下面是小编精心推荐的《转基因水稻论文范文(精选3篇)》，欢迎阅读，希望大家能够喜欢。摘要：近年来，随着抗虫转基因水稻研究的进一步发展，世界各地实验室在抗虫转基因水稻研究方面均有收获，抗虫转基因水稻检测随之成为众多科学家的关注点。该文综述了抗虫转基因水稻检测技术的研究进展，为进一步开展转基因水稻检测的研究工作提供参考。
第一篇：转基因水稻论文范文
水稻红米色素基因的初步定位
摘要：除草剂会严重影响烟草产量和质量，导致烟草植株矮小、老叶黄化、生长畸形和迟缓等不良后果，本文综述了除草剂残留致烟草药害的原因、各类除草剂典型的药害症状和除草剂土壤残留致烟草药害的修复技术。可通过物理技术(土壤翻耕)、生物技术(生物炭、有机肥、生物菌剂、植物、动物、基因修复)、化学技术(土壤改良剂、植物生长调节剂组合)等修复方法来削减除草剂土壤残留及修复烟株畸形生长。
关键词：除草剂;烟草;药害;修复技术
文献标识码：A
Key words：herbicides; tobacco; phytotoxicity; remediation techniques
目前除草劑使用量和化学除草面积与日俱增，用量已占到农药使用量的50～60%，除草剂土壤残留致作物药害的现象不断发生[1-3]。长残效除草剂在土壤中残留时间长，最长可达4年以上，在连作或轮作农田中使用易对后茬作物产生药害[4]。烟草对除草剂较为敏感，在部分水稻-烟草、高粱-烟草、玉米-烟草的轮作区，除草剂土壤残留给烟叶安全和优质生产带来较大的负面影响[5]。因此如何高效、安全合理地使用除草剂以及探索除草剂土壤残留致烟草药害的修复技术势在必行。本文归纳总结了除草剂致烟草药害的原因、典型症状及主要修复技术，以期为烟叶安全生产提供参考。
1除草剂致烟草药害的原因
11药剂选择不当或误用除草剂
不同植物对除草剂的吸收和传导具有较大差异，使用时需根据植物形态、时差位差、生理生化等差异来选择除草剂。例如50%的异丙隆可湿性粉剂对水稻的生长发育影响较大，严重时会造成稻株死亡，但在麦田除草时，能杀死杂草而对小麦生长无明显影响。农业生产中误用农药的情况时有发生，比如将除草剂误作农药(杀虫剂或杀菌剂)使用或错误使用除草剂剂型等，导致作物产生药害。1998年，河南省邓州市林扒镇沟王营村农民郝秀奇，在棉花初花期时为防治病虫害时，误用麦田除草剂(百甲合剂)，发现打过药的棉花顶部出现翻卷、萎缩等药害症状[6]。
12除草剂使用浓度过高
每种除草剂都有合适的推荐用量，若用量过多或由于施用不均匀致浓度过高，农作物将会产生除草剂药害。有些农户在生产中往往超过常规用量的3～7倍使用除草剂，黄光环[7]研究发现超量喷施二氯喹啉酸是导致烟草产生药害症状的主要原因。
13除草剂盲目混用
两种及两种以上的农药混用，有时会对作物产生增毒作用[8]。本课题组田间试验发现，二氯喹啉酸和莠去津混配超量使用后，其土壤残留会对致害烟株有增毒效应。1994年，东台市许河镇农户由于在前茬小麦地上盲目施用磺酰脲类混配除草剂麦草完、麦草宁(甲磺隆和氯磺隆复配)，导致866hm2后茬玉米出现黄化和死苗的药害症状[9]。
1.4除草剂施药时期不当
除草剂一般都有安全使用期，错过此时期易导致烟草产生除草剂药害。据报道，2009年河南安阳县崔家桥村一农户将2，4-D丁酯施用在小麦的扬花期，造成小麦不灌浆，穗小，畸形药害症状[10]。前茬作物除草剂施用时间延迟，致其在植烟土壤中残留，烟草易产生药害。同样，在烟草生长期间使用敏感除草剂，会导致烟草叶片畸形、植株矮小等药害症状[11]。
1.5用药方法不当或漂移
除草剂不同于杀虫剂、杀菌剂，使用要求更严格，一旦使用不当，就会产生药害。如部分除草剂在使用过程中保护措施不到位，使药液接触到烟草叶片而产生药害。在烟地邻作物田地不规范或大风天气使用除草剂发生药液漂移也会造成烟草药害。如2，4-D丁酯喷施之后遇到高温天气，产生二次漂移，距离可达2000m，可致邻作烟草产生药害[12]。因此喷施除草剂时尽量选择无风或微风天气。
1.6除草剂土壤残留
长残效除草剂有咪唑乙烟酸、异恶草酮、绿醚磺隆、二氯喹啉酸、莠去津等。烟草的种植轮作期一般为2年，在轮作期间喷施的除草剂对当季作物影响较小，但部分长残效除草剂土壤残留对后茬烟草影响极大，易使烟草出现叶片卷曲、黄化、叶片狭窄等药害症状[13]。陈泽鹏等[14]通过模拟试验研究发现，前茬水稻田使用二氯喹啉酸致烟地土壤残留是导致烟叶畸形生长的最主要原因。王城浩等[15]研究也表明，烟地土壤中二氯喹啉酸残留量为0169～0772mg/kg时，严重破坏烟叶的品质，影响其加工利用。
1.7喷雾器等农具清洗不净
施用过农药的喷雾器要及时清洗干净再施用其它农药，农具最好专用，否则易造成农药残留而致作物药害。如喷施2，4-D丁酯除草剂时应该使用专用的喷雾器，否则喷雾器残留2，4-D丁酯会对棉花、大豆、马铃薯等作物产生药害[16]。
1.8其他因素
土壤墑情欠佳，多数除草剂随土壤或植物含水量增加而增强药效，施药后雨量过大会造成除草剂淋溶下渗，除草剂易下渗到作物的根部上，加大了农作物的吸收量，致使作物产生除草剂药害[17];土壤贫瘠的砂质土壤，其有机质含量较低，除草剂淋溶性和移动性更大，烟株根部吸收后也可能造成烟株除草剂药害;气候原因，施用除草剂后，遭遇天气的变化，通常会导致或加重对施用作物的危害。2010年河南省安阳市安阳县部分玉米田在6月底，气温高达35℃的天气施用烟嘧磺隆除草剂，从而导致玉米心叶卷曲，叶片出现白斑[18]。
2除草剂致烟草药害的主要症状
除草剂残留毒害已逐渐成为部分烟区优质烟叶开发的潜在危害，不同除草剂或不同种类除草剂致烟草的药害症状不同，其主要药害症状如下：
21磺酰脲类除草剂
磺酰脲类除草剂致烟草药害后，烟株矮小、烟叶黄化、生长迟缓，严重时新生叶片浓绿畸形、蜷缩，老叶叶脉黄化，对烟草的生长抑制严重;烟草根系生长发育受到严重阻碍，其主根短，无根毛，须很少。此类除草剂致烟草药害较为缓慢，一般受害后3～5d才出现药害症状，药害症状持续时间长[19-20]。
22酰胺类除草剂
此类除草剂除了敌草胺对烟草生长无明显影响外，乙草胺、异丙甲草胺在高浓度时会引起幼苗矮化叶片黄化，幼芽和细根生长被抑制[21]。
