1510a表达载体, 利用农杆菌介导的遗传转化方法将mi RNA1510a基因转入大豆中。但目前获得的只是初步结果, 为了获得有应用前景的转基因大豆材料, 还需扩大后代群体的规模, 从中筛选出稳定遗传、综合性状良好、可用于生产实践的转基因大豆新品种, 期望mi RNA1510a基因可真正用来广泛改良大豆的抗逆性。

4.3 基因的转

化常常伴随着假阳性的产生, 本实验获得24株大豆幼苗, 经PCR鉴定只有3株有目的条带, 假阳性率较高为87.5%。而假阳性产生的可能原因有:外植体的再生部位与选择培养基未充分接触;在继代过程中目的基因丢失;转化细胞对非转化细胞的滋养作用;在转化过程中目的基因没有完全整合到植物基因组中;培养基中BASTA分布不均匀;实验中的BASTA的筛选浓度为10mg/l, 可能比较低。因此后来的PCR检测非常重要, 可以初步排除假阳性植株。

5 结论

5.1 采用大豆

子叶节作为受体的转化系统, 具有比较明显的优势, 操作容易, 不需要太多的繁琐步骤;分化效率及转化率较高;外植体的获得不受季节影响;转化周期相对较短, 从组培开始到最终获得转基因苗只需要大约3个月的时间。

5.2 本研究以

吉育72大豆为材料, 利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将mi RNA1510a基因转入大豆中。共计侵染200个大豆子叶节外植体, 最后得到24株大豆幼苗。通过对所获得大豆幼苗进行PCR检测, 最终获得3株T0代转基因阳性植株, 转化率为1.5%, 表明mi RNA1510a基因已成功转入大豆。

摘要：MicroRNA (miRNA) 是生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA, 并被证明在植物抵抗生物和非生物胁迫中起着重要作用。MiRNA1510a是课题组前期从大豆逆境胁迫miRNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA。本研究在构建miRNA1510a表达载体基础上, 以大豆品种吉育72为材料, 利用农杆菌介导的子叶节遗传转化法将miRNA1510a基因转入大豆中。通过PCR检测, 最终确定有3株阳性植株, 转化率为1.5%。该结果表明miRNA1510a基因已成功转入大豆, 为进一步分析miRNA1510a调控大豆抗逆的分子机制奠定了基础。

关键词：大豆,miRNA1510a基因,农杆菌介导法,PCR检测

参考文献

[1]Bidney D, Scelonge C.Microprojectile bombardment of plant tissue increase transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Mol Boi1.1992, 18:301-313.

[2]Maeshima M.Vacuolar H+-pyrophosphatase[J].Biochim BiophysActa.2000, 1465 (1) :37-51.

[3]Chan L.Expression and inheritance of multiple transgenes in rice Plants[J].Nature Biotechnlogy.1998, 16:1060-1064.

篇4：农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

百脉根(Lotus corniculatus L.)是世界著名的多年生优良豆科牧草之一,也是常见的庭院观赏植物.本文通过比较不同根癌农杆菌转化百脉根的效率和优化百脉根子叶遗传转化的条件,建立了一套有效的`遗传转化体系.实验结果表明,EHA105作为宿主菌对百脉根进行转化较LBA4404和GV3101具有更高的转化率;5 d苗龄的子叶最适合作为转化的外植体;浸染过程中0.05 MPa负压处理5 mim以及在共培养培养基中添加20 mg/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经3次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PCR-Southern杂交,证实PCR产物真实可靠,表明外源基因已整合进入百脉根基因组中.

作 者：孙艳香 杨红梅 耿云红 朱晔荣 王宁宁 王勇 Sun Yanxiang Yang Hongmei Geng Yunhong Zhu Yerong Wang Ningning Wang Yong 作者单位：孙艳香,Sun Yanxiang(南开大学,生命科学学院,天津,300071;河北廊坊师范学院,生物系,河北,廊坊,060051)

杨红梅,耿云红,朱晔荣,王宁宁,Yang Hongmei,Geng Yunhong,Zhu Yerong,Wang Ningning(南开大学,生命科学学院,天津,300071)

王勇,Wang Yong(南开大学,生命科学学院,天津,300071;天津市农业生物技术研究中心,天津,300192)

