P2Y受体与卵巢癌转移相关性初步研究

P2Y受体是一类主要通过ATP发挥作用的G蛋白偶联核苷酸受体[1]。迄今为止, 已从人体组织细胞克隆出9种P2Y受体, 分别为P2Y1、2、4、6、11、12、13、14、15受体, 其在体内各种组织广泛分布, 功能各异。在免疫系统中, 免疫细胞表面表达的P2Y受体主要是胞外核苷酸通过Gi亚基介导升高细胞Ca2+使细胞产生强趋化效应, 从而调节免疫细胞对胞外核苷酸的趋化性[2]。本文通过检测P2Y受体在卵巢癌细胞系中的表达情况, 来探讨P2Y受体在卵巢癌转移中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 引物

利用斯坦福大学引物设计软件在线设计了5种P2Y受体即P2Y1、P2Y6、P2Y11、P2Y12和P2Y15的引物, 引物见Table 1, 引物均由上海生工生物技术有限公司合成。如表1所示。

1.2 RT-PCR

用含10%的小牛血清的DMEM (含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、100U/mL庆大霉素) 与37℃CO2培养箱中饱和湿度分别培养5株卵巢癌细胞系3AO、HO-8910、SW626、SKOV-3和Caov-3, 以上5株卵巢癌细胞系均购自中南大学湘雅医学院。当细胞密度达到80%-85%左右时, 按TRIzol试剂盒 (MBI公司) 操作说明提取总RNA, 用逆转录试剂盒 (Fermentas公司) 合成第一链, PCR扩增P2Y受体, 以GAPDH为内对照, 其引物序列为:Forward primer:5'A A T C C C A T C A C C A T C T T C C A 3', R e v e r s ep r i m e r:5'CCTGCTTCACCACCTTCTTG3', 扩增片断大小为580bp。反应条件:94℃预变性3min, 94℃30s, 55℃30s, 68℃1min, 30个循环, 最后68℃延长10min。反应完毕后, 1.5%凝胶电泳, 凝胶自动成像仪拍照。

1.3 趋化试验

以48孔微趋化板检测ATP对卵巢癌细胞CNE2的趋化作用。下室分别加入不同浓度 (1.0×10-2mol·L-1, 0×10-9mol·L-1) 的ATP, 同时以无血清的培养基1640作阴性对照, 均为3复孔。上室中加入1.0×106的CNE2细胞, 上下室之间铺上10μm孔径的PVP聚碳酸膜。于35℃含5%CO2孵箱中孵育4.5h, 以PBS棉签拭去膜背面的细胞, 50%的甲醇固定, 苏木精染色, 计数至少5个视野 (光镜, 放大200倍) 的细胞数。计算趋化指数CI (迁移到含有不同浓度趋化因子液体膜侧的细胞数与迁移到阴性对照液膜侧的细胞数的比值) , 以CI的大小表示趋化活性的高低[3]。实验独立重复3次。

1.4 Checkboard试验

将不同浓度的ATP (1.0×10-2mol·L-1, 0×10-9mol·L-1) 分别与2.0×106的CNE2细胞于35℃含5%CO2孵箱中孵育1h, 然后加入到48孔微趋化板上室中, 下室分别加入不同浓度 (1.0×10-2mol·L-1, 0×10-9mol·L-1) 的ATP, 其余方法同1.3。

1.5 统计方法

趋化活性比较应用SPSS 11.0统计软件对实验数据采用t检验分析。以双侧P<0.05为差异具有显著性意义[4]。

2 结果

2.1 P2Y受体在卵巢癌细胞系中的表达

我们提取5株卵巢癌细胞系的总RNA, RT-PCR检测了5种P2Y受体在卵巢癌细胞系中的表达情况, 图1所示, 除了P2Y12受体不表达外, 其余4种P2Y受体在卵巢癌细胞系中均有不用程度的表达。P2Y11受体除了不表达于3AO外, 在其他细胞株均表达, P2Y15表达于HO-8910和3AO细胞株。

2.2 ATP诱导卵巢癌细胞的移动

趋化实验表明, ATP可诱导卵巢癌细胞的移动, 其趋化指数为4.3±0.6。Checkboard分析显示ATP诱导卵巢癌细胞的移动为定向移动, 而非随机移动 (Table2) 。见表2。

不同浓度的ATP对卵巢癌细胞的趋化活性不同, 浓度为1.0×10-6mol·L-1时趋化活性最高 (图2) , 与对照组1.0±0.4, 比较有显著性差异 (P<0.05) 。

3讨论

细胞外ATP和腺苷是细胞内外重要的信号分子, 具有细胞毒作用, 腺苷及其受体诱导细胞凋亡的机制主要涉及腺苷酸环化酶 (AC) 、cAMP、Ca2+等[5], 主要表现为包括肿瘤细胞在内的多种组织细胞具有细胞毒和诱导凋亡的作用。。