23苯氧羧酸类和苯甲酸类除草剂
苯氧羧酸类和苯甲酸类除草剂是目前重要的除草剂，因其高效、广谱、低残留而被广泛使用。然而，烟草对该类药剂敏感，再加上这类除草剂在作物上的安全使用受到作物生育期、环境条件等因素影响，应用不当可能会产生较重的除草剂药害。此类除草剂致烟草药害症状为叶片颜色变暗，叶柄弯曲，叶片狭长而下垂成带状，叶脉突出，叶尖和叶缘常成锯齿状且向下卷缩[22-23]。
24有机磷类除草剂
草甘膦是有机磷类除草剂中较为常用的。烟草上误用草甘膦5～7d后，烟叶首先在新生叶片上产生药害症状，主要表现为叶片退绿、烟叶出现褐色斑点、烟叶从绿色逐渐变为浅黄色或白色、黄化、老叶生长不正常，药害随时间的延长烟叶斑点增加，烟叶叶片狭窄，且叶缘向下卷，坏死部分脱落后形成弹孔状;由施用过高浓度草甘膦导致烟株产生药害时，烟株叶片上部斑点呈现片状，烟株不长新根或停止生长，根部甚至出现腐烂坏死症状[13， 24]。
25喹啉羧酸类除草剂
二氯喹啉酸是喹啉羧酸类除草剂的典型代表，由于防效好，用量少，备受农户喜爱。二氯喹啉酸致烟草药害症状为烟株畸形生长，最先出现新生叶片畸形，往叶背翻卷，随着烟株的生长，药害症状更为明显，烟株矮化、叶片皱缩变窄变厚、叶片颜色加深而变浓绿、叶宽严重受到抑制，其药害严重时烟叶呈鼠尾状或线型[25-29]。
26联吡啶类除草剂
百草枯、敌草快为灭生性除草剂，喷施后农作物早上表现正常，下午会突然变为青枯。烟草产生此类除草剂药害后，烟茎和烟叶都产生白斑，浓度过高时，病斑串联起来叶片变黄，叶片脉间组织死亡脱落[20]。
27二苯醚类除草剂
以氟磺胺草醚为例，其致烟草药害主要症状为：植株矮小，叶片狭小、植株上部新叶萎蔫、老叶脉及其周围颜色黄化，失绿，烟叶心叶畸形，烟株主根短小，须根少[18]。
28三氯苯类除草剂
烟地土壤莠去津残留也会对烟株产生药害，其主要影响烟株的株高，导致烟株矮小、叶片狭小、严重时烟叶畸形生长，老叶黄化严重，烟株主根短小，须根少[18]。
3除草剂药害的修复
31物理技术
利用土层置换犁对除草剂污染土壤进行立体式翻耕，即对土壤土层和土心层的进行置换，让除草剂残留暴露在土壤的表层，加大其与空气的接触面积，加快其的降解速度，从而减少对作物的影响。祖永平等[30]研究表明，采用立体休闲翻耕后土壤中氟磺胺草醚残留量降低了79%，有效的提高了受害甜菜的株高、出苗率、鲜重和叶绿素恢复率，并且此方法比常规翻耕方法降解速度更快。利用土层置换的方法还可以消除长效除草剂对敏感作物甜菜的毒害作用，从而提高其产量和品质[31]。
32生物技术
321生物炭、有机肥修复
生物炭是指其在无氧或低氧的条件下经过高温裂解后，成为一种高度芳香化、碳素含量高的固体颗粒物质[32]。生物炭作为土壤改良剂，可以有效改善土壤的理化性质、土壤微生物生态环境，从而达到修复污染土壤，提高单位面积作物的产量和农作物品质[33]。生物有机肥是以畜禽粪便等有机废弃物为主要原料，发酵后、脱臭和无害化处理后，加入适量的有机肥而制作成为多功能的肥料。傅秋华等[34]研究表明竹炭能提高土壤的pH值，丰富土壤的氮、磷、钾、钙、镁等元素，降低锌、铜等重金属的含量，很好的改善了土壤空隙度和容重，延长作物的生长期，也能增强作物的抗高温和抗旱能力。取喷施过二氯喹啉酸常规用量3倍的土壤进行盆栽试验，郑雄光等[35]研究发现生物质炭施用量为1875kg/ha时，其对二氯喹啉酸致烟草药害修复效果最佳，且建议后茬烟地施用生物质炭1500kg/ha均匀还田，能有效缓解烟株二氯喹啉酸药害症状。杨磊等[36]发现竹炭在55℃、3 h的条件下，其对甲醛的吸附作用很好。傅秋华等[37]通过试验表明200g/m2 竹炭用量能显著促进高羊茅草的生长。而生物炭对莠去津土壤残留也具有一定的削减作用，当土壤莠去津残留量为20mg/kg时，对于成熟期大豆，加入生物炭的处理其株高、有效荚数、百粒重、单株粒重都分别增加了4460%、1679%、960%、2279%，其增加的比例较未添加生物炭的处理差异显著[38]。勾芒芒等[39]也发现生物炭和化肥的混合施用能显著的提高作物的产量和品质。
322生物菌剂修复
微生物修复除草剂污染土壤主要是依靠其将除草剂降解和转化为水、二氧化碳，有机酸和其他产物[40]。微生物能活化土壤中的过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶等活性，也可以增强土壤的呼吸强度[41]。汪海珍等[42]加入优选菌株Penicillium sp.能加速甲磺隆在污染土壤的降解作用，能明显地缩短土壤中甲磺隆半衰期，并显著缓减了结合态甲磺隆残留物的形成，促进了甲磺隆残留物向可提取残留物的转化和矿化。董俊宇[43]试验表明微生物能有效降解二氯喹啉酸，能缓解或解除其对植物的迫害，其降解率高达70%～90%。范俊[44]通过控制单因素，发现菌株QC06(泛菌属，pantoea sp.)在二氯喹啉酸浓度为50mg/L，pH值为7.0、温度为30℃的条件下，第7天对二氯喹啉酸的降解率达到最大，为9531%。当二氯喹啉酸浓度在1～100mg/L时，菌株MC-10(节杆属，Arthrobacter sp.)在pH=7、温度为30℃对二氯喹啉酸有良好的降解效果，降解率可达90%以上[45]。同时，博德特氏菌HN36加入到含有016mg/kg二氯喹啉酸的土壤中，能有效降低土壤中二氯喹啉酸浓度，从而缓解了二氯喹啉酸土壤残留对烟株株高和叶片生长的迫害，且随博德氏菌HN36施用浓度的增加，其修复效果越好[46]。匡传富等[47]在后茬烟地上翻耕二氯四甲污染土层后，利用浓度为1500～1900kg/ha的生物质炭和浓度为15×1011cfu/L，用量为40～60mL的降解菌SE08混合施入污染土壤中，也有效地缓解了二氯四甲土壤残留致烟草药害的症状。
323植物修复
