粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究

粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究（共3篇）

篇1：粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究

粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究

研究了不同酶反应缓冲体系、pH值、氯离子浓度以及f唑哒嗪对5龄2日粘虫Pseudaletia separata Walker中肠α-淀粉酶活性的影响.结果表明,乙酸-乙酸钠缓冲体系(pH 5.8)和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系(pH 8.0)有利于增强α-淀粉酶活性,比活力最高分别达到4.49和4.97.在乙酸-乙酸钠缓冲体系(pH 5.8)中,5、10、20、40和80mmol/L氯离子浓度引起α-淀粉酶活性呈现先减弱后增强的变化规律,而在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系(pH8.0)中仅呈现减弱的.趋势.1.4 mmol/Lf唑哒嗪对α-淀粉酶活性的抑制率可达70%,但抑制程度随着反应体系中蛋白含量的增加而逐渐降低.

作 者：黄青春 卓军 曹松 钱旭红 HUANG Qing-Chun ZHUO Jun CAO Song QIAN Xu-Hong  作者单位：华东理工大学药学院药物化工研究所,上海,37 刊 名：昆虫学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA ENTOMOLOGICA SINICA 年，卷(期)： 49(2) 分类号：Q965 关键词：粘虫   α-淀粉酶   酶活性   pH值   氯离子   f唑哒嗪  

篇2：粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究

测定α-淀粉酶活性的方法有分光光度法、凝胶扩散法、3, 5-二硝基水杨酸法、粘度计法和降落值法等[4]。目前, 3, 5-二硝基水杨酸法是最常用的方法。在许多试验手册中提供了常规用量的一般方法和步骤, 然而试剂用量较大, 且操作不够简便, 不便将其应用于穗发芽抗性选择[5,6]。该研究通过对比分析常量和微量2种方法获得的试验结果, 旨在提供一种能够替代常量测定的经济有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料的准备

从Frontana (抗穗发芽品种) /Inia66 (感穗发芽品种) 的重组自交家系群体 (F8) 中选取发芽指数分别为高、中、低的3个小麦品系, 群体号分别是1、2、48。在田间随机排列种植, 3次重复。收获后, 按照籽粒的萌发试验要求对其进行发芽试验, 3 d后备用。

1.1.2 试剂

(1) α-淀粉酶提取缓冲液 (pH 5.5) :20 mmol·L-1 NaAc (2.721 6 g·L-1) , 1 mmol·L-1 CaCl2 (0.110 99 g·L-1) , 加入HAc调节pH; (2) 柠檬酸缓冲液 (pH5.60) :由A液和B液组成。A液:柠檬酸20.01 g, 溶解定容至1 L, B液:柠檬酸钠29.41 g, 溶解定容至1 L, 再将A液13.70 mL与B液26.30 mL混匀备用; (3) 0.4 mol·L-1氢氧化钠溶液:称取16.00 g氢氧化钠, 加蒸馏水定容至1 L; (4) 1%淀粉溶液:称取1.00 g淀粉, 加少量蒸馏水搅拌成悬浊液, 用滴管吸取向沸水中边加边搅拌; (5) 1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液:称取4.00 g氢氧化钠, 加蒸馏水定容至100 mL; (6) 3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) : 1.00 g 3, 5-二硝基水杨酸溶于20 mL 1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液中, 加入50 mL预热的蒸馏水, 再加入30.00 g酒石酸钾钠, 溶解定容至100 mL, 盖紧瓶塞, 防止CO2进入; (7) 标准麦芽糖溶液 (1 mg·L-1) :称取0.10 g麦芽糖, 溶解定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 提取酶液

取萌发3 d的种子, 用滤纸吸去表面的水分, 称取1 g, 加1 mL提取缓冲液, 少量石英砂, 研磨至匀浆, 4 000 r·min-1离心10 min。取上清液, 定容至25 mL。

