转基因番茄项目可行性研究报告

转基因番茄项目可行性研究报告（共4篇）

篇1：转基因番茄项目可行性研究报告

纳豆激酶基因导入番茄的研究

将来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶(nattokinase, NK)基因转化到人类可以直接食用的`,又非常喜爱的蔬菜-番茄中,得到在转录水平表达的转基因植株.通过根癌农杆菌EHA105介导,转化番茄的下胚轴,诱导愈伤组织形成及分化成幼苗,进而再生出完整植株.提取再生植株基因组DNA,通过PCR扩增检测,结果表明纳豆激酶基因已经成功整合到番茄植物基因组中.RT-PCR实验结果证明了纳豆激酶基因在转录水平上有表达.

作 者：袁琳 刘红海 王吟 李晓翔 杨艳燕 YUAN Lin LIU Hong-hai WANG Yin LI Xiao-xiang YANG Yan-yan 作者单位：湖北大学,生命科学学院,湖北,武汉,430062刊 名：湖北大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HUBEI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：28(2)分类号：Q786 Q555+.7关键词：纳豆激酶基因 番茄 遗传转化 根癌农杆菌

篇2：转基因番茄项目可行性研究报告

产番茄红素基因工程菌的研究进展

番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,具有许多生物功能和生物活性,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用.随着番茄红素生物合成途径的阐明及其相关基因的`克隆,运用基因工程手段调控番茄红素的合成已经成为可能.首先综述了番茄红素生物合成途径及合成途径中相关基因的克隆,然后对近年来构建的番茄红素基因工程菌进行了全面的总结,包括:运用DNA重组技术使异源微生物生产番茄红素;通过表达特定基因从而提高霉菌等产番茄红素的量;分析了提高番茄红素产量和构建新的基因工程菌中存在的主要问题,并展望了未来的研究方向.

作 者：李晔 袁其朋 LI Ye YUAN Qi-peng 作者单位：北京化工大学生命科学与技术学院,北京,100029刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：26(11)分类号：Q94关键词：番茄红素 合成途径 代谢酶基因 基因工程菌

篇3：转基因番茄项目可行性研究报告

关键词：番茄红素,果蝇,阿尔茨海默病,神经保护作用

阿尔茨海默病 (alzheimer’s disease, AD) , 又称早老性痴呆, 是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病[1]。β-淀粉样蛋白 (amyloidβ-protein, Aβ) 是各种原因诱发AD的共同通路, 是AD形成和发展的关键因素, 其中Aβ42是Aβ中导致AD发生的最主要成分[2]。由于脑和脊髓对氧和多不饱和脂肪酸的需求和消耗量大, 所以神经组织对氧化应激十分敏感, 过量的自由基, 能促使Aβ和Tau蛋白积聚, 因此, 氧化应激反应是AD患者早期的发病机制[3]。

番茄红素 (lycopene) 化学结构见图1, 分子量536.85 g/mol, 是一种脂溶性不饱和碳氢化合物, 是类胡萝卜素的一种, 在自然界中主要存在于红色水果和蔬菜中, 如番茄、西瓜、番石榴、木瓜、葡萄等。很多研究表明番茄红素是一种强抗氧化剂[4,5], 已有研究者[6]尝试将番茄红素用于普通黑腹果蝇, 证实其具有延长果蝇寿命的作用, 本文采用Aβ42转基因AD果蝇模型, 进一步研究番茄红素对神经退行性疾病的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

UAS-Aβ42转基因果蝇购自美国Bloomington果蝇种系中心, 果蝇基因型P{UAS-APP.Aβ42.B}, ID:FBtp0064417, Elav-Gal4 C155果蝇、W1118野生型对照果蝇由医学遗传学国家重点实验室惠赠。

采用选择性地在果蝇神经系统表达的ElavGal4果蝇, 与UAS-Aβ42雄性果蝇杂交构建ElavGal4/UAS系统Aβ42转基因果蝇 (基因型为ElavGal4/UAS-Aβ42) 。以上果蝇在LRH系类生化培养箱23~25℃、湿度60%~65%、标准果蝇食物喂养。

番茄红素 (购自成都曼思特生物科技有限公司) , 用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解后备用。

1.2 实验分组

取孵育成成虫的雄性果蝇, 随机分为正常果蝇对照组 (基因型w, Elav-Gal4/Y) , 模型组 (基因型ElavGal4/Y, UAS-Aβ42/+) , DMSO溶剂对照组, 不同浓度干预组分别给予2.5、7.5和22.5μg/g的番茄红素培养基喂饲。药物干预组果蝇连续定量喂养, 非药物干预组连续普通食物喂养。