目前国内外有部分基础研究发现，植物通过自身的木质化作用，可使土壤中残留有机除草剂在植物组织中贮藏，也可以使除草剂污染物矿化和使其代谢为水和二氧化碳[48-49]。周宁[50]发现狼尾草和高丹草能有效修复莠去津污染土壤，降低其在土壤中的残留量。Gao等[51]报道，在无菌条件下，水生植物鹦鹉毛、紫萍、伊乐藻在6d内可以完全富集水环境中的DDT，并能将1%～13%的DDT降解为DDD和DDE。葫芦科植物南瓜和西葫芦具有很强的运输和富集的能力，土壤中存在DDT高浓度的情况下，南瓜和西葫芦根系的富集量分别为1519ng和2043ng，在芽中分别达到57536ng和35277ng，其植物嫩芽的富集能力强于根系[52]。Roy等[53]通过模拟田间条件，发现种植草地早熟禾的土壤比没有种植此植物的土壤，麦草畏的降解率要高6～8倍。李宛泽[54]研究结果也表明，盆栽试验60d后，种植南瓜植株的处理比未种植南瓜处理的DDT降解率要高，其中种植南瓜的处理DDT降解率在295%～316%之间，未种植南瓜的处理降解率仅为144%，可见南瓜促进了DDT在土壤中的降解。
324基因技术
利用基因技术解决除草剂残留致烟草药害的研究和报道甚少，但由于基因技术具有彻底解决烟草除草剂药害的潜在优势，此技术必将成为今后研究的热点方向。从1996年开始，已经陆续培育出抗草甘膦基因的作物和抗咪唑啉酮的玉米、水稻、油菜、甜菜等[55-57];将烟草AIS突变基因和细菌Klebsiella ozaenae编码的腈水解酶(bromoxynil-specific nitrilase，BXN) 基因导入农作物中，分别培育出抗磺酰脲类和溴化苯腈除草剂的转基因烟草品种[58]。将HPPD(p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)基因导入烟草，可获得高抗恶唑草酮除草剂的烟草品种[59]。
325动物修复
袁馨[60]研究表明，环毛蚓对菲、芘处理的降解率分别较未接种蚯蚓处理提高了076%～332%和045%～224%，说明蚯蚓能促进菲、芘在其污染土壤中的降解。钱博[61]通过往含有毒死蜱的土壤中加入蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eiseniafoetida)后，蚯蚓总体重下降，由于蚯蚓的作用提高了土壤中毒死蜱的降解效果，可见动物蚯蚓对土壤中毒死蜱的降解效果具有促进作用。同样在供试浓度相同的条件下，土壤中加入蚯蚓能够加快乙草胺和丁草胺的降解速度，缩短了两者的半衰期[62]。
3.3化学技术
3.3.1土壤改良剂
土壤中施入化学改良剂，对除草剂致烟草药害具有直接、快速、高效的修复效果。此方法能够改变除草剂污染土壤的内部环境，加快除草剂残留的降解速度。陈泽鹏等[63]研究表明，烟地土壤施用生石灰能够提高其碱性，加快土壤中二氯喹啉酸残留的分解，当烟地土壤生石灰施用量为300kg/hm2和600kg/hm2时，生石灰对二氯喹啉酸致烟草药害所产生的畸形生长具有一定的缓解作用，但不能使烟株畸形生长恢复到正常水平。彭耀东[64]往含016mg/kg二氯喹啉酸的土壤中混入生石灰1125kg/hm2后，二氯喹啉酸致烟草生长畸形的药害症状有所缓解。
3.3.2植物生长调节剂
植物生长调节剂可以调控作物体内核酸、蛋白质、酶的合成，能提高植物的糖类含量和增强植物抗害、抗盐碱、抗病虫害的能力[65]。尹显慧等[66]研究表明，利用格芙1～2kg/667m2灌根，配合赤霉素0005～0006g、吲哚乙酸000002～000004g、尿素50～60g、磷酸二氫钾28～32g所组成的配方对烟叶喷雾，能够增强致害烟株的光合作用，诱导致害烟株产生大量的细胞分裂素，促进烟株根系的生长，加强了植株对水分和养分的运输和吸收，最终较好的解除了二氯喹啉酸土壤残留致烟草的药害症状。郭红甫等[67]研究表明，复硝酚盐、胺鲜酯其中一种或两者混剂，活性多糖为壳寡糖、葡聚烯糖的其中一种或两者混剂，用量为：植物生长调节剂为0.05～90.0份，活性多糖0.05～90.0份，此组合也能有效抵抗害源胁迫，缓解除草剂的药害。
4结语
前茬除草剂土壤残留导致的烟草药害已成为影响烟草产量和质量的重要因素之一，药害症状主要表现为：烟株矮小，烟叶黄化，生长停滞，烟叶生长点蜷缩，叶片皱缩，畸形生长，叶柄弯曲，叶脉突出，主根短，无根毛，根须少等。明确不同除草剂致烟草的药害症状，对判断除草剂种类和采取准确有效的修复措施具有重要意义。国内外学者对除草剂土壤残留致烟草药害的修复技术做了较多的研究，主要包括物理、化学、生物三种方法，此三种修复方法，都有自己的优势和不足。物理方法主要对被污染烟地土层进行翻耕，加速土壤残留除草剂的降解，但其耗时、耗力、耗资，增加了烟农的生产投入。利用化学品改变除草剂污染土壤的理化性质，是一种直接快速有效的解决方法，但处理不当易给植烟土壤带来新的污染。比如生石灰会改变植烟土壤的酸碱度，使土壤偏碱性，而烟株适宜在偏酸的土壤环境中生长，且生石灰会也容易造成二次污染。目前解决除草剂残留致烟草药害的较好方法是培育出抗除草剂药害的烟草品种，但目前国内报道甚少，且由于其周期长、耗资大、除草剂品种繁多，更新换代快，所以培育抗性品种难度较大。生物炭也只有在超量使用的情况下，才能很好的降低和清除烟地土壤的除草剂残留，但是这样将增加烟农的修复成本。植物修复其对环境没有污染，但其修复周期长，修复效果缓慢，修复目标较窄，有时一种植物只能修复一种或一类除草剂，且大部分研究处在研究阶段，在田间难以推行应用。在微生物修复中生物菌生长快、对环境友好、无污染，是当下治理除草剂污染问题较流行的方法，但是由于微生物个体较小，不能吸收大量有机污染物，难以后续处理，限制了烟田中土壤除草剂残留的大面积修复，且大多数降解菌都停留在室内降解效果好，但在田间复杂的环境中修复效果较差，且不易控制。
总之，物理、化学、生物三个方面的修复技术都能在一定程度上削减土壤中的除草剂残留，促进烟株恢复生长，同时也存在田间修复效果往往不能达到正常水平，对其修复机理研究较少，深度不够。如何有效地缓解和消减除草剂致烟草的药害及解决农户土壤修复成本、预防修复产生的二次污染问题、以及修复技术在植烟土壤中高效和稳定的运用有待更加深入的研究。
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作者：吴建 余显权
