生物信息学生物技术论文提纲

论文题目：基于生物信息学技术探讨双硫仑/铜对小鼠黑色素瘤B16F10细胞的影响及潜在机制

摘要：目的:通过生物信息学技术挖掘恶性黑色素瘤相关的差异表达基因和关键基因,观察双硫仑/铜对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,探讨双硫仑/铜抗瘤作用与关键基因间的关系。方法:通过生物信息学技术挖掘恶性黑色素瘤相关的差异表达基因,将差异表达基因进行GO和KEGG通路分析,并构建差异表达基因的PPI网络图。筛选关键基因,对关键基因进行生存分析。从关键基因中筛选出节点度最高的基因TRIP13,通过GEPIA和Oncomine在线平台展示其在恶性黑色素瘤中的表达量。CCK-8法检测DSF/Cu对B16F10细胞增殖的影响。分别设置空白对照组（Control组,含0.05%二甲基亚砜溶液）和含DSF/Cu的给药组(DSF浓度分别为0.5μM、0.75μM、1μM,Cu2+浓度均为0.5μM),12小时后观察各组的镜下细胞形态。流式细胞术检测对照组和DSF/Cu组24小时后的细胞凋亡情况和细胞周期分布情况。Transwell实验检测对照组和DSF/Cu组24小时后的细胞迁移和侵袭能力。原子力显微镜（AFM）检测DSF/Cu作用于B16F10细胞12小时后细胞胞核区杨氏模量的变化。免疫印迹实验（Western Blot）检测对照组和DSF/Cu组细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3、CDK1、Cyclin B1、MMP9和TRIP13蛋白的表达水平。结果:1、从数据集GSE31879、GSE35389和GSE47980中筛选出457个差异表达基因,其中下调基因293个,上调基因164个。差异表达基因的GO和KEGG通路分析显示,上调基因主要富集于细胞周期、有丝分裂中期板汇集和有丝分裂染色体浓缩,下调基因主要富集于黑色素生物合成过程、黑色素细胞分化和谷胱甘肽代谢。2、PPI网络图共有387个节点和2145条边,其中上调基因151个,下调基因227个。PPI网络中节点度最高的十个差异表达基因被视为关键基因,其中TRIP13的节点度最高,为46,远高于其他关键基因。关键基因的生存分析结果显示具有RAB32,DDX59和VPS18改变的恶性黑色素瘤患者总体生存率更低,具有RAB32和PDK2改变的恶性黑色素瘤患者无病生存率更低。基因表达谱数据动态分析（GEPIA）显示TRIP13在皮肤恶性黑色素瘤中的表达明显高于正常组织。Oncomine数据库Meta分析结果显示,在不同恶性黑色素瘤样本与正常组织数据集中,TRIP13均显著过表达。3、CCK-8法检测发现DSF/Cu可显著抑制B16F10细胞的增殖能力（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,选用0.5μM、0.75μM和1μM DSF/Cu作为后续实验浓度。DSF/Cu作用于B16F10细胞12小时后,0.5μM DSF/Cu组B16F10细胞形态、间隙与对照组相比没有明显差异,0.75μM和1μM DSF/Cu组B16F10细胞变圆脱落、细胞间隙明显增宽。流式细胞术检测发现0.5μM、0.75μM和1μM浓度的DSF/Cu作用于B16F10细胞24小时后,DSF/Cu组细胞的凋亡数量明显高于对照组（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,DSF/Cu组细胞发生了G2/M期阻滞（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.01）。Transwell实验显示,相比于对照组,0.5μM、0.75μM和1μM DSF/Cu组B16F10细胞迁移、侵袭能力均受到显著抑制（P＜0.001）。原子力显微镜的检测结果显示,0.5μM DSF/Cu组B16F10细胞的杨氏模量显著高于对照组（P＜0.01）,即DSF/Cu组B16F10细胞的刚度明显增高、变形能力显著降低。Western Blot结果显示不同浓度DSF/Cu组B16F10细胞中Bax、Cleaved-caspase3蛋白的表达均上升,Bcl-2、CDK1、Cyclin B1、MMP9、TRIP13蛋白的表达均下降,且蛋白水平的上升、下降程度与DSF/Cu的浓度成正比（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。结论:1、通过生物信息学技术筛选出的基因TRIP13可能在恶性黑色素瘤发生发展过程中起到关键作用。2、DSF/Cu能抑制B16F10细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、DSF/Cu可能通过下调TRIP13的表达诱导B16F10细胞发生凋亡、G2/M期阻滞和MMP9表达降低从而抑制其增殖、迁移和侵袭能力。

关键词：生物信息学;黑色素瘤;TRIP13;双硫仑;杨氏模量;增殖;迁移;侵袭

学科专业：基础医学·病理学与病理生理学

中文摘要

Abstract

第一章 前言

第二章 实验材料

2.1 实验对象

2.2 药品

2.3 主要试剂与耗材

2.4 实验仪器

2.5 常用试剂配制

2.5.1 1 ×磷酸盐缓冲液(PBS)的配制

2.5.2 细胞冻存液的配制

2.5.3 0.25 %胰酶的配制

2.5.4 完全培养基的配制

2.5.5 双硫仑、五水硫酸铜母液的配制

2.5.6 Western Blot实验相关试剂的配制

第三章 实验方法

3.1 差异表达基因的鉴定

3.2 GO和 KEGG通路分析

3.3 构建差异表达基因的PPI网络图

3.4 关键基因的筛选和分析

3.5 细胞培养

3.5.1 细胞复苏

3.5.2 细胞换液

3.5.3 细胞传代

3.5.4 细胞冻存

3.5.5 细胞计数

3.6 CCK-8法

3.7 镜下观察对照组和DSF/Cu组 B16F10 细胞形态

3.8 流式细胞术检测B16F10细胞的凋亡情况

3.9 流式细胞术检测B16F10细胞周期分布情况

3.10 Transwell实验检测B16F10 细胞迁移和侵袭能力

3.10.1 迁移实验

3.10.2 侵袭实验

3.11 原子力显微镜检测细胞杨氏模量的变化

3.12 免疫印迹实验检测相关蛋白表达水平

3.12.1 蛋白样品的制备

3.12.2 蛋白定量(BCA法)

3.12.3 蛋白变性

3.12.4 电泳

3.12.5 转膜

3.12.6 封闭

3.12.7 一抗孵育

3.12.8 二抗孵育

3.12.9 显影成像

3.12.10 结果分析

3.13 统计分析

第四章 实验结果

4.1 差异表达基因的鉴定

4.2 差异表达基因的GO和 KEGG通路分析

4.3 构建差异表达基因的PPI网络图

4.4 关键基因的选择与分析

4.5 CCK-8 法检测DSF/Cu对 B16F10 细胞增殖的影响

4.6 DSF/Cu对 B16F10 细胞形态学的影响

4.7 DSF/Cu对 B16F10 细胞凋亡的影响

4.8 DSF/Cu对 B16F10 细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3 表达的影响

4.9 DSF/Cu对 B16F10 细胞周期的影响

4.10 DSF/Cu对 B16F10 细胞CDK1、Cyclin B1 蛋白表达的影响

4.11 DSF/Cu对 B16F10 细胞迁移能力的影响

4.12 DSF/Cu对 B16F10 细胞侵袭能力的影响

4.13 DSF/Cu对 B16F10 细胞胞核区杨氏模量的影响

4.14 DSF/Cu对 B16F10 细胞MMP9 蛋白表达的影响

4.15 DSF/Cu对 B16F10 细胞TRIP13 蛋白表达的影响

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

英文缩略词表

致谢