1.3 实验方法

1.3.1 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型寿命的影响

每组100只雄性果蝇, 各分为10管, 每管10只, 每天换1次管, 记录果蝇寿命, 至所有果蝇死亡。

1.3.2番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型攀爬能力的影响

取各组果蝇, 在二氧化碳麻醉板上轻度麻醉后, 在体视显微镜下先挑选翅膀没有残缺、体型差不多的雄性果蝇, 每组100只, 平均分装成4管, 每管25只。在暗光下爬行。爬行行为在第10天、第25天各测试1次, 每次每管连续测量3次, 记录其整数平均值。

1.3.3 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型超氧化物歧化酶 (SOD) 活性的影响

将各组果蝇同时饲养25 d, 各组取100只, 显微镜下切下脑部, 液氮研磨, 加入400μL生理盐水, 在冰水浴中以3 000 r/min匀浆10 s, 重复进行3次, 制成组织匀浆, 再以6 000 r/min离心10 min, 取上清液, 然后按照各试剂盒说明书测定。

1.3.4 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型胆碱酯酶活力的影响

将各组果蝇同时饲养25 d, 各组取100只, 显微镜下切下脑部, 液氮研磨, 加入400μL生理盐水, 在冰水浴中以3 000 r/min匀浆10 s, 重复进行3次, 制成组织匀浆, 再以6 000 r/min离心10min, 取上清液, 然后按照各试剂盒说明书测定。

1.3.5 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型脑组织病理结构的影响

将各组果蝇同时饲养25 d, 冰上切下果蝇完整脑袋放置在载玻片上, 用4%多聚甲醛固定后0.5 h, 用流动水冲洗10 min, 成蜡切片, 脱蜡脱水, 蒸馏水洗1 min, 苏木素液染色45 s, 流水冲洗1min, 5%冰醋酸-酒精浸泡3 s, 返蓝10 min, 蒸馏水洗1 min, 0.5%伊红液染色1 min, 蒸馏水洗2 s, 80%乙醇2 s, 95%乙醇2 s, 中性树胶封片。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 对各处理组与对照组数据进行方差分析及t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型寿命的影响

模型组和DMSO溶剂对照组的果蝇平均寿命在45 d左右, 而番茄红素药物干预组随着浓度的逐步升高, 果蝇的寿命也逐步延长, 存活天数最高可达55 d。由此可见, 一定浓度的番茄红素对AD果蝇的存活有一定的作用。见表1。

2.2 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型攀爬能力的影响

Aβ42转基因果蝇的攀爬能力从第10天开始明显下降, 动作变得缓慢, 第25天时能爬至顶部的果蝇大为减少。各组果蝇第10天的攀爬能力明显好于第25天, 这与果蝇衰老有关。图中Aβ42转基因果蝇的攀爬能力明显下降, 给予番茄红素干预后果蝇的攀爬能力明显提高, 但3个剂量组相差不大, 其中间浓度稍好。见图2、3。

注:覮与模型组和DMSO溶剂对照组比较, P<0.05

1:正常果蝇对照组:2:模型组;3:DMSO溶剂对照组;4:番茄红素2.5μg/g;5:番茄红素7.5μg/g;6:番茄红素22.5μg/g

1:正常果蝇对照组;2:模型组;3:DMSO溶剂对照组;4:番茄红素2.5μg/g;5:番茄红素7.5μg/g;6:番茄红素22.5μg/g

2.3 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型SOD活性的影响

超氧化物歧化酶 (SOD) 能清除超氧阴离子自由基而保护细胞免受损伤, 从表2可以看出番茄红素可以一定程度上改善果蝇大脑的过氧化程度, 减少大脑细胞的损伤, 具有较强的抗氧化能力。

2.4 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型胆碱酯酶活力的影响

脑内乙酰胆碱作为神经递质存在于胆碱能神经元的囊泡中, 阿尔茨海默病患者的认知功能受损程度与乙酰胆碱酯酶活性相对增高及乙酰胆碱合成减少呈正相关。由表3可以看出番茄红素能明显抑制模型果蝇胆碱酯酶的活力。

2.5 番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型脑组织病理组织的影响

将各组果蝇脑组织进行HE染色, 结果显示模型组果蝇脑组织出现空泡变性, 神经细胞损伤增加, 给予番茄红素干预25 d后可以看到, 脑组织中的空泡变性减少, 且呈剂量依赖性, 证明番茄红素可以显著减轻Aβ42转基因果蝇模型脑组织神经退行性病变。见图4。