第二篇：抗虫转基因水稻检测技术研究综述
摘 要：近年来，随着抗虫转基因水稻研究的进一步发展，世界各地实验室在抗虫转基因水稻研究方面均有收获，抗虫转基因水稻检测随之成为众多科学家的关注点。该文综述了抗虫转基因水稻检测技术的研究进展，为进一步开展转基因水稻检测的研究工作提供参考。
关键词：抗虫 Tail-PCR;转基因水稻;基因芯片;检测技术
稻米是全世界近一半人口消费的主要粮食作物，对于人类的生存和发展起着极其重要的作用，是我国食用人口比重最大的粮食作物。研究表明，当前制约水稻稳产、高产以及稻米品质的主要是各类害虫，所以防治虫害成为了重中之重。在防治害虫时，使用生物防治手段，不仅制约因素多、还不易控制，而使用化学农药不仅破坏生态平衡、还可以使螟虫产生抗性;培育抗虫水稻新品种，增强水稻的抗虫性，是一种更经济环保的方法。然而，传统的抗虫水稻育种周期长，有限的遗传资源，不明确的抗虫机制，还会产生新的生物型害虫，导致抗虫性不稳定，极大地制约了水稻抗虫育种的进程。因此，利用基因工程技术获得转基因抗虫水稻，是水稻防虫侵害的最有希望和前途的方法。
1 抗虫转基因水稻简介
抗虫转基因水稻就是利用转基因技术将抗虫基因导入水稻的受体细胞中，使寄主在水稻细胞内抗虫基因得到表达并遗传，使水稻自身产生抗虫蛋白，进而形成抗虫的新型水稻品种。在水稻转基因抗虫研究中，被广泛应用的水稻抗虫基因是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)中发现的Bt基因。1989年，人类第一次培育转基因水稻植株，此植株是由中国农業科学院杨虹等将Bt基因利用原生质体电融合技术导入粳稻台北309的基因组DNA中培育出的新型水稻[1]。现至今已有多个实验室成功培育出转基因水稻新品种。金永梅等[2]将 Cry1C*、 Cry2A*这2个不同的Bt抗虫基因利用农杆菌介导法同时导入到水稻品种吉粳88中去，获得了二价抗虫转基因水稻。2005年华中农业大学张启发院士课题组，将水稻Actin启动子驱动的融合型Bt抗虫基因cry1A(b)/cry1A(c)导入籼型恢复63中，得到了一些基本不用药物防治螟虫危害的转化植株[3]。2009年底，2个由华中农业大学研发的抗虫转Bt基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”，首次获得农业部为转基因水稻颁发的安全证书，标志着转Bt基因水稻以成功进入中国。2015年1月5日，“转基因抗虫水稻“再次获得由农业部颁发的农业转基因生物安全证书(生产应用)，2018年，转基因抗虫水稻华恢1号获得美国FDA的商业化许可。2002年，我国农业部和卫生部同时发布了《农业转基因生物标识管理办法》、《转基因食品卫生管理办法》2部法规，内容规定强制进行转基因食品标识[4-5]。表明抗虫转基因水稻的培育和应用需要转基因水稻的检测技术。就转基因基因检测技术来说，发达国家技术水平高于发展中国家，美国等发达国家向发展中国家出口了大量抗虫转基因产品。中国已经加入了WTO，必然面临着转基因产品贸易和安全监控的挑战[6-8]。
2 抗虫转基因水稻检测技术研究进展
抗虫转基因水稻检测主要内容是检测抗虫基因(Bt基因)是否存在以及含量，还要确定其是否能成为合格的转基因新品种等[9]。随着科技的不断发展，植物基因工程技术领域里不断研究出新的转基因植物检测技术，检测范围发展到DNA水平、RNA水平和蛋白质水平3个方向。检测方法主要有PCR检测方法、Souther杂交、Tail-PCR、基因芯片、RT-PCR检测、实时荧光定量PCR检测、Nouther杂交、ELISA方法、试纸条检测法等。
2.1 蛋白质水平检测
2.1.1 ELISA检测法 通过欧洲多个实验室研究结果可以确定，运用ELISA方法检测Bt蛋白含量结果可信度几乎达到100%，目前普遍应用ELISA检测法检测抗虫转基因水稻Bt蛋白含量。2018年黑龙江大学李荣田等使用ELISA方法检测出不同Bt基因在植物细胞蛋白质层面的表达量(或最高表达量)是有差别的[10]。ELISA检测法是通过实验结果是否发生颜色反应及生成物质颜色变化的深浅来判定检测信号的存在和含量的。抗虫转基因水稻表达的目标蛋白(抗原)和抗体存在特异性反应，结合了酶和底物之间高效催化作用，也就是说加入酶催化底物后，底物就会发生反应并且生成有颜色的物质，酶含量和生成物质颜色深浅呈正比，间接显示了目标蛋白含量的多少。因此，ELISA检测法即可以定性检测抗虫基因是否存在，也可以定量分析抗虫基因表达量[11]。该方法现在已经推广试剂盒的应用，可快速实验并且准确度高。
2.1.2 试纸条法 试纸条法是将含有特异抗体的蛋白提取液交联到试纸条和有颜色物质上，当纸上抗体和蛋白提取液中特异抗原结合之后，再与特异的带有颜色的抗体进行反应，于是就在试纸条上出现了三明治状的色带。假如没有抗原，就没有三明治色带。中国科学院王彤彤[12]采用快速检测试纸条，仅仅需要5min就可以准确测定出抗虫转基因水稻中Bt蛋白含量。由此可见，试纸条法可以在现场进行检验或初筛时，不需特殊的仪器设备就可以完成实验，将来有着较好的应用前景。
2.2 RNA水平检测
2.2.1 半定量RT-PCR检测 这是一种通过检测特异性mRNA的灵敏度来分析基因表达的快速方法。此方法首先提取抗虫转基因水稻总RNA，然后以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA;再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达产物，最后通过限制性内切酶酶解或者核苷酸测序来进一步鉴定PCR产物[13]。半定量RT-PCR技术虽然快速简便，但是它是一种粗略的估计基因表达量的方法，若要精确计算基因表达量，还需要定量PCR技术。
