橙皮素抑制癌细胞论文提纲

论文题目：柑橘黄酮抗氧化、抗增殖及抗衰老活性研究

摘要：活性氧（reactive oxygen species,ROS）,是诸如神经退行性疾病和癌症等慢性疾病的发生和发展过程中一个重要的影响因素。通过合理的膳食干预能清除体内过多的ROS,是预防慢性疾病的有效手段之一。近年来,具有抗氧化功能的食品以及膳食补充剂,逐渐成为食品科学领域研究的热点之一,受到越来越多的关注。柑橘在我国种植历史悠久,是人们生活中常见的水果,营养丰富,口感清甜,深受广大消费者喜爱。同时柑橘中黄酮类物质含量丰富,主要包括黄烷酮类、黄酮和黄酮醇等3类物质。现代药理研究已证实柑橘黄酮具有较强的抗氧化、抗菌与抗病毒、抗肿瘤等生理活性。但以往的研究主要集中于柑橘粗提物比较或其中某个单体的活性研究,而关于单体之间可能存在的加和、协同或拮抗作用的信息却很少。因此,本课题选用四种柑橘黄酮类化合物:川陈皮素（nobiletin,NOB）、橘皮素（tangeretin,TAN）、橙皮素（hesperidin,HES）和柚皮素（naringenin,NAR）,系统分析了其抗氧化、抗增殖、抗衰老活性,借助PC12大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞模型、Hep G2人体肝癌细胞模型和秀丽隐杆线虫生物模型,探究柑橘黄酮抗氧化、协同抑制人肝癌细胞增殖及延长寿命的分子机制,以期为具有抗癌活性和抗衰老活性功能食品的研制提供理论基础。具体结果如下:首先,考察四种柑橘黄酮的抗氧化的活性。川陈皮素具有最强的氧自由基吸收能力,ORAC值显著高于其他黄酮类物质（52.17±1.14μmol TE/μmol）,而两种黄烷酮:橙皮素、柚皮素ORAC值次之,橘皮素ORAC值最低。建立以谷氨酸（Glu）诱导的PC12细胞氧化损伤模型,研究四种单体在保护氧化损伤方面的活性。在低浓度（0.1μM）的川陈皮素和橙皮素保护下,细胞活力便可显著回升（p＜0.05）,而细胞活性氧（ROS）增长率、LDH释放率显著下降,同时抗氧化酶SOD酶活力显著回升,MDA含量显著下降。橘皮素的保护活性次之,而柚皮素几乎无氧化应激保护活性。之后,以人肝癌细胞Hep G2为模型进行四种单体的抑制瘤细胞增殖活性研究;并使用两两单体复配物研究联合作用,并从细胞水平探索抗细胞增殖的分子机理。橘皮素的抗增殖能力最佳,其半数抑制浓度(EC50)为68.67±2.75μM,川陈皮素及橙皮素活性稍弱,分别为78.94±2.88和92.13±2.91μM,同时这三类单体对Hep G2细胞的半数细胞致死率(CC50)均大于200μM,选择指数SI值均大于2,而Hep G2细胞对柚皮素的敏感性较低,在200μM的浓度范围内,未检测到显著抗增殖活性。为了单体之间的交互作用,将柚皮素分别与两种多甲氧基黄酮单体（川陈皮素、橘皮素）复配,研究单体间协同抗增殖作用及机理。结果显示,柚皮素与川陈皮素或橘皮素联用时,对癌细胞的抑制作用显著增高,EC50分别降至103.66±3.44、96.15±1.90μM,并且在抑制率为50%时,CI值分别为0.68±0.01、0.748±0.02,表现出较好的协同作用。并且在50～95%的抑制率范围内,均可起到非常好的协同效果。运用流式细胞仪来考察柚皮素和川陈皮素、橘皮素的协同作用对细胞凋亡和细胞周期的影响,当半数剂量的复配物联用时,Hep G2细胞的早凋率显著上升,同时细胞被阻滞在G0/G1期。利用Western blot法分析两个复配物对细胞周期调控蛋白表达水平的影响。两个复配物均可呈剂量依赖性地下调CDK4的表达水平,而在对p21表达水平的调控上出现非剂量依赖性,p21的表达量先减少而后上调,在高浓度复配剂量0.5EC50×（NAR+NOB）,p21表达显著上调,约为1.48倍（p＜0.05）。上述结果表明,两种复配物（柚皮素和川陈皮素、橘皮素）通过下调CDK4蛋白表达,同时增加p21蛋白表达,来调控细胞周期,从而发挥抗增殖作用。最后,建立秀丽隐杆线虫的衰老模型,检测川陈皮素的抗衰老活性。通过寿命分析、各项健康指标测定、抗氧化应激、线虫体内活性氧（ROS）检测和抗氧化酶活性测定实验的结果显示,川陈皮素在3.13～12.5μM的浓度范围内能延长线虫寿命,且具有一定浓度依赖性;并在不影响体长及繁殖能力的情况下,显著提高行动力、降低体内脂褐素的含量来延缓衰老。同时,川陈皮素可显著延长线虫在高温、紫外辐射、氧化应激刺激下的寿命,降低体内ROS水平及MDA含量,提高抗氧化酶活性（SOD、CAT）,表明川陈皮素的抗衰老活性与抗氧化活性也密切相关。此外,运用PCR技术,结果发现川陈皮素可上调sod-3,hsp-16.2,gst-4,skn-1,sek-1和sir-2.1的表达,这表明川陈皮素可能通过激活DAF-16、HSF-1和SKN-1等转录因子,调控下游靶基因表达水平,进而发挥延长寿命及提高压力抗性的效果。综上,NOB在延长寿命及其相关的健康寿命和抗压力方面具有潜在的应用价值。

