基层单位食品安全论文提纲

论文题目：保健食品中他达那非类药物免疫检测方法研究

摘要：他达那非作为第二代磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂,是一种治疗男性勃起功能障碍的处方药,经常被非法添加到声称具有抗疲劳、增强免疫力、补肾壮阳等功能的保健食品中。但此类药物与硝酸酯类药物同时服用会引起低血压,甚至死亡。因此,加强对此类药物非法添加的监控对保障食品安全至关重要。目前,此类药物的检测主要依赖于液相色谱、气相色谱及色谱质谱联用等大型仪器手段。但是,大型仪器分析方法检测成本高、需要专业的操作人员、且不能进行现场监控,难以普及,尤其是在经济支持薄弱的基层单位。免疫分析法是运用抗原抗体反应与酶促反应相结合的一种快速、灵敏、低成本、易于现场操作的检测技术,可与大型仪器确证技术形成互补,高低搭配,满足大批量样品的快速、筛查确证检测需求。目前,有关PDE-5抑制剂他达那非类药物的免疫检测方法尚未见报道。因此,本文以他达那非为对象,开展半抗原/抗原设计合成、动物免疫及宽谱特异性抗体制备、间接竞争酶联免疫分析方法和胶体金免疫层析试纸条等研究。主要研究内容和结果如下:（1）以氨基他达那非为原料设计合成出了5种半抗原H1H5,并通过偶联载体蛋白进行动物免疫及抗血清的筛选,制备得到了2种高效的能够特异性识别他达那非类药物的抗体PAb-H5-AmTD-MA和PAb-H5-AmTD-MA-KLH,在1μg/mL他达那非药物条件下,其抑制率分别为89%和95%。（2）基于PAb-H5-AmTD-MA抗体建立了检测他达那非类药物的间接竞争酶联免疫分析（ic-ELISA）方法。通过优化确定了最佳反应参数:包被原浓度为32.15 ng/m L,抗体稀释倍数为8 k,药物稀释缓冲液为pH 8.4的0.01 mol/L含0.2%吐温-20的PBST,竞争反应时间为40 min,二抗反应时间为30 min,显色时间为10 min,体系中甲醇浓度控制在5%以内,建立了ic-ELISA方法,该方法对他达那非的检测限（LOD）为0.027ng/mL、IC50为0.90 ng/m L、线性范围（IC20-IC80）为0.099~8.22 ng/mL;保健酒、胶囊等固体和液体保健食品样品中他达那非的平均添加回收率在84.92%~116.19%之间,变异系数在6.37%~14.28%之间,与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好（R2=0.9993）。（3）基于PAb-H5-AmTD-MA-KLH抗体制备了检测他达那非类药物的胶体金免疫层析试纸条（GICA）。通过柠檬酸还原法烧制了~16nm的胶体金溶液,并优化确定了最佳方法条件为:胶体金标记抗体时胶体金溶液pH值为8.5、抗体用量为0.75μg/m L;金标抗体及包被原浓度均不稀释最佳,此时金标抗体浓度为原始胶体金溶液的1/10,包被原浓度为1 mg/mL;最佳的样品垫膜材质为GF-06;样品垫处理液为0.2M pH 7.5 Tris-HCl缓冲液;药物稀释液为0.01 M pH 7.4的PBST,其甲醇含量最好不超过5%;质控线二抗稀释倍数为30倍,此时二抗浓度为0.27 mg/mL,进一步构建了定量分析GICA试纸条,对他达那非的检测范围为0.71~141.99 ng/mL,IC50为10.04ng/mL;保健酒、胶囊等固体和液体保健食品样品中他达那非的平均回收率在93.34%~121.50%,平均变异系数在0.95%~13.33%,与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好（R2=0.9598）。（4）采用以上两种方法对保健酒类液体样品及固体样品盲样进行检测,发现9种保健酒中有3种检测为阳性,13种固体样品中有4种检测出为阳性,且含量均在μg/m L以上;与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好,相关系数平方（R2）分别为0.9758（ic-ELISA）、0.9287（GICA）。