1.2.2 酶促反应

每一个样品取4支试管, 一个做对照, 其它用于测定样品 (3个平行样) ;每管加入酶液1 mL, 70±0.5℃水浴准确加热15 min, 钝化β-淀粉酶, 取出后迅速用流水冷却;向各管中加入柠檬酸缓冲液 (pH5.60) , 然后再向对照管中加入0.4 mol·L-1氢氧化钠溶液, 以终止其中的酶促反应, 各管均是40℃水浴15 min;分别向各试管中加入40±0.5℃下预热的1%淀粉溶液, 摇匀, 立即放回水浴中, 准确保温5 min;向各测定管中迅速加入0.4 mol·L-1氢氧化钠溶液, 以终止酶促反应。每一步加入试剂的用量见表1。

1.2.3 显色反应

待测样:取上述酶促反应液于刻度试管中, 加入3, 5-二硝基水杨酸, 沸水浴5 min。取出冷却, 蒸馏水稀释。利用紫外分光光度计测定520 nm下的吸光度。其中, 常量试验中, 酶促反应液和DNS各2.0 mL, 稀释至25 mL;微量试验中, 2种试液分别加入0.48 mL, 稀释至6 mL;标准液:取7支试管, 分别加入麦芽糖标准液 (1 mg·L-1) 。再向各管中加水定容。然后加入3, 5-二硝基水杨酸, 沸水浴5 min。取出冷却, 蒸馏水稀释。利用分光光度计测定520 nm下的吸光度 (见表2) 。

1.2.4 求算样品中麦芽糖含量

以标准样中麦芽糖含量为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制标准曲线, 得到回归方程。将待测样的吸光度代入方程, 求得待测样的麦芽糖含量, 折算成1 g鲜种子中麦芽糖的含量及酶活力。

α-淀粉酶活力=浓度×体积×稀释倍数/样品鲜重×时间

其中, 浓度单位为mg·mL-1, 体积单位为mL, 样品鲜重单位为g, 酶活力单位为mg·g-1·min-1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线在常量和微量方法中的对比

标准曲线试验方法规定, r2相关系数达到0.99的回归方程才可用。从表3可以看出, 采用常量和微量试验方法建立的标准曲线, 其相关系数均在0.99以上。说明采用微量法获得的标准曲线是可以利用的。

2.2 采用常量法和微量法测量待测样品结果对比

常量标准曲线回归方程:

y =0.620x-0.015 (r2相关系数0.998)

微量标准曲线回归方程:

y =0.608x-0.023 (r2相关系数0.997)

以每一个品种田间种植的3次重复为样品, 对其进行淀粉酶活性测定。将每个样品的3个平行样的试验结果列于表4和表5。

结果表明, 除个别情况, 无论常量还是微量试验, 重复性都比较好;通过除去3个数据中一个相对差距大的数据, 保留两个接近数据进行平均, 能够获得更加准确的测量值。常量法和微量法获得的淀粉酶活性值的相关系数达到0.776**。值得注意的是, 同一品种因生长环境不同, α-淀粉酶活力不同, 说明种植3次重复是非常必要的。

将2种测定方法得到的每个品种的3次重复取平均值, 相关系数为0.994**。印证了用微量方法代替常量方法进行α-淀粉酶活力测定的可行性。

3 讨论

从结果可知, 微量试验和常量试验的重复性都比较好。虽然2种试验方法获得的结果不能完全吻合, 但是两者之间具有相同的变化趋势。将微量法用于抗穗发芽品种的筛选时, 具有经济有效、操作简便的特点, 并且提高了工作效率。因为该试验的步骤较多, 反应温度、反应时间要求严格, 微量试验中试剂用量少, 受环境影响大, 操作熟练是保证试验结果可靠性的关键。目前, 尚未见到用微量法测定α-淀粉酶活力的报道。

在测定籽粒中α-淀粉酶活性的试验中, 有人用干种子研磨成粉。肖世和等[7]指出, 浸润前后及由浸润导致的α-淀粉酶活性增量, 品种间存在极显著差异。α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽, 反之则易穗发芽。浸润使某些不抗穗发芽的品种的α-淀粉酶活性有较大增加, 而发芽率较低的品种增加较小。未浸润子粒的α-淀粉酶活性与发芽率相关不显著。该研究将种子先进行发芽, 3 d后用于试验。增强了抗、感穗发芽品种的区分度。

摘要：α-淀粉酶活性是与小麦穗发芽有关的重要生理指标。对测定α-淀粉酶活性的3, 5-二硝基水杨酸法进行了常量法和微量法试验。通过对比研究, 提出了改进的微量测定方法, 并对其利用进行了讨论。

关键词：小麦,穗发芽,α-淀粉酶活性,3, 5-二硝基水杨酸法

参考文献

[1]张海峰, 卢荣禾.小麦穗发芽抗性机理与遗传研究[J].作物学报, 1993, 19 (3) :523-530.

