生物信息学进展研究论文提纲

2022-11-15

论文题目：磷脂酶C样蛋白1在肾透明细胞癌脂质代谢异常中的功能及机制研究

摘要：在泌尿系统中,肾细胞癌（renal cell carcinoma,简称肾癌）是发病率最高的恶性实体瘤之一,约占肾脏全部恶性肿瘤的80%-90%。肾癌具有多种病理亚型,其中,肾透明细胞癌（clear cell Renal Cell Carcinoma,cc RCC）最为普遍,约占肾细胞癌的70%-80%。目前,针对肾透明细胞癌的治疗以手术结合分子靶向药物的综合治疗手段为主。虽然治疗手段的进步在一定程度上改善了患者的预后,但是生存率的巨大波动、靶向药物的耐受使得肾透明细胞癌的治疗仍是临床上所面临的一个重要难题。代谢异常是cc RCC的一种标志性生物学特征,其中又以脂质代谢异常最为显著。既往的研究显示,cc RCC细胞中有着大量的脂滴堆积,并且越来越多的证据显示这类异常堆积的脂质在cc RCC的发生与进展中起着关键的作用。尽管如此,有关cc RCC中脂质代谢的具体调控方式和机制却仍不明确。本研究以cc RCC脂质代谢为出发点,通过综合生物信息学分析,发现并明确了cc RCC的代谢相关性生物标志物磷脂酶C样蛋白1（Phospholipase C-like Protein 1,PLCL1）。与此同时,恢复cc RCC细胞中PLCL1的表达可以显著抑制肿瘤进展并显著减少脂质堆积。进一步的研究表明,在cc RCC细胞中PLCL1通过影响解偶联蛋白1（Uncoupling protein 1,UCP1）的表达,从而影响cc RCC的进展及细胞代谢状态。本研究的主要目的,是为了探索PLCL1在cc RCC中的表达情况及其与cc RCC临床预后的相关性,同时明确PLCL1对cc RCC发生发展,细胞代谢等多方面的生物学过程中的具体作用,并解析PLCL1影响cc RCC进展的具体机制。本研究主要分为以下三个部分:第一部分:PLCL1在肾透明细胞癌中的表达及其与肾癌临床预后的关系目的:探索PLCL1在cc RCC中的差异表达情况,解析PLCL1的表达水平与cc RCC的临床分期分级及患者预后之间的相互关系。方法:1.首先根据公共数据库Oncomine,公共数据库EMBL-EBI（European Bioinformatics Institute）以及公共数据库TCGA（The Cancer Genome Atlas）中肾透明细胞癌的相关数据进行综合生物信息学分析,明确PLCL1在cc RCC中的差异表达情况。2.进一步分析TCGA数据库中的相关临床信息,解析PLCL1的表达水平与cc RCC患者临床特征,疾病分期分级以及患者预后之间的相互关系。3.在cc RCC的临床组织标本和特异性细胞系中利用实时定量PCR,Western blot,免疫组化等分子生物学实验技术验证PLCL1在cc RCC中的差异表达情况。结果:1.基于公共数据库Oncomine和公共数据库EMBL-EBI中cc RCC脂质代谢异常相关差异基因的筛选结果显示,PLCL1是cc RCC中的一个重要的脂质代谢相关的生物标志物。2.基于TCGA数据库的分析显示,与癌旁组织相比PLCL1在cc RCC组织中呈现显著的低表达趋势。与此同时,基于Oncomine数据库中的五个独立cc RCC相关数据亚集（Beroukhim Renal,Lenburg Renal,Gumz Renal,Jones Renal,Yusenko Renal）的生物信息学分析也证实了PLCL1在cc RCC中显著低表达的临床事实。3.基于TCGA数据库临床信息的进一步生物信息学分析显示,在cc RCC中更低的PLCL1表达水平预示着更短的总生存时间OS（Overall Survial）以及更短的无病进展生存时间DFS（Disease Free Survival）,相关的ROC曲线分析显示PLCL1的表达水平对cc RCC具有明显的诊断价值。与此同时,生物信息学分析的结果还显示,PLCL1的表达水平随着cc RCC临床分期分级（TNM分期,G分级）的加重而逐渐降低,并且COX回归的结果显示PLCL1是cc RCC患者预后的一个独立危险因素。4.基于cc RCC临床组织标本和特异性细胞系中的分子生物学检测显示,PLCL1的m RNA水平和蛋白水平在cc RCC中均呈现显著低表达。