关键词：保健食品;他达那非;氨基他达那非;酶联免疫分析法;胶体金免疫层析试纸条

学科专业：食品科学

摘要

Abstract

主要英文缩略表

1 前言

1.1 他达那非简介及其危害

1.2 他达那非等 PDE-5 抑制剂残留现状

1.3 他达那非类药物检测方法研究现状

1.3.1 薄层层析色谱法

1.3.2 高效液相色谱法

1.3.3 色谱--质谱联用法

1.3.4 核磁共振法

1.3.5 毛细管电泳

1.4 免疫分析方法

1.5 本研究的目的意义、内容及技术路线

1.5.1 研究的目的意义及主要内容

1.5.2 研究技术路线图

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要仪器设备

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液

2.2 试验方法

2.2.1 半抗原的合成

2.2.2 半抗原的结构鉴定

2.2.3 半抗原与载体蛋白的偶联及鉴定

2.2.4 三硝基苯磺酸（TNBS）法测定偶联物偶联比

2.2.5 动物免疫

2.2.6 抗血清质量的测定

2.2.7 抗血清的纯化

2.3 间接酶联免疫分析方法的建立

2.3.1 ic-ELISA基本步骤

2.3.2 ic-ELISA工作条件优化

2.3.3 ic-ELISA标准曲线的建立

2.3.4 方法特异性

2.3.5 样品前处理及基质干扰的消除

2.3.6 实际样品检测

2.3.7 与HPLC-MS/MS结果对比

2.4 胶体金免疫层析试纸条的制备

2.4.1 胶体金制备

2.4.2 抗体及包被原的选择

2.4.3 胶体金标记步骤优化

2.4.4 金标抗体和检测线包被抗原的稀释倍数棋盘优化

2.4.5 样品垫膜材的优化

2.4.6 样品垫处理液的优化

2.4.7 药物稀释液的优化

2.4.8 药物稀释液中甲醇含量的优化

2.4.9 质控线二抗的稀释倍数优化

2.4.10 试纸条的组装

2.4.11 试纸条的测试及结果判定

2.4.12 GICA标准曲线的建立

2.4.13 方法的特异性

2.4.14 实际样品检测

2.4.15 与HPLC-MS/MS结果对比

3 结果与分析

3.0 半抗原的设计

3.1 半抗原合成及结构鉴定

3.2 人工抗原的合成与鉴定

3.3 人工抗原偶联比的测定

3.4 抗血清的评价

3.5 基于抗体PAb-H5-Am TD-MA建立ic-ELISA方法

3.5.1 包被原的选择

3.5.2 工作条件优化

3.5.3 ic-ELISA标准曲线的建立

3.5.4 方法的特异性评价

3.5.5 样品前处理及基质干扰的消除

3.5.6 实际样品检测

3.6 胶体金免疫层析试纸条的制备

3.6.1 胶体金质量鉴定

3.6.2 抗体及包被原的选择

3.6.3 胶体金标记步骤优化

3.6.4 金标抗体和检测线包被抗原的稀释倍数棋盘优化

3.6.5 样品垫材质的优化

3.6.6 样品垫处理液的优化

3.6.7 药物稀释液的优化

3.6.8 药物稀释液中甲醇含量的优化

3.6.9 质控线二抗的稀释倍数优化

3.6.10 GICA标准曲线的建立

3.6.11 方法的特异性

3.6.12 实际样品检测

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 半抗原的设计与合成

4.1.2 理化因素对免疫分析方法的影响

4.1.3 样品前处理

4.1.4 样品垫膜材质及其处理液的影响

4.2 结论

4.3 创新点

4.4 展望

致谢

参考文献

附录B 本研究所涉及的他达那非功能及结构类似物结构信息

附录C 他达那非半抗原结构鉴定质谱图及核磁图