注:覮与模型组和DMSO溶剂对照组比较, P<0.05

注:覮与模型组和DMSO溶剂对照组比较, P<0.05

3 讨论

现在已知β淀粉样肽主要以2种形式存在, 即Aβ1-40和Aβ1-42。后者比前者更容易发生聚集化且更难溶解, 在老年斑的形成过程中Aβ1-42首先聚集、沉积, 随后才是大量的Aβ1-40聚集、沉积。因此本课题组引入能够在神经系统表达 (ElavGal4/UAS系统) 的β42淀粉样蛋白 (βamyloid, Aβ42) 的神经退行性疾病果蝇, 作为研究模型。该模型是成熟的阿尔茨海默病果蝇模型, 在国内已有将其用于阿尔茨海默病研究的文献报道[7]。

番茄红素含有11个共轭双键及2个非共轭双键的非环状平面多不饱和脂肪烃, 正是由于番茄红素这种同一平面上拥有较多共轭双键的结构, 使其在清除自由基的反应中速率最大。现已有人[8]证明了番茄红素的抗氧化性非常强, 对邻苯二甲酸-2-乙基己基酯致果蝇脂质过氧化损伤有保护作用。本文将番茄红素用于Aβ42转基因果蝇模型, 发现番茄红素能够显著提高Aβ42转基因果蝇的攀爬能力, 延长寿命, 改善病理结构, 显示良好的抗AD作用。同时通过对SOP活力及胆碱酯酶活性的测试, 表明番茄红素作用于Aβ42转基因果蝇的机制与抗氧化及抑制胆碱酯酶活性相关。

阿尔茨海默病作为一种老年期常见的神经系统变性疾病, 对社会发展、患者及其家庭均带来巨大的负面影响。番茄红素对Aβ42转基因果蝇模型的神经保护作用, 表明其在抗阿尔茨海默病方面有巨大的研究价值。

参考文献

[1]BROOKMEYER R, JOHNSON E, ZIEGLER-GRAHAM K, et al.Forecasting the global burden of alzheimer&apos;s disease[J].Alzheimers Dement, 2007, 3:186-191.

[2]BARRANTES A, REJAS MT, BENITEZ MJ.Interaction between Alzheimer&apos;s Abeta1-42 peptide and DNA detected by surface plasmon resonance[J].J Alzheimers Dis, 2007, 12 (4) :345-355.

[3]NUNOMURA A, CASTELLANI RJ, ZHU X, et al.Neuropathol[J].Exp Neurol, 2006, 65:631-641.

[4]JIN LF, ZHANG XY, XIA WM.Research progress of lycopene[J].Joumal of Navy Medicine, 2010, 31 (1) :91-92.Chinese

[5]CHEN LP, HE SY.Antioxidation activity of lycopene[J].Journal of Huaxi Medicine, 2008, 23 (6) :653-655.Chinese

[6]DAI QP, WANG YF, GUO WW, et al.Effect of lycopene on lifespan of drosophila and its underlying molecular mechanism[J].Acta Nutrimenta Sinica, 2008, 30 (4) :392-396.Chinese

[7]吴婷, 丁新生, 董海蓉, 等.MK-801对转Aβ42基因果蝇阿尔茨海默病模型的神经保护作用[J].南京医科大学学报 (自然科学版) , 2008, 28 (12) :1574-1577.[7]WU T, DING XS, DONG HR, et al.The neuroprotective effects of MK-801 on Aβ42 transgenic drosophila model of Alzheimer&apos;s disease[J].Acta Universitatis Medicinalis Nanjing (Natural Science) , 2008, 28 (12) :1574-1577.Chinese

篇4：番茄基因组DNA提取探讨

番茄是较早构建遗传连锁图谱的作物,目前基于番茄培育种和各种野生种杂交构建了许多分子图谱,因此获取高质量的DNA是番茄分子生物学和基因工程研究的前提。现对CTAB及SDS 2种方法进行比较,旨在为番茄基因组DNA的提取方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试植物材料为番茄幼嫩叶片。供试药品有:CTAB提取缓冲液:2%CTAB(W/V),100mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol·L-1EDTA(pH 8.0),1.4mol·L-1 NaCl,2%(V/V)α-巯基乙醇。高压灭菌后备用。

SDS提取缓冲液:2%SDS(W/V),100mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol·L-1EDTA(pH8.0),150mmol·L-1 NaCl,20%SDS溶液;5mol·L-1 KAC;3mol·L-1 NaAC,2%(V/V)α-巯基乙醇。高压灭菌后备用。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取番茄基因组DNA

取番茄幼嫩叶片0.1g,装于1.5 mL离心管中液氮研磨,每管加入700μL65℃预热的CTAB提取缓冲液,混合均匀,65℃水浴锅中保温30min;水浴锅中取出置于冰上冷却,加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),上下颠倒混匀,4℃,12 000r·min-1离心10min;取上清液加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1),轻轻混匀,4℃,12 000r·min-1离心10 min,取上清液加入1/10体积3 mmol·L-1 NaAc(pH 5.2)和等体积异丙醇,轻轻混匀,-20℃放置20 min,4℃,12 000r·min-1离心10min,弃掉液体;用70%乙醇冲洗,4℃,7 500r·min-1离心5min,弃掉液体,真空抽干,加入200μL灭菌纯水溶解。