结论:PLCL1是cc RCC中的一个重要的脂质代谢相关差异表达基因,其在cc RCC中显著低表达,并且与cc RCC的分期分级及临床预后高度相关。cc RCC中PLCL1的表达水平可以作为一种全新的肾癌诊断及预后相关的分子标志物。第二部分:PLCL1对肾透明细胞癌生物学功能影响的体内外研究目的:探究PLCL1的表达水平对肾透明细胞癌生物学功能的影响。方法:1.利用针对PLCL1的过表达慢病毒及特异性沉默的sh RNA,在cc RCC细胞系中分别构建稳定过表达PLCL1及稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系,并通过实时定量PCR及western blot的方式分别评估PLCL1在m RNA水平及蛋白水平的沉默及过表达的效率。2.在已构建的稳定过表达和稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系中开展CCK8增殖实验,克隆形成实验,细胞划痕实验,transwell实验等一系列分子生物学实验,评估PLCL1对cc RCC细胞增殖,生长,迁移,侵袭等多方面肿瘤基本生物学功能方面的影响。3.利用油红染色,甘油三酯含量检测等分子生物学实验手段,检测稳定过表达和稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系中脂质含量的变化,以评估PLCL1对cc RCC脂质代谢的影响。4.选取6周龄的BALB/c雄性裸鼠,以过表达PLCL1的肾透明细胞癌CAKI细胞系及相应的对照细胞为工具细胞,分别通过皮下注射以及尾静脉注射的方式构建裸鼠皮下移植瘤模型及尾静脉转移瘤模型。5.对上述构建的移植瘤裸鼠模型,每四天进行一次检测,评估裸鼠体重及移植瘤的体积变化,并在第44天进行解剖,将相应移植瘤进行称重,并以冰冻及固定的方式进行保存。随后,对上述移植瘤标本进行油红染色,免疫组化等相关分析,以评估在体内水平PLCL1对cc RCC细胞生长,增殖及脂质代谢方面的影响。6.对上述构建的裸鼠尾静脉转移模型,同样以四天为单位进行裸鼠体重评估,并同样在第44天进行解剖。随后,对相关的主要脏器（肝脏、脾脏、肾脏及肺部）进行称重,并评估相关脏器的肿瘤转移情况,同时保存相应组织标本进行免疫组化,H＆E染色等分子生物学检测,以评估在体内水平PLCL1对cc RCC细胞迁移及侵袭能力的影响。结果:1.利用实时定量PCR及western blot检测显示,当cc RCC细胞系转染了针对PLCL1的特异性过表达慢病毒后,与相应的对照细胞系相比,PLCL1的m RNA水平及蛋白水平均得到显著的提高。同时,当cc RCC转染了特异性针对PLCL1的sh RNA后,与相应的对照细胞系相比,PLCL1的m RNA水平及蛋白水平均显著的降低。上述结果说明,实验构建的稳定过表达PLCL1及稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系是成功有效的。2.CCK8细胞增殖实验及克隆形成实验显示,过表达PLCL1可以显著抑制cc RCC细胞的增殖生长能力,与此同时,敲低PLCL1可以显著促进cc RCC细胞的生长速率。此外,transwell实验及细胞伤痕愈合实验的结果显示,在过表达PLCL1的cc RCC细胞系中,cc RCC细胞的迁移侵袭能力显著下降,而沉默PLCL1的表达可以显著促进cc RCC细胞的迁移及侵袭。3.细胞油红染色及甘油三酯含量测定显示,过表达PLCL1可以显著减少cc RCC细胞中的脂质堆积,而沉默PLCL1可以显著促进cc RCC细胞中的脂质堆积。4.对裸鼠皮下移植瘤模型的评估显示,与对照组相比过表达PLCL1后皮下移植瘤的生长速度显著下降,并且相应恶性指标显著降低,同时油红染色的结果显示过表达PLCL1的皮下移植瘤中脂质堆积明显缓解。5.对裸鼠尾静脉转移瘤模型的评估显示,与对照组相比过表达PLCL1后各脏器的肿瘤转移情况明显减少。结论:PLCL1是cc RCC的一个重要的肿瘤抑制因子,过表达PLCL1可以显著抑制cc RCC的进展,并显著减少cc RCC的脂质堆积。第三部分:PLCL1通过上调UCP1影响肾透明细胞癌生物学功能的机制研究目的:探究PLCL1影响肾透明细胞癌发生发展及调控cc RCC脂质代谢的具体分子机制。方法:1.对稳定过表达PLCL1的cc RCC细胞系进行转录组测序分析,解析PLCL1在cc RCC中所涉及的代谢通路及潜在分子机制。