2.2.2 实时荧光定量PCR检测 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统PCR中不能定量检测的局限性，其原理是在普通PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，然后通过标准曲线就可以对未知模板进行定量分析[14]。中国农业科学院苏长青博士建立了转基因抗虫水稻科丰8号实时荧光定量PCR检测方法，并用此方法确定了科丰8号品系外源抗虫基因为10拷贝[15]。因此，实时荧光定量PCR技术是外源基因定性定量分析先进技术，其优势在于准确性高、假阳性低、特异性好、灵敏度高。因为应用荧光信号检测对样品初始模板浓度进行定量，能够使结果误差小;过程中操作简单、自动化程度高;整个反应在闭管条件下一步反应完成，既不会交叉污染，更保护了实验环境[16]。
2.2.3 Northern杂交 Northern杂交是一种通过检测RNA的表达水平来检测外源抗虫基 因表达的方法。假如整合到水稻染色体上的外源抗虫基因能正常表达，那么转化水稻植株细胞内有其特异转录产物生成。首先，将提取的植物总RNA用变性凝胶电泳分离;然后，将凝胶上不同排布的RNA分子按照原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，特异性标记的探针会与膜上的同源序列进行杂交;最后，通过探针的标记性质就可以检测出杂交体，而且转录的特异性RNA分子量的大小可以直接通过杂交体在膜上的位置来判断。若无杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到水稻细胞染色体上，只是外源抗虫基因在某些部位和特定生理状态下并未有效表达，不能说明外源基因不表达，需要接下来的实验进一步判断[17]。
2.3 DNA水平检测
2.3.1 简单PCR技术 简单PCR技术是抗虫转基因水稻外源基因检测最成熟、基础的一项检测。黄晓西[18]运用简单PCR技術检测了转新型Bt基因抗虫水稻146株，转化率达32.8%。其原理是体外利用极少量DNA模板酶促合成特异DNA片段，设计特异性引物，添加催化DNA聚合酶，经过高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，达到目的基因片段快速扩增的过程。简单PCR技术只能满足一种或少数几个转基因品种的检测需要，并且检测结果一旦出现假阳性的缺陷，就会导致工作程序重复验证，耗费大量时间，现在除简单的定性鉴定之外，已不能满足当前工作中快速通关的要求。
2.3.2 多重PCR技术 多重PCR技术是在常规PCR基础上发展出能够同时扩增多个核算片段的一种新型PCR技术。在应用时要求使用至少两对熔解温度相近、彼此不发生相互作用的2队引物，并且扩增产物分子量大小即相近又能通过电泳分离。反映到植物基因工程应用，水稻中的内参基因、外源基因、355启动子、NOS终止子可以在同一个PCR体系中同时用多套引物分别扩增出来。敖金霞[19]建立了适用转基因大豆、玉米和水稻深加工产品定性检测的5重巢式PCR检测方法，其检测灵敏度为0.005%。此方法简化了操作程序，既节省了模板DNA，又减少费用，是一种非常有发展前景的定性PCR检测方法[20]。
2.3.3 Southern Blot杂交 Southern Blot通常被用来鉴定外源基因在抗虫转基因水稻中的整合情况，即检测抗虫基因整合在水稻基因组中的拷贝数情况。其基本原理是首先用限制性内切酶将水稻基因组酶切消化，标记目的基因片段为探针备用，然后将消化的基因组DNA与标记好探针在杂交膜上进行杂交，包含目的基因的基因组片段与探针会因为发生同源重组而显示杂交信号，目标基因拷贝数就自然得出。因此，金永梅[21]等利用Southern Blot技术检测出单拷贝抗虫水稻植株，以此为前提，确定出外源抗虫基因的插入位点。该技术虽然操作程序复杂，周期长和成本高，但是因其高度准备性，因此一直以来都被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法[22-24]。
2.3.4 Tail-PCR Tail-PCR是可以确定外源抗虫基因它插入水稻基因组位置的技术。吉林省农业科学院金咏梅马瑞等利用Tail-PCR方法，将转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号的左、右边界旁侧序列，依据旁侧序列确定T-DNA在基因组中的插入位点，并建立吉生粳3号品系特异性 PCR方法。利用农杆菌遗传转化方法导入的外源抗虫基因在宿主水稻基因组的插入位点是随机的，每个转化事件中外源抗虫基因和水稻基因组DNA拼接组成的旁侧序列具有唯一性。T-DNA整合过程是一个复杂的异常重组过程，包括水稻基因组整合位点的删除和重复，T-DNA序列的删除和重复，以及水稻染色体上的易位和到位等现象。染色体步移(Chromosomewalking)是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。分离旁侧序列的染色体步移方法主要采用染色体步移技术中的半随机引物PCR策略。半随机引物PCR策略中的热不对称交错PCR(Tail-PCR)是将目标序列旁的已知序列中设计的3个嵌套的特定引物(specialprimerSP1，SP2，SP3)分别与1个具有低Tm值的随机简并引物相结合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物的方法。根据所分离的旁侧序列，通过与NCBI 的比对分析确定T-DNA在基因组中的整合位点。该序列是不同转基因作物品系的特异性身份标识，根据其建立的品系特异性检测方法能快速、准确地鉴定不同的转基因作物品系[25-26]。利用Tail-PCR技术检测抗虫转基因水稻，保证了抗虫转基因水稻检测的准确性和专一性，为监管抗虫转基因水稻的育种、生产、加工和销售提供了可靠的技术支撑[27-28]。利用外源抗虫基因在水稻基因组上整合位点的唯一性，可以建立抗虫转基因水稻品系特异性检测方法，该方法可以根据外源抗虫基因与旁侧水稻基因组连接区序列为靶标设计引物，使用Tail-PCR方法扩增出对照和抗虫转基因品系特异的PCR条带[29]。目前，我国抗虫转基因水稻安全试验阶段过程中，要求提供转入外源抗虫基因提供插入位点碱基序列。因此，Tail-PCR技术是转基因抗虫水稻商品化不可或缺的一项技术。