加入2μL(10 mg·mL-1)RNaseA酶液,在37℃条件下保温30min,然后氯仿-异戊醇(24∶1)抽提1次,离心、沉淀、干燥,最后将DNA溶解在30μL灭菌纯水,于-20℃保存备用[3,4]。

1.2.2 SDS法提取番茄基因组DNA

取番茄幼嫩叶片0.1g,装于1.5mL离心管中液氮研磨,每管加入700μL65℃预热的SDS提取缓冲液,70μL的20%SDS溶液,混合均匀,65℃水浴锅中保温30min;水浴锅中取出置于冰上冷却,取上清液加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1),轻轻混匀,4℃,12 000r·min-1离心10min;取上清加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1),4℃,12 000r·min-1离心10 min;取上清液加入1/10体积的NaAC和等体积异丙醇,-20℃放置10min;4℃,12 000r·min-1离心10min,弃掉液体;用70%乙醇冲洗,4℃,7 500r·min-1离心5min,弃掉液体,真空抽干,加入200μL灭菌纯水溶解[3,4]。去RNA方法同上。

1.2.3 DNA检测方法

DNA浓度检测:以无菌水作为空白对照,测定各样品OD260及OD260/280值,计算样品中的DNA浓度并判断DNA的纯度。DNA电泳检测:0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性及RNA污染程度。PCR检测:PCR反应体系:25μL反应体系,10×Taq Buffer2.5μL,Primer 1(10pmol·μL-1)1μL,Primer2(10pmol·μL-1)1μL,dNTP 2μL,Taq polymarase(5 U·μL-1)0.2μL,Template DNA 1μL;PCR反应条件:94℃预变性5min,30个下列循环:94℃变性30s,56℃退火40s,72℃延伸1min;72℃延伸7min,4℃保存。

2 结果与分析

2.1 DNA样品紫外分光光度计分析

DNA的浓度及纯度见表1。可知,由OD260/280值说明2种方法提取的DNA纯度较高,且提取量差异不显著。

2.2 DNA样品电泳分析

DNA在0.8%的琼脂糖凝胶电泳上检测结果见图1和图2。可知,由CTAB和SDS 2种方法提取的番茄基因组DNA都有清晰的主带,无降解,无RNA污染,DNA质量较好。

2.3 PCR检测

将提取的番茄基因组DNA用于PCR分析,由图3可见,PCR扩增条带清晰,说明所提取的DNA可以满足PCR要求。

3 结论

番茄成熟及衰老叶片中含有较多的多酚类物质,叶片中糖含量较高,对提取的DNA质量有影响,经试验证明通过在提取液中加入2%聚乙烯比咯烷酮有助于抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性。但选择材料时应尽量选取幼嫩叶片,因其含有较完整的DNA,从而提高DNA的质量。在加入酚-氯仿-异戊醇抽提液时,注意抽提液体积,若抽提液体积过小,抽提离心后在固体层下方会产生一个空隙,在取离心管的过程中造成震荡使上层提取缓冲液漏下,造成DNA浪费。DNA沉淀时可加入2倍体积的乙醇或等体积的异丙醇,异丙醇能与自由水紧密结合,结合了溶解DNA的水分子使DNA沉淀,可常温沉淀离心,但沉淀容易将盐成分一起沉淀不易除去;无水乙醇易于从DNA沉淀中除去,需-20℃放置10～20min。因此可根据实际情况进行选择。

采用CTAB及SDS 2种方法对番茄幼嫩叶片DNA进行提取,试验结果说明2种方法均能得到完整且纯度较高的DNA,所得DNA用于PCR反应可得到清晰的扩增条带。

摘要：以番茄幼嫩叶片为材料,通过CTAB和SDS 2种方法对番茄基因组DNA提取进行了比较研究。结果表明:2种方法均能提取完整且纯度较高的DNA,所得DNA用于PCR反应可得到清晰的扩增条带。

关键词：番茄,DNA,提取

参考文献

[1]萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿帝斯T.分子克隆实验指南[M].2版.金冬雁,黎孟枫译.北京:科学出版社,1998.

[2]奥斯伯F,布特伦R,金斯顿R E.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998.

[3]Theresa M F,Steven D T.Microprep protocol for extractionof DNA from tomato and other herbaceous[J].Plants.PlantMolecular Biology Reporter,1995,13(3):207-209.