关键词：柑橘黄酮;抗氧化;抗增殖;抗衰老

学科专业：食品科学与工程

摘要

Abstract

主要缩略词中英文对照表

第一章 绪论

1.1 氧化应激与慢性病

1.2 衰老理论

1.2.1 程序性衰老

1.2.2 损伤性衰老

1.3 秀丽隐杆线虫简介

1.3.1 线虫衰老调控机制

1.4 植物化学物简介

1.5 柑橘黄酮的研究现状

1.5.1 柑橘黄酮的分类

1.5.2 柑橘黄酮的生物活性

1.6 Chou-Talalay联合作用体系

1.7 研究内容

第二章 柑橘黄酮抗氧化研究

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.2.1 主要材料与试剂

2.2.2 仪器与设备

2.3 实验方法

2.3.1 氧自由基吸收能力(ORAC)测定

2.3.2 细胞培养

2.3.3 谷氨酸对PC12细胞的损伤模型建立

2.3.4 柑橘黄酮对氧化损伤的PC12细胞的保护作用

2.3.5 PC12细胞上清液中LDH活性的测定

2.3.6 PC12细胞内活性氧测定及抗抗氧化酶活性

2.3.7 数据分析

2.4 结果与讨论

2.4.1 化学抗氧化能力(ORAC)评价

2.4.2 谷氨酸诱导PC12细胞的损伤模型

2.4.3 柑橘黄酮对Glu氧化损伤PC12细胞的影响

2.4.4 柑橘黄酮对Glu氧化损伤细胞LDH释放率影响

2.4.5 柑橘黄酮对Glu氧化损伤细胞ROS生成的影响

2.4.6 柑橘黄酮对Glu氧化损伤细胞抗氧化酶活性影响

2.5 本章小结

第三章 柑橘黄酮抑制HepG2细胞增殖的联合作用

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.2.2 主要试剂

3.2.3 仪器与设备

3.3 实验方法

3.3.1 HepG2细胞培养

3.3.2 细胞毒性和抗增殖活性测定

3.3.3 柑橘黄酮抑制HepG2细胞增殖的联合作用

3.3.4 细胞周期分析

3.3.5 细胞凋亡测定

3.3.6 Western Blot检测

3.4 结果与讨论

3.4.1 四种柑橘黄酮单体对HepG2细胞的细胞毒性和抗增殖作用

3.4.2 PMFs联合NAR对 Hep G2 细胞的联合抗增殖作用

3.4.3 交互作用的定量分析

3.4.4 PMFs联合NAR对肝癌细胞Hep G2 细胞周期的影响

3.4.5 PMFs联合NAR对肝癌细胞Hep G2 细胞凋亡的影响

3.4.6 PMFs联合NAR对 Hep G2 细胞周期相关蛋白表达的影响

3.5 本章小结

第四章 秀丽隐杆线虫衰老模型研究川陈皮素抗衰老活性

4.1 引言

4.2 实验材料与仪器

4.2.1 主要试剂

4.2.2 主要设备

4.3 实验方法

4.3.1 食物大肠杆菌的制备

4.3.2 线虫的培养、传代及计数

4.3.3 线虫的同期化处理

4.3.4 线虫的寿命试验

4.3.5 衰老相关表型分析

4.3.6 线虫繁殖力实验

4.3.7 应激损伤保护实验

4.3.8 线虫体内活性氧测定及抗氧化酶活性

4.3.9 逆转录定量PCR(RT-q PCR)

4.4 结果与讨论

4.4.1 NOB延长线虫的寿命

4.4.2 NOB延缓线虫衰老相关下降指标

4.4.3 NOB对生育率无显著影响

4.4.4 NOB对应激损伤的保护作用

4.4.5 NOB降低体内ROS积累、提高抗氧化酶活性

4.4.6 NOB调节和延长寿命和抗应激相关基因的表达水平

4.5 本章小结

结论与展望

1.结论

2.创新点

3.展望

参考文献

致谢

附件