2.3.5 基因芯片 当常规的一些检测方法需要操作繁琐的转膜、杂交等，费用高同时不能快速精准的检测，有些方法更不适合大批量样品的检测。最近几年发展起来一种专门用来检测核酸的生物芯片，亦称基因芯片，是多学科交叉融合产生的高新技术产品。基因芯片是利用核酸互补杂交原理研制的，其原理是在一块固相支持介质表面固定已知序列的DNA/RNA片断，形成DNA/RNA微矩阵，即核算探针;将荧光标记分子通过体外转录或扩增等技术掺入到样品RNA或DNA当中，与位于微阵列上的已知DNA核酸探针序列杂交，通过荧光显影法等对杂交信号强度进行检测分析，获得序列完全互补的探针序列，再用计算机软件比较和综合分析数据后，即可获得样品中分子数量和大量基因表达信息[30]。目前，将通用的报告基因、抗虫基因、启动子和终止子的特异片断制成检测芯片与待测产品的DNA进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析，就可以判断待测样品是否为抗虫转基因水稻。
3 小结与展望
转基因抗虫水稻检测涉及到的检测内容主要是蛋白质检测和核酸检测。蛋白质检测主要利用抗原抗体特异性反应原理进行，实验操作简便、快速，结果准确可靠。在核算检测方面，PCR技术经过不断优化后，定性、定量检测检测范围更广，具有特异性好，灵敏度高等优点被广泛使用。近年来发展的Tail-PCR技术，虽然建立在Southern Blot技术基础之上，可是能够定位抗虫基因的位置，这在技术领域上是一大突破。基因芯片技术虽然成本高，数据分析复杂，但是其优势在于高密度、高通量，用量少，快速而且准确。因此，今后转基因检测技术研究的发展趋势必然是将各种检测技术结合起来，建立更加高效、快速、便捷、高通量、低成本的新检测方法。
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(责编：张宏民)
作者：向阳
第三篇：水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响
摘要[目的]研究水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A 的fkbM基因进行基因敲除，构建突变菌株ΔfkbMXoo，同时构建互补菌株ΔfkbMXoo (C)。通过运动性试验，确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99A相比，ΔfkbMXoo突变体运动性明显减弱，而互補菌株ΔfkbMXoo (C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。
关键词fkbMXoo;运动性;水稻白叶枯病菌
A
Key wordsfkbMXoo;Motility;Xanthomonas oryzae pv.oryzae
作者简介伍甜(1986—)，男，湖南衡阳人，硕士，从事分子生物学及植物病理学研究。
收稿日期2016-12-23
水稻白叶枯病(Bacterial blight of rice)是我国水稻的三大病害之一，对水稻危害程度高，这种病害由黄单胞菌属水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo)侵染引起，属于细菌性病害。当水稻被白叶枯病菌感染后，通常会引起水稻减产20%～30%，在发病严重的水稻产地可能减产50%以上[1]。细菌通过鞭毛进行游动，鞭毛是细菌最主要的运动器官，细菌的游动性与致病性紧密相关[2] ，Xoo是单级生鞭毛，fkbM基因位于Xoo鞭毛糖基化岛基因簇上，其上游是糖基转移酶〖STBX〗rbfC基因，orfN、orf1和orf2是糖基转移酶基因，rbfC与orfN、orf1和orf2同源性很高[3] 。研究发现，位于糖基化岛中的糖基转移酶基因〖STBX〗orfN、orf1和orf2对细菌鞭毛运动性有影响[4]。但是fkbM基因对Xoo运动性的影响尚未有明确研究，该研究探索了fkbM基因对Xoo运动性的影响，为水稻白叶枯病菌致病机理研究提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒。
水稻白叶枯病菌PXO99A菌株，大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α 菌株及用于互补分析的广寄主范围载体 pHM1来源于中国农业科学院植物保护研究所;此次双交换突变体的载体 pK18mobsacB由中国科学院微生物研究所刘双江研究员提供;含庆大霉素(Gentamicin)抗性基因的载体 pBBR1MCS-5来自于中国农业科学院植物保护研究所;克隆载体 pMD18-T 购买于 TaKaRa(大连)公司。
1.1.2主要生化试剂与仪器。
试验所用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和Taq DNA 聚合酶均购买于 TaKaRa(大连)公司;抗生素均购买于Sigma公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购买于天根生物公司(北京);其他试剂均为国产分析纯，购买于北京化工厂。试验过程中使用的抗生素及其浓度如下：壮观霉素(Sp)25 μg/mL、氨苄青霉素(Amp)100 μg/mL、庆大霉素(Gm)25 μg/mL。所用仪器主要有电转仪(Bio-Rad公司);PCR 仪(Biometra 公司);PerkinElmer lambda 35 型分光光度计(美国珀金埃尔默公司)。
1.2方法