篇5：农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

在高等植物体内,作为渗透调节物质的甜菜碱经两步酶催化得到,即胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶(cholinemonooxygenase, CMO)[3,4],催化第二步反应的酶是甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase, BADH)[5,6,7],这两种酶是控制甜菜碱合成的两个关键酶。研究表明CMO基因的导入可明显提高转基因植株体内甜菜碱的合成和积累[8]。我们从菠菜中克隆了CMO基因并构建了强组成型表达启动子CaMV 35S和逆境诱导表达启动子rd29A驱动的CMO基因表达载体[9],本研究将其导入两个对干旱胁迫较敏感的马铃薯栽培品种中,以期研究外源CMO基因对马铃薯抗旱耐盐性的影响,从而为进一步培育马铃薯抗旱耐盐新种质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和载体

以马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培品种夏波蒂(Shepody)和费乌瑞它(Favorita)为实验材料。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为LBA4404, 抗性筛选剂为利福平(Rif), 植物表达载体为pBI-CMO(CaMV 35S启动子驱动的CMO基因)和pBIr-CMO(rd29A启动子驱动的CMO基因)[9], 抗性标记为卡那霉素(Kan)(图1和2)。

1.1.2 试剂

卡那霉素、羧苄青霉素、利福平购自兰州鹏程公司,吲哚乙酸、玉米素、 赤霉素购自Sigma公司,Taq DNA聚合酶、6-苄氨基嘌呤购自上海生物工程公司,其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 受体材料的繁殖

将夏波蒂(Shepody)和费乌瑞它(Favorita)脱毒试管苗在无菌条件下剪成带有2个腋芽的茎段,接种在附加3%蔗糖和0.45%琼脂的固体MS培养基上。用150ml三角瓶培养,每瓶装30ml固体培养基,接种7个茎段,在(20±2)℃、2 000 lx光照下培养,每3～4w继代繁殖1次。

1.2.2 试管薯的诱导

固体培养法诱导:将繁殖的试管苗剪成带有2个腋芽的茎段并接种到附加8%蔗糖和0.45%琼脂的固体MS培养基上诱导结薯。每个三角瓶内接种7个茎段,内装50ml培养基,在(20±2)℃、2 000lx的光照下培养2w,然后转移至暗中于(20±2)℃条件下培养6～8w后可获得试管薯。

液体培养法诱导:将繁殖的试管苗接种在附加3%蔗糖的MS液体培养基中生长2～3w后,倒出三角瓶中的液体培养基,加入50ml附加8%蔗糖的MS液体培养基,置于暗处在(20±2)℃条件下诱导,约6w后可获得试管薯。

1.2.3 试管薯的遗传转化与植株再生

1.2.3.1 农杆菌工程菌液的制备

选取新鲜单菌落接种于50ml附加有50mg/L卡那霉素(Kan)和50mg/L利福平的LB液体培养基中,于28℃、240r/min避光振荡培养至对数生长期,然后转入无菌离心管中,于5 000r/min离心6min,收集菌体用液体MS培养基重新悬浮即可用于转化。

1.2.3.2 马铃薯的遗传转化和植株再生

将直径为0.5cm左右的试管薯从三角瓶里取出后切成厚度为1～2mm左右的薄片,在上述农杆菌菌液中浸泡10min,取出后用无菌滤纸吸干表面菌液,转入附加1mg/L IAA+0.2mg/L GA3+0.5mg/L 6-BA+2mg/L ZT的固体MS分化培养基中,于28℃黑暗共培养2 d。暗培养完毕后,将薯片转移到附加50mg/L Kan和500 mg/L羧苄青霉素(Carb)的相同培养基上,置于光照度0、1 000、2 000和3 000 lx、光周期16h/d、温度(24±1)℃的条件下诱导芽的分化。待芽长1 cm时切下转入附加50mg/L Kan和200 mg/L Carb的MS培养基上,进行生根筛选并扩繁。

1.2.4 转基因马铃薯植株PCR检测

将转化植株和对照植株的叶片用CTAB法提取植物总DNA。参照Sambrook S等[10]的方法对抗性植株进行PCR检测。以nptII基因(抗性选择标记基因)的两个引物5’-GCTAT-GACTGGGCACAACAG-3’和5’-ATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’进行PCR扩增,预期片段大小为676 bp。反应程序为:94℃ 3min,94℃ 45s,60℃ 45s,72℃ 1min,循环35次,72℃ 5min,4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