P2Y等多个嘌呤受体与ATP诱导细胞凋亡作用有关。P2Y受体广泛分布于体内很多组织, 是一种典型的G蛋白偶联受体, 由308～355个氨基酸组成, 糖基化后分子量为41～53kD, 其不同的亚型N、C端有很大差异。最初, Drury和Szent等发现胞外核苷酸能使血管舒张, 心跳减慢, 现已证明这可能是P2Y受体介导的EDRF释放效应[6]。60年代, Granum等[5]发现ADP能引起血小板聚集。随后发现ADP通过抑制AC活性, 激活Ca2+释放, 引起聚集效应。现在研究表明[7]P2Y受体主要是通过激活的ERK1/2和p38信号传导通路可能参与肿瘤细胞侵袭转移的调节。然而ERK1/2及p38激酶仅仅是P2Y受体下游效应通路的一部分, 其中可能还有其他通路如PI23K/Akt/PTEN的参与, 并且已有文献报道PI23 K/Akt/PTEN参与肿瘤侵袭转移及进展, 提示了P2Y受体在肿瘤的转移和浸润中起着重要作用。

G蛋白耦联的P2Y受体家族在细胞生长及分化过程中发挥广泛的病理生理学作用, 但对于它们在肿瘤进展中的作用研究甚少。我们的结果表明在5株卵巢癌细胞系中, 均表达P2Y受体, 但各自表达P2Y受体的种类及丰度有很大差异。P2Y12在所有卵巢癌细胞株中均无表达, 而P2Y1弱表达于HO-8910、CAOV-3和细胞中, P2Y6弱表达于HO-8910和SW626细胞, 在其他细胞株中不表达。HO-8910细胞株几乎表达所有检测的P2Y受体, 而3AO细胞株仅表达P2Y15受体。趋化试验显示, 卵巢癌细胞能在ATP作用下发生明显移动, 以ATP浓度为1.0×10-6mol·L-1时趋化作用最明显, 这种迁移是一种定向运动, 而不是随机移动。实验同时表明不同卵巢癌细胞的这种趋化能力不同, 特别是CAOV-3细胞的趋化能力最强。我们的研究显示大部分卵巢癌细胞均同时表达几种不同的P2Y受体, 因而不能排除多种P2受体参与我们所观察到的现象中的这种可能性, 有待于进一步的研究来确定不同P2Y受体的功能。

摘要：目的 探讨P2Y受体在卵巢癌细胞中的表达及其与卵巢癌转移之间的关系。方法 采用RT-PCR检测P2Y受体在卵巢癌细胞系中的表达, 趋化试验分析P2Y受体与卵巢癌转移的关系。结果 P2Y受体在5株卵巢癌细胞中的表达有明显的差异, 其中P2Y12在所有卵巢癌细胞株中均无表达, 而P2Y1弱表达于HO-8910、CAOV-3和细胞中, P2Y6弱表达于HO-8910和SW626细胞, 在其他细胞株中不表达。HO-8910细胞株几乎表达所有检测的P2Y受体, 而3AO细胞株仅表达P2Y15受体。趋化试验表明, 卵巢癌细胞能在ATP作用下发生明显移动, 以ATP浓度为1.0×10-6mol·L-1时趋化作用最明显, 其趋化指数 (CI) 为4.3±0.6, 这种趋化作用是一种定向迁移, 而非随机运动。结论 P2Y受体在卵巢癌的转移中可能发挥着重要的作用。

关键词：卵巢肿瘤,P2Y受体,卵巢癌,转移

参考文献

[1] Abbracchio MP, Burnstock G, Boeynaems JM, et al.International Union of Pharmacology LVIII:update on the P2Y G protein-coupled nucleotide receptors:from molecular mechanisms and pathophysiology to therapy[J].Pharmacol Rev, 2006, 58 (3) :281～341.

[2] Metea MR, Newman EA.Calcium signaling in specialized glial cells[J].Glia, 2006, 54 (5) :650～655.

[3] LIU Chang-hui, YOU San-li, YANG Hui, et al.Effect of Rosiglitazone on secretion of transforming growth factor-β1and apoptosis of vascular smooth musle cell of rat in vitro culture[J].2005, 15 (6) :689～696.

[4] LIU Yan-bing, LI Jian, LIU Tong-lin.Construction of recombinant plasmid vector containing human survivin-1gene and expression in lung adenocarcinoma A549cells[J].China Journal of Modern Medicine, 2005, 15 (6) :683～685.

[5] Ferreira IA, Eybrechts KL, Mocking AI, et al.IRS-1mediates inhi-bition of Ca2+mobilization by insulin via the inhibitory G-protein Gi[J].J Biol Chem, 2004, 259 (5) :3254～3264.

[6] Mene P.Purinergic receptors and nitric oxide in experimental hypertension:the effects of nitric oxide on P2Y receptor resensitization in spontaneously hypertensive rat mesangial cells[J].J Hypertens, 2002, 20 (9) :1515～1519.

[7] Li S, Huang S, Peng SB.Overexpression of G protein-coupled re-ceptors in cancer cells:involvement in tumor progression[J].Int J Oncol, 2005, 25 (5) :1329～1339.