1.2.1fkbM基因突变体自杀载体的构建。以PXO99A基因组为模板，运用Primer 5软件设计引物，LfkbMR：5′-CGGAATTCGTGGGTGCCAATGCTGTT-3′酶切位点EcoR I，LfkbMF：5′ -CGGGATCCGCCTACATGGGACTCGGGA-3′酶切位点BamH I;RfkbMR：5′-CCAAGCTTGAATGGGAAGCATGTGGC-3′酶切位点Xba I，RfkbMF：5′-GCTCTAGAGCCCAGGAATATTCACGATT-3′酶切位点Hind Ⅲ。
扩增fkbM基因的左臂，PCR的扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增(95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min)，最后在72 ℃进行延伸补平10 min。扩增fkbM基因的右臂，PCR的扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增(95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min)，最后在72 ℃延伸补平10 min。通过琼脂糖凝胶回收，得到左、右臂基因片段，再通过T4连接酶，连接到pMD18-T载体上，热转化入E.coli 感受态细胞，通过培养提取，获得连接后质粒，即pMD左臂和pMD右臂，对扩增片段进行测序鉴定后，琼脂糖凝胶回收质粒。使用EcoR I和BamH I酶双酶切pMD右臂片段，琼脂糖凝胶回收右臂片段后，与EcoR I和BamH I酶双酶切的pMD左臂载体进行连接，转化至E.coli 感受态细胞，得到重组质粒 pMD左右臂。EcoR I和Hind Ⅲ酶切消化pMD左、右臂，通过Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ 双酶切得到左右臂片段，琼脂糖凝胶回收质粒后，与通过Hind Ⅲ和Xba Ⅰ 双酶切 pK18mobsacB质粒载体连接，得到的质粒含有左右臂pK18mobsacBfkbM后，突变体自杀载体成功构建。
1.2.2fkbM基因突变体的构建。
(1)配制PSA 固体培养基，采用划线的方式活化野生型菌株PXO99A，置于28 ℃恒温培养箱，倒置培养2～3 d(防止霉菌污染)。
(2)在培养基中，挑取单个菌落，接种于 3 mL的M210 液体培养基中，200 r/min 、28 ℃恒温摇床中培养2 d，进一步活化菌株。
(3) 以1%的接种量转接到500 mL的M210 液体培养基中，200 r/min、28 ℃恒温摇床中培养至对数生长中期(OD600=1.0～1.2)。
(4)将含有菌液的培养基取出，置于冰上，冰浴 20 min，4 ℃、5 000 r/min离心10 min后取出倒出菌体。
(5)经过滤膜过滤的10%甘油，先置于冰上预冷，取出的菌体用预冷的等体积的甘油轻轻吹洗3次。
(6)将离心机设置4 ℃、5 000 r/min，对菌体进行离心，收集菌液，去除上清，在离心的最后1次，预留10%甘油轻轻吹洗，重悬菌体，此时该菌体的密度约为1.0×109个/mL。
(7)用TP管进行分装，每管约 30 μL，放入液氮速冻，将剩余的感受态细胞置于-80 ℃冰箱中备用。
(8)吸取20～50 ng 含有左右臂的pK18mobsacBfkbM 质粒加入到前期制作好的30 μL PXO99A 感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀质粒与感受态细胞，放入电击杯中(2 mm-gap)，用手轻轻振动，使液体沉降至杯底，然后开始电击转化(V=2.0 kV，C=25 μF，R=200 Ω)，吸取电击后的混合物加入到含有1 mL LB培养基的TP管中，置于100 r/min 、28 ℃恒温摇床中，振荡培养 6 h后，吸取该菌液，均匀涂布于含相应抗生素的 PSA或 LB 平板上，置于28 ℃恒温培养箱中，倒置继续培养3～7 d。
(9)提取含有突变体质粒pK18mobsacBfkbM ，将其电击转化，导入PXO99A 感受态细胞中，将电击后的混合溶液均匀涂布于含Gm 抗性的LB 平板上，通过抗性初步筛选转化子，放入28 ℃恒温培养箱中，倒置培养3～7 d，将能够在Gm 抗性平板上生长的单个菌落挑出，于含10%蔗糖的PSA 平板上划线培养，再次筛选转化子;最终还能长出的菌落，在同时含有Gm 抗性和10%蔗糖的PSA 平板上继续划线培养，还能继续长出菌落，该菌落即为突变菌株。自杀质粒pK18mobsacBfkbM 上含有高蔗糖致死基因sac B，通过筛选能在Gm 抗性和高浓度蔗糖平板上生长的菌落，得到fkbMXoo突变体基因，这是通过同源重组，Gm 等位置换了fkbM基因，最終所得突变菌株基因组中不含有自杀载体及高蔗糖致死基因sac B 的序列，最后通过PCR 扩增来验证突变菌株是否获取。
(10)从这些长出的菌落中，挑选5个单菌落，继续转接到不含Gm抗性的PSA平板上，放入恒温培养箱中，28 ℃培养，每隔2～3 d，从培养的菌中转接1次，连续继代培养20代。再次验证突变体，将培养20代后的突变体均匀涂布到含Gm抗性的PSA平板上，放入28 ℃恒温培养箱中培养，长出的菌落再次用PCR扩增的方法来检测突变体的稳定性。
1.2.3ΔfkbMXoo互补菌株的构建。以PXO99ADNA 为模板，用Primer 5软件设计引物，fkbMF：5′-CC〖ZZ(Z〗AAGCTT〖ZZ)〗GCATGGTGCACGGTCCC-3′酶切位点Hind Ⅲ，fkbMR：5′-GC〖ZZ(Z〗TCTAGA〖ZZ)〗TTACTCCGCCCAAGGCGG-3′酶切位点Xba I 。