2 结果与分析

2.1 马铃薯试管薯的诱导

试管薯的诱导结果表明,经过液体培养基培养的试管薯在转入黑暗环境下4w后开始大量结薯,6～8w后最适宜做为转化的受体材料;而经固体培养基诱导的试管薯,经过6w后才开始大量结薯。所以采用液体培养基诱导试管薯的方法可以提高结薯的数量和大薯的数量。但在实验中也发现液体培养基容易污染,且培养液会使部分试管苗窒息死亡。相对于Favorita这个品种,Shepody的试管苗长的强壮(图3),且获得的试管薯的大薯数量多,但试管薯的总个数少于Favorita。

2.2 转基因植株的获得

试管薯薄片经农杆菌侵染和共培养后,转入附加50mg/L Kan和200mg/L Carb的的芽分化培养基中,1w后薯片开始膨大变绿,4w后外植体分化长出绿色小芽(图4),至抗性芽长到0.5～1cm时,切下转入附含50mg/L Kan的生根培养基中诱导生根,进而获得完整的转化植株。未经转化的对照植株在50mg/L Kan选择压下不生根(图5)。经愈伤组织培养和诱导生根两个阶段的筛选,获得Kan抗性再生植株。

2.3 光照强度对试管薯遗传转化的影响

对光照强度对马铃薯试管薯遗传转化的影响研究表明,在诱导芽分化的过程中,必须保证充足的光照强度,否则会导致愈伤组织生成,芽分化过程缓慢和污染的几率增大。由表1可以看出,在光照强度为0lx时,在接种的试管薯片上没有抗性芽长出,试管薯的遗传转化率为0,光照强度为1 000lx时,试管薯的遗传转化效率为28%,当光照强度达到2 000 lx时,试管薯的遗传转化效率达到最高值51%,然而,当把光照强度提高到3 000 lx时,转化效率又有所下降,为46%,但差异不是很大。结果表明,马铃薯试管薯遗传转化效率最高时的光照强度为2 000 lx,在该光照强度下试管薯遗传转化的效率达到51%。

1.非转化植株在kan培养基上未生根;2-4.转化植株在kan培养基上生根。1.Un-rooting of untransformed plants on medium containing kanamycin;2-4.Rooting of transformed plants on medium containing kanamycin.

2.4 转基因植株的PCR检测

为了证明CMO基因是否整合到马铃薯基因组中,以转基因植株叶片的总DNA为模板,进行PCR扩增。扩增产物的电泳分析结果表明,转化植株可以扩增到676 bp的特异性条带,未转化植株无该条带的产生(图6),从而初步证明再生植株为转基因植株。

M.DNAmarker(500bp laddermarker);1.未转基因植株;2-6.转基因植株。M.DNAmarker(500bp ladde rmarker);1.non-transgenic plants;2-6.transgenic plants.

3 讨论

目前,通过基因工程已获得了一些抗病毒、抗真菌、抗细菌、抗虫、抗除草剂、品质改良等转基因马铃薯新品系[11]。司怀军等[12]以鄂马铃薯3号和甘农薯2号的试管薯薄片为外植体进行遗传转化建立了高效率转化体系。本试验的研究结果再次表明试管薯是理想的马铃薯遗传转化受体材料,转基因技术在培育作物新品种方面具有很高的潜力,而且操作简便、高效的特点使其在农业生产中的前景会更加广阔。

篇6：农杆菌介导floral-dip转基因方法研究进展

在棉花转基因技术体系的建立及应用的过程中, 农杆菌介导转化是一种重要的研究方法。1987 年, Umbeck等第1 次利用农杆菌转化方法成功地获得了导入外源基因的棉花, 并获得了成功。随后在1994 年, 我国研究人员首次建立了海岛棉胚性愈伤组织的转基因体系诱导条件, 获得了6 个海岛棉品种胚性愈伤组织[2]。在随后的20 多年里棉花转基因研究取得较大的进展。本文围绕近20 年来在构建海岛棉遗传转化体系过程中常使用的转化方法及其影响因素进行概述, 寄希为海岛棉转基因体系的研究提供新思路。

1农杆菌介导抗虫基因转化海岛棉的研究进展

1.1 海岛棉常用的转化方法

自1983 年转基因植物问世以来, 经过近20 多年的发展, 根据转化机制不同, 植物遗传转化可分为10 多种不同的方法, 包括农杆菌介导法、病毒载体法、基因枪法、电激法、显微注射法、花粉管通道法等多种类型。而在棉花中, 农杆菌介导的转化是最常用的方法之一。目前, 由于根癌农杆菌和发根农杆菌生长迅速, 不结球, 转化中易操作等, 根癌农杆菌和发根农杆菌介导的遗传转化系统常用于研究海岛棉遗传转化体系。