2.进一步对转录组测序数据进行综合生物信息学分析,解析PLCL1与脂质棕色化相关通路的关系,并利用western blot技术明确PLCL1对脂质棕色化关键基因（PGC1A,CIDEA,DIO2,UCP1）的调控情况。3.利用免疫荧光,western blot以及实时定量PCR等分子生物学实验技术检测稳定过表达PLCL1和稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系中UCP1的表达,明确PLCL1对UCP1的具体调控方式及调控水平。4.利用生物信息学分析,western blot,实时定量PCR以及免疫组化等实验技术,明确UCP1在cc RCC组织及细胞系中的表达情况。5.利用针对UCP1的特异性过表达质粒和si RNA,构建过表达和敲低UCP1的cc RCC细胞系,并利用CCK8增殖实验,transwell实验,细胞油红染色及甘油三酯含量测定等分子生物学实验手段明确UCP1对cc RCC进展及脂质堆积情况的影响。6.在稳定过表达PLCL1的cc RCC细胞系中利用特异性si RNA敲低UCP1,构建功能回复模型,并利用CCK8增殖实验,transwell实验,细胞油红染色等分子生物学实验手段检测上述模型中cc RCC进展及脂质堆积情况的改变,从而明确UCP1在PLCL1调控cc RCC进展及代谢过程中的重要性。7.利用放线菌酮（CHX）在稳定过表达和稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系中构建蛋白半衰期实验模型,利用western blot技术检测上述模型中UCP1的表达情况,评估PLCL1对UCP1蛋白稳定性的影响。8.在稳定沉默PLCL1的cc RCC细胞系中添加MG132和氯喹,并进行泛素化相关免疫共沉淀,明确PLCL1调控UCP1的具体分子生物学机制。9.利用稳定过表达PLCL1的cc RCC细胞系及相应对照细胞系在BALB/c雄性裸鼠体内构建裸鼠皮下移植瘤模型,利用免疫组化技术检测皮下移植瘤中UCP1的表达情况,以验证PLCL1在体内水平对UCP1的调节。结果:1.基于PLCL1过表达的转录组测序结果显示PLCL1在cc RCC中高度影响脂肪酸代谢及胆固醇代谢通路。2.对转录组测序数据的进一步分析显示,PLCL1在cc RCC中不直接影响脂质棕色化关键基因的m RNA表达,并且western blot的结果显示在脂质棕色化的关键基因中,PLCL1有且直接调节UCP1的表达。3.基于UCP1的检测结果显示,在cc RCC中过表达PLCL1可以显著升高UCP1的表达,同时沉默PLCL1可以显著下调UCP1的表达,并且这种调控仅限于UCP1的蛋白水平,不影响UCP1的m RNA水平。4.生物信息学分析和相关实验检测的结果显示,UCP1在cc RCC组织及细胞系中同样呈现显著低表达,并且在cc RCC中过表达UCP1后可以显著抑制cc RCC的增殖,迁移,侵袭及脂质堆积,同时在cc RCC中沉默UCP1后也可以显著促进cc RCC的增殖,迁移,侵袭及脂质堆积。5.基于功能回复模型的检测结果显示,UCP1在cc RCC中可以显著逆转由过表达PLCL1引起的肿瘤增殖,迁移,侵袭及脂质堆积能力的抑制。6.基于放线菌酮（CHX）的蛋白半衰期实验提示,在cc RCC中PLCL1可以显著提高UCP1的蛋白稳定性,并且泛素化免疫共沉淀的结果显示过表达PLCL1可以显著降低UCP1的泛素化水平,同时沉默PLCL1可以显著提高UCP1的泛素化水平。7.对裸鼠皮下移植瘤模型的评估显示,与对照组相比过表达PLCL1后皮下移植瘤中UCP1的表达水平显著提高。结论:PLCL1影响cc RCC的发生发展与脂质堆积是通过上调UCP1的表达实现。其在机制上是通过直接影响UCP1的泛素化水平,进而影响UCP1的蛋白稳定性,从而调控其表达情况。

关键词：肾透明细胞癌;PLCL1;临床预后;分子标志物;肿瘤进展;脂质代谢;脂质棕色化;UCP1;蛋白稳定性

学科专业：外科学（泌尿外科）

中文摘要

Abstract

缩略词表

引言

第一部分:PLCL1在肾透明细胞癌中的表达及其与肾癌临床预后的关系

材料与方法

实验结果

讨论

附图表

第二部分:PLCL1对肾透明细胞癌生物学功能影响的体内外研究