以PCR 扩增包括自身启动子的fkbM序列，扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增(95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min)，最后在72 ℃下对扩增产物进行延伸补平10 min。将扩增出来的PCR产物，直接连接至pMD18-T载体上，然后送公司测序鉴定确认，将确认好的片段连接至pMD18-T载体，采用Hind Ⅲ和Xba I双酶切，通过凝胶电泳回收约1.2 kb 的目的片段，与经过同样Hind Ⅲ和Xba I双酶切的pBBR载体进行回收，将目的片段与pBBR载体进行连接，热击转化至E.coli 感受态细胞，然后用含有Amp抗性的LB固体平板进行筛选，挑取单个菌落，进行PCR扩增，得到含有目的片段的条带，说明构建的互补质粒成功，将该质粒命名为pBBRfkbM质粒。通过电击转化将质粒转入至ΔfkbMXoo感受态中，置于100 r/min 、28 ℃恒温摇床中，振荡培养 6 h。最后涂布于含Amp抗性的PSA 平板进行阳性转化子筛选，得到的菌株为ΔfkbMXoo的互补菌株ΔfkbMXoo (C)。
1.2.4鞭毛运动性测定。
通过划线培养，在PSA 平板活化待测菌株，挑取单个菌落，接种于M210 液体培养基中，置于200 r/min、28 ℃恒温的摇床中培养至对数生长期，5 000 r/min离心收集菌体，用无菌水将待测菌液稀释到OD600=0.5，取1 μL 稀释后的待测菌液，点接于半固体PSA培养基平板中央位置，至于28 ℃恒温培养箱，培养4 d后，观察待测菌运动情况。
2结果与分析
2.1ΔfkbMXoo突变体菌株的构建验证
由于野生的PXO99A菌株基因组内是不含Gm抗性基因的，因此可以用Gm抗性来筛选突变体;由于突变体插入了Gm抗性基因，因此能够在含有Gm抗性的PSA固体培养基上生长。挑选5个单个突变克隆，在不含Gm抗性的PSA平板上划线，置于28 ℃恒温培养箱中培养，每隔3 d转接1次，连续继代培养3代，然后取第3代的培养液，在含Gm抗性的PSA平板上进行划线培养。挑取单菌落，使用引物LfkbMR/RfkbMF进行扩增，PCR的扩增程序如下：先通过95 ℃预变性3 min，再经过30个循环扩增(95 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min)，最后在72 ℃进行延伸补平10 min。通过PCR扩增的方法进行验证，由于Gm抗性基因比所置换的fkbM基因短约500 bp，所以用PXO99A野生型菌种作为模板的扩增条带要比用突变菌株ΔfkbMXoo菌株扩增条带小约500 bp(图 1)。PCR结果验证显示已获得稳定的ΔfkbMXoo菌株。
2.2ΔfkbMXoo互补菌株的构建验证
配制PSA 平板(含Gm和Sp双抗性)，对阳性克隆进行筛选，将单个菌落在培养基上划线，放入28 ℃恒温培养箱培养，每3 d转接1次，经过3代的连续继代培养。从互补菌株中提取质粒作为模板，使用引物fkbMF/fkbMR，通过PCR扩增，PCR的扩增程序如下：先通过95 ℃预变性3 min，再经过30个循环扩增(95 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min)，最后在72 ℃进行延伸补平10 min。PCR扩增的目标片段长度约为1.2 kb，通过PCR扩增目的基因(图2)，再进行琼脂糖凝胶电泳，可以得到大小一致的目的片段，说明重组克隆已进入ΔfkbMXoo 并稳定存在，互补菌株为ΔfkbMXoo (C)。
2.3ΔfkbMXoo鞭毛运动性测定
将 PXO99A、ΔfkbMXoo 和ΔfkbMXoo (C)分别接入M210 液体培养基中，置于200 r/min、28 ℃恒温摇床中培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水稀释菌体至OD600=0.5，取1 μL培养液点接于半固体培养基，28 ℃培养4 d，观察各个菌株的运动痕迹，量取各个培养皿中菌体游动的直径长度。培养4 d后，发现ΔfkbMXoo 的游动直径比PXO99A 减小约0.5 cm，丧失了部分游动能力，互补菌株可以基本恢复至野生型运动水平(图3)，通过20个平板的重复验证，发现结果重复性良好，说明fkbM基因的突变使菌体的运动能力下降。
3结论与讨论
fkbM基因存在于Xoo基因中的鞭毛糖基化岛的基因簇中，其具体生物学功能尚不明确，由于其处于鞭毛糖基化岛基因簇当中，因此可能对鞭毛蛋白产生影响。该研究成功构建了水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白糖基化岛fkbM基因缺失的突变体，并构建了相应的互补菌株，发现fkbM基因缺失能够减弱Xoo的运动能力。
通过生物信息学分析，fkbM基因是一个甲基化转移酶，分子量预测39 ku。通过对水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白的提取，SDS-PAGE与Western Blot检测时发现，分子量大小为45 ku，说明蛋白存在着修饰。另外发现fkbM基因突变菌株鞭毛蛋白与rbfC基因突变体鞭蛋白均能够引起鞭毛蛋白分子量减小。rbfC基因是一个糖基转移酶，根据现有研究可知，丁香假單胞菌的鞭毛糖基化岛基因簇由3个基因〖STBX〗(orf1～orf3)组成，其中orf1和orf2是糖基转移酶基因[4-5]，在丁香假单胞菌缺失糖基转移酶基因后，由于鞭毛蛋白缺少糖基化修饰，鞭毛分子量也减小。可以推测fkbM基因或rbfC基因的缺失影响了白叶枯病菌鞭毛蛋白糖基化的修饰，进一步导致水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白分子量减小。fkbM基因的缺失，影响了鞭毛分子量的大小，同时已知蛋白糖基化能够影响蛋白的三维结构[6]，可以推测当fkbM基因缺失，鞭毛糖基化过程也受到了影响，从而影响了鞭毛蛋白的构象，进一步影响了鞭毛的游动。通过研究fkbM基因对Xoo运动性的影响发现，细菌运动性通常与致病性存在紧密联系。该研究对水稻白叶枯病菌致病机理提供了新的发现，能为研究水稻白叶枯病菌致病机理打下基础。
参考文献
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作者：伍甜