1.2 根癌农杆菌介导的遗传转化系统

根癌农杆菌是存在于泥土中的细菌, 属革兰氏阴性菌, 它能够趋化性地侵染大多数双子叶植物的受伤部位, 从而引发植物的根瘤病。自1997 年, Chilton等首次证明根癌农杆菌Ti质粒的一部分可以转入植物细胞并且能够整合到植物染色体上以来, 棉花农杆菌介导高效转化体系也随之建立。Sakhanokho等以海岛棉Pima为实验对象, 建立了海岛棉的高频率胚性愈伤系, 最终得到到了转基因再生植株。2008 年贺雅婷[3]获得了成功建立起遗传转化再生体系的新海16 号海岛棉品种。2011 年, 周丽容[4]在以新海30 和新海16 建立了转抗虫基因到海岛棉的体系, 用下胚轴做外植体, 最终得到了抗虫植株。2014 年, 魏延宏[5]等以多种海岛棉品种的茎尖为受体建立了农杆菌介导海岛棉茎尖遗传转化体系, 获得30 株含有EPSPS (抗除草剂基因) 标记的转基因海岛棉。2015 年, 李琼等利用正常胚性愈伤作为受体获得可转化植株, 同时对较轻畸形胚再培养得到次生胚, 最后培育出正常转基因植株, 极大缩短了转化周期。由此可见, 根癌农杆菌在对海岛棉的遗传转化中起着的至关重要的作用。

2影响农杆菌介导海岛棉转化效率的因素

农杆菌介导法具体过程包含外植体的切取、侵染、诱导分化、生根发芽及移栽等。据前人实验, 海岛棉的再生频率与菌液浓度、侵染时间、预培养时间以及共培养的方法等有关。同时合适的外植体来源对转化的影响也很重要, 植物的不同外植体对农杆菌的侵染敏感性差异明显。

2.1 菌液浓度对海岛棉转化效率的影响

在采用农杆菌对棉花受体感染时, 合适的农杆菌浓度是必需的, 若菌液浓度过低, 接菌量不足, 则引起共培养时农杆菌生长量少;而菌液浓度过高, 共培养时农杆菌会过量繁殖伤害外植体, 都会降低抗性苗率。2007年, 翁琴[1]等以海岛棉的茎尖为转化对象筛选得到农杆菌液吸光度为0.6~0.8 时最佳。魏延宏等在2011 年利用新海13 号等茎尖为转化受体时, 当菌液浓度为吸光度为0.5 时, 最终转基因再生植株的再生率达到96%, 且平均抗性率最高, 达到46%。李宝平等用5~6d的棉花无菌苗下胚轴为受体, 筛选出菌液浓度最佳值 (分光光度计5500A, 消光系数0.4~0.8) , 使出愈率达40%~70%。2012 年, 杨婷等用新海24 等无菌苗的下胚轴于OD值为0.5 的菌液中浸泡15min亦可获得较高转化率。农杆菌介导不同棉种或不同类型外植体时所需要的菌液浓度有一定差异, 但最佳OD值的范围基本都集中于0.4~0.8之间。究其原因可能是不同基因型的研究对象, 其对农杆菌的侵染的接受性存在差异。

2.2 菌液浓度对海岛棉转化效率的影响

据研究表明, 筛选出研究对象在农杆菌中浸染的最佳时间, 有利于避免后续组织培养中导致的菌类污染现象, 并可以减缓菌液对外植体的细胞侵蚀及毒性作用。若作用时间太短, 农杆菌不能进入受体细胞内, 但作用浸染时间过久, 植物组织由于在菌液中作用时间太久而缺氧;返菌现象严重, 继代培养中外植体褐化现象严重, 甚至发黑软腐, 导致再生频率较低。在转化工作中选择最佳的侵染时间非常必要。翁琴等在研究海岛棉再生体系时, 发现在用农杆菌LBA4404 菌株侵染茎尖的最佳时间为20~30min。赵常燕以冀无2031 为材料, 用农杆菌侵染15 min, 共培养24 h, 得到较高转化率。2011 年, 周丽容以海岛棉下胚轴为外植体用农杆菌菌株LBA4404 侵染15min, 继代培养1~2 个月, 产生抗性愈伤率达90%, 结果比较理想。在棉花中, 用农杆菌侵染陆地棉或海岛棉, 最佳侵染时间大多都为10~15min, 获得30% ~40%的抗性愈伤诱导率, 且愈伤长势较好, 具有分化为胚性愈伤的潜力。同时, 对于海岛棉不同类型的外植体, 侵染时间也一致。

