生物信息学研究论文提纲

2022-11-15

论文题目：基于生物信息学研究TSPAN31在肿瘤中的作用及其在宫颈癌中对Akt通路的影响

摘要：背景:Tetraspanin（TSPANs）家族蛋白与大多肿瘤的增殖、侵袭和转移等能力相关,比如TSPAN7可作为肝癌的潜在标记。TSPAN31作为TSPANs家族的成员,发现时间较晚,研究相对较少,许多功能尚未明确。我们希望借助生物信息学的方法对其进行研究,进一步的指导细胞水平的实验。本实验室前期研究发现TSPAN31与CDK4基因为3’末端反向互补序列,并且在肝癌细胞实验中发现TSPAN31对肿瘤的侵袭起促进作用,对CDK4为负调控作用;近年来报道显示,脂肪瘤及脂肪肉瘤中TSPAN31与CDK4的表达水平表现为双增高;为了探索该现象是否存在于其它类别的肿瘤,我们使用生物信息学方法筛选出表达一致的肿瘤类别,并选择宫颈癌细胞进一步研究其分子机制。目的:TSPAN31作为Tetraspanin蛋白超家族的成员,其发现时间较晚,研究相对较少,许多功能尚未明确。TSPAN31与CDK4基因作为3’末端为反向互补序列,为一对天然反义转录物（natural antisense transcripts,NATs）。NATs是在生物体自然细胞内产生的内源性互补RNA,其有多种互补形式,形成正义—反义转录物配对的双链RNA,对细胞分化、肿瘤发生和能量代谢等各种生理和病理过程都有重要的调控作用。使用生物信息学的技术对TSPAN31在不同类型肿瘤中的表达水平进行分析,并研究其表达在不同类型肿瘤中对患者预后生存率的影响。根据生物信息学结果,我们选择在宫颈癌中研究TSPAN31对该肿瘤细胞的生长与侵袭性的影响。方法:通过生物信息学技术,利用TCGA、GTEx及其相关数据库分析TSPAN31在正常人体各组织器官中的表达量,在肿瘤组织与正常组织之间的表达差异,以及其对多种肿瘤预后的生存影响。为了探讨宫颈癌细胞中TSPAN31与CDK4两者的关系,我们分别对宫颈癌细胞进行了TSPAN31过表达及沉默处理,转染质粒48h后用Western Blot检测CDK4的含量,发现两者的表达为负相关调控。为了明确在宫颈癌中两者表达的调控是否由两者互补区间调控,设计了下面的实验:通过NCBI网站对TSPAN31基因进行检索确定其基因序列与其互补的CDK4的基因序列,我们合成了3种TSPAN31的质粒,分别为全长度的TSPAN31质粒（Tetraspanin31-full length）,只表达TSPAN31的3’末端的质粒（Tetraspanin31-3’UTR）以及不包含与CDK4基因互补的3’区的质粒（Tetraspanin31-CDS）。将三种不同的过表达质粒分别导入宫颈癌细胞中,用Western Blot检测CDK4的含量。细胞中CDK4含量的改变往往与细胞的增殖相关,为了探究在宫颈癌细胞中TSPAN31对细胞增殖的影响,对宫颈癌细胞进行了TSPAN31过表达及敲低处理,使用细胞克隆形成实验是用来检测处理细胞的增殖能力,计算克隆形成率,克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。评测TSPAN31对宫颈癌细胞增殖的影响。在许多四跨膜蛋白的研究中都表明四跨膜蛋白通过激活AKT通路影响肿瘤的转移,如TSPAN1、CD81和CD9等。为了验证TSPAN31在宫颈癌中是否激活AKT通路,我们设计了如下的实验:在宫颈癌细胞中过表达TSPAN31基因,48h后使用Western Blot检测TSPAN31基因表达产物及AKT、p-AKT、GSK3β和β-catenin的表达。结果:通过TCGA、GTEx及其相关数据库中肿瘤组织与其相对应的正常人体组织对比发现,弥漫性大b细胞淋巴瘤（DLBC）、多形成性胶质细胞瘤（GBM）、脑低级别胶质瘤（LGG）、胰腺癌（PAAD）及胸腺瘤（THYM）中TSPAN31表达相对于正常组织中显著升高（p＜0.05）,而在子宫颈癌（CESC）、子宫内膜癌（UCEC）及子宫肉瘤（UCS）中则比正常组织表达明显下降（p＜0.05）。随后我们将TCGA数据库中的肿瘤样本数据用R语言进行预后生存分析,结果显示在BRCA（乳腺癌）、HNSC（头颈部鳞状细胞癌）、LGG（脑低级脑胶质细胞瘤）中低表达TSPAN31可以提高患者的生存率,而在KIRC（肾透明细胞癌）与之相反,高表达TSPAN31可以提高患者的生存率（p＜0.05）。TSPAN31与CDK4为一对反式NATs,其在宫颈癌中,过表达TSPAN31会导致CDK4的表达量显著下降。为了探究CDK4基因表达的抑制是否由两者为互补部分所导致,我们设计了以下实验:合成TSPAN31全长质粒（Tetraspanin31-full length）,TSPAN31 3’末端UTR质粒（Tetraspanin31-3’UTR）以及不含与CDK4基因互补的3’-UTR质粒（Tetraspanin31-CDS）。WB结果显示Tetraspanin31-3’UTR与Tetraspanin31-full length两组中CDK4表达明显下降,而Tetraspanin31-CDS组中的CDK4水平与对照组无显著差异。为了验证TSPAN31对AKT通路的作用,在宫颈癌细胞中转染TSPAN31-full质粒48h后,使用WB检测Hela细胞中的AKT、GSK3β、p-AKT、p-GSK3β及-catenin的含量,结果显示在实验组及对照组中AKT及GSK3β的蛋白量改变无统计学意义,但p-AKT、p-GSK3β及β-catenin的含量显著上升（p＜0.05）,表明TSPAN31可能通过未知途径促使AKT蛋白的磷酸化进而向下传达激活GSK3β,引起β-catenin的累积。结论:使用生物信息学分析显示在DLBC、GBM、LGG、PAAD及THYM中TSPAN31表达相对于正常组织升高,在CESC、UCEC及UCS这些肿瘤中TSPAN31表达相对于正常组织下降（p＜0.05）。预后分析显示高表达TSPAN31可以提高KIRC的生存率,而在BRCA、HNSC、LGG中低表达TSPAN31可以提高患者的生存率（p＜0.05）。在宫颈癌中TSPAN31与CDK4互为NATs,其通过3’互补区作用下调CDK4的表达。过表达TSPAN31可促进AKT和GSK3β的磷酸化导致β-catenin上升,从而激活AKT通路。

关键词：Tetraspanin31;3’UTR;CDK4;天然反义转录物;TCGA;宫颈癌细胞;AKT;GSK3β;β-catenin

学科专业：生物化学与分子生物学

中英文缩略词表

中文摘要

Abstract

前言

第一部分:基于生物信息学方法研究TSPAN31在肿瘤中的作用

1 引言

1.1 生物信息学

1.2 癌症基因组图谱(TCGA)

1.3 GTEx数据库

1.4 TSPAN31