2.3 预培养时间对海岛棉转化效率的影响

在农杆菌介导时, 外植体细胞的感受态很重要。预培养使外植体生理代谢旺盛并可促进细胞进行多次分裂, 而此时的植物组织细胞更易结合并连接外源DNA。但如果在实验处理中, 植物组织伤口渗出液若太多, 则难以接种农杆菌, 且伤口愈合, 农杆菌不能有效侵染。因此, 有相关研究表明, 共培养前的预培养对转化效率有一定的作用。采取合适时长的预培养, 能够增进细胞分裂, 使外源DNA更容易浸入和连接。2014 年, 刘卫民等对棉花胚性愈伤进行15~20d的预培养, 获得了丰富的感受态材料, 使抗性胚性愈伤再生率均在62% 以上。然而, 岳建雄等人通过多年研究得出, 外植体的下胚轴被切成切段后, 要当即被菌液感染、共培养, 而不能开展外植体的预培养实验环节。并进一步得出, 以胚性愈伤作为外植体时一般需要预培养7~14d, 这样可以获得更高的转化率。但以棉花的茎尖和下胚轴作为外植体进行遗传转化时则不需要进行预培养。

2.4 共培养的方法

共培养是农杆菌转基因体系中最为重要的步骤, 具体当外植体经过农杆菌浸染后进行暗培养, 使农杆菌侵染植物受伤的组织细胞, 由此可将带有目的基因的T-DNA整合到外植体基因组中。在共培养时, 在培养基表层铺一层滤纸有利于约束农杆菌的过度繁殖, 有效避免了浸染组织的褐化死亡。2007 年, 翁琴用没有滤纸的对照, 出现了继代培养后细菌再度污染的现象。2009 年, 张海平[9]在研究棉花下胚轴基因转化体系时, 在培养基上铺上滤纸, 使转化时间从48h延长至60h, 获得53 株再生棉花, 大大提高了转化率。2011 年, 李杨阳以新海30 号下胚轴为受体材料用含有NAC家族基因的农杆菌共培养24h, 得到较高转化率。与此同时, 周丽容[4]以新海16 胚性愈伤组织为受体共培养24h, 得到的结果基本相同。魏延宏等在2014 年建立海岛棉茎尖遗传转化体系时筛选最佳共培养时间, 发现共培养时间在48~72 h之间时平均抗性率提高至41% 和44%。

对于在共培养阶是否加添加激素, 文献中报道不一。有的不加, 有的则认为加激素后可提高转化率。张根义等1997 年的研究表明:在植物的转基因再生过程中, 适当浓度的细胞分裂素和生长素可将增强植物细胞的感受态, 从而使整合外援基因效率更高。

3问题与展望

作为一种天然的植物遗传转化的方法, 农杆菌介导的遗传转化技术已成为海岛棉转基因体系的主流方法, 其作用机理、转化环节等方面均取得了一定的进展。但目前, 农杆菌介导海岛棉转化技术的瓶颈受到农杆菌宿主专一性和受体材料基因型等的限制, 导致海岛棉再生转化率较低。另外, 在对海岛棉的遗传转化研究中, 所取用的外植体基本均是茎尖与下胚轴, 对其他方面缺乏研究。因此, 今后应进一步开展相关研究工作, 在完善转基因条件、扩大转基因规模方面进行深入研究, 从而最终获得转化效率较高且易规模化生产的转基因海岛棉体系。

摘要：农杆菌介导转化法是转基因技术中常用方法之一, 但其在介导海岛棉遗传转化方面仍存在转化率较低的主要问题。故本文对农杆菌介导海岛棉遗传转化效率的多因素进行了概述, 分别从菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养等多方面进行探讨。同时, 对国内农杆菌介导海岛棉领域的研究现状提出了新问题及建议, 以期为海岛棉遗传转化体系进一步完善提供参考。

关键词：农杆菌,海岛棉,影响因子

参考文献

[1]周仲华, 陈金湘.分子标记技术在棉花遗传育种中的应用[J].江西棉花, 2005, 27 (4) :3-6.

[2]土彦霞, 土省芬, 马峙英.棉花转基因技术的研究及应用[J].华北农学报, 2006, 21 (增刊) :41-45.

[3]贺雅婷, 曲延英, 孔庆平, 等.海岛棉愈伤组织诱导及分化的影响因素初探[Jl.分子植物育种, 2008, 6 (3) :597-602.