[2]吴颖, 胡汉桥, 王罡, 等.春小麦α-淀粉酶活性及其与穗发芽抗性的关系[J].吉林农业大学学报, 2002, 24 (4) :22-25.

[3]王凤宝, 董立峰, 付金锋.小麦抗穗发芽酶反应生化标记选择法[J].农业生物技术学报, 2007, 15 (3) :482-488.

[4]刘小丽, 宋保军, 侯睿林.测定α-淀粉酶活性的2种方法的比较研究[J].农业科技与信息, 2006 (9) :36-38.

[5]刘泽军.淀粉酶测定进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册, 1992, 13 (1) :15-16.

[6]潘仁瑞.在同一份植物样品中测定α-和β-淀粉酶活力方法的改进[J].生物学杂志, 1987 (2) :20-23.

篇3：粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究

该文通过采用氧自由基清除能力（oxygen radicalabsorbance capacity，ORAC）评价法、DDPH自由基清除法、抗亚油酸氧化法、还原能力法四种不同的抗氧化活性评价方法，旨在测定类黄酮在加入PPA溶液前后，类黄酮抗氧化能力的变化情况。

材料与仪器

PPA购自于Sigma公司；类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度达98%；荧光素钠，维生素E水溶性类似物Trolox，2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2，2’-Azobis（2-methylp ropionamidine）dihyd rochIo ride，AAPH），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DDPH），亚油酸均購自于Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯，所有溶液均用等离子水配制，并用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline，PBS）以保持pH6.8±0.02的生理条件。

全波长扫描式多功能酶标仪，紫外可见分光光度计数显，恒温水浴锅，pH值精度计，超声细胞粉碎器，数控超声波清洗器

试验方法

PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的影响。称取1mg类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）溶于2mL二甲基亚砜，得到0.5mg/mL的类黄酮储备液。取10μL类黄酮储备液与9901JLPPA液（溶于pH7.4的PBS缓冲液，0.328U/mL）、990mLpH7.4的PBS缓冲液，混匀于37℃反应30min，分别得到1mL两组样液并加以标记为样液1和样液2。同时，将类黄酮储备液换成等体积的二甲基亚砜作同样处理，作为对照以排除二甲基亚砜对整个试验结果的影响。

在96微孔平板中依次加入20μL上述两种样液、对照液和五种不同浓度的Trolox标准溶液，板的边缘孔均加入等体积的pH7.4的PBS缓冲液；然后每孔加入200pL的已配置好的荧光素钠盐溶液（现配现用），再运用Wallace1420Manager软件设定测定程序，自动混匀，在37℃条件下预热20min；待96孔平板出机后，迅速加入20μLAAPH（现配现用），自动混匀，仪器开始自动测定。在激发波长485nm，吸收波长535nm条件下，每隔2min记录一次荧光强度值，每次纪录前自动震荡混匀8s，共测定60个循环，荧光强度分别记录为f1，f2，f3，……，f60；利用相应软件计算AUC值，再计算ORAC值。则PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的抑制率算术公式如下：

PPA对类黄酮清除DDPH自由基的影响。准确称取20mgDDPH粉末，用无水乙醇溶解并定容至250mL，得到摩尔浓度为2×10^-4mol儿的DDPH乙醇混合液，现配现用。

将类黄酮（木犀草素、香叶木素、柚皮素、二氢杨梅素、山奈酚、槲皮素）溶于无水乙醇，得到20，40，60，80，100μg/mL不同浓度的类黄酮溶液。取50HL上述不同浓度的类黄酮溶液与0.2mLPPA液（溶于pH6.8的PBS缓冲液，0.328U/mL）混合并于37℃水浴30min，再加入3mL的2×10^-4mol/L的DDPH乙醇混合液，混匀后，在黑暗处室温条件下静置30min。用无水乙醇作为参比液，在517nm处测定样品的吸光值。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的无水乙醇，平行测定三次。则通过拟合曲线可得类黄酮加入PPA溶解液前后的半抑制浓度UC50值，以及PPA对黄酮抗亚油酸氧化的抑制率的算术公式如下：

PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的影响。称取亚油酸0.6g，吐温-20 0.5g溶于150mL pH 6.8 0.2mol儿的PBS缓冲液中，在超声细胞粉碎器下工作20min，得到均一体系的混合液。

将0.2mL0.1mg/mL的黄酮液（溶于二甲基亚砜），不同酶活力的PPA液先混合37℃水浴30min，再加入上述混合液2.5mL，5mL20mMAAPH反应液混合均匀于反应器中恒温水浴70min。

取出上述反应液0.1mL于具塞试管中，加入4.7mL乙醇（75%），0.1mL硫氰酸铵（30%）和0.1mLFeCl₂（20mM，溶于3.5%HCl中）混匀，在500nm处测得吸光度值A500（以75%乙醇作参比液）。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的二甲基亚砜液，平行测定三次。则PPA对黄酮抗亚油酸氧化的抑制率的算术公式如下：

PPA对类黄酮还原能力的影响。将0.05mg/mL100μL黄酮液（溶于二甲基亚砜）与不同酶活力的PPA液混合于37℃恒温水浴锅内水浴30min，依次加入2.5mL0.2mol/L的PBS缓冲液和2.5mL已配置好质量分数为1%的K₃Fe（CN）₆，再置于50℃水浴锅内保温20min后，快速冷却，加入2.5mL质量分数10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的转速离心10min，取离心后的上清液2.5mL，依次加入4mL蒸馏水，1mL质量分数0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度A700（以蒸馏水为参比液）。对照组为将PPA液换成等量的PBS缓冲液；空白组为将黄酮液换成等量的二甲基亚砜液，平行测定三次。则PPA对黄酮还原力的抑制率I的算术公式如下：

nlc202309090710

结果与分析

PPA对类黄酮ORAC体系抗氧化能力的影响。ORAC评价方法是依据氧自由基（AAPH）破坏荧光探针，促使荧光强度发生一定程度的变化，同时以维生素E水溶性类似物Trolox作为定量标准，采用多功能荧光微孔板扫描分析仪加以检测分析。荧光强度的比那话大小反映了自由基破坏的程度。当抗氧化剂存在时，抗氧化剂可以抑制自由基破坏荧光探针，延缓其荧光强度的衰减速度，通过分析计算得出的ORAC值反映了抗氧化剂对自由基的抗氧化能力。

从图1中可以看出，PPA对类黄酮ORAC抗氧化体系的抑制作用不太明显，其中对木犀草素的抑制作用最大，其抑制率也只有19.88%，对槲皮素的抑制作用最小，其抑制率仅为3.56%。PPA对六种类黄酮ORAC抗氧化体系的抑制作用大小顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。这种结果可能表明PPA与类黄酮相互作用的结合位点不在类黄酮清除自由基能力的活性部位（酚羟基），也間接说明了氢键对PPA和类黄酮发生相互结合作用的贡献不大，但与两者间的结合强度存在一定的联系。

PPA对类黄酮清除DDPH自由基的影响。DDPH自由基溶于乙醇溶液后，在可见光范围内517nm处有强吸收，呈深紫色，当加入自由基清除剂（抗氧化剂）后，其与DDPH自由基中的单电子配对从而使DDPH自由基在517nm处的强吸收逐渐消失，吸光值与DDPH自由基接受的电子数量呈一定的定量关系。

如表1所示，PPA对六种类黄酮清除DDPH自由基的能力均具有一定程度的抑制作用，但抑制作用程度不大。其中PPA对木犀草素清除DDPH自由基能力的抑制作用最大，也仅为18.91%。同时，测定类黄酮与PPA反应前后清除DDPH自由基活性的半数抑制浓度（IC50），结果显示类黄酮与PPA反应后的IC50值明显增加。PPA对类黄酮清除DDPH自由基活力的抑制作用强弱顺序为：木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。此外，通过测定类黄酮清除DDPH自由基在加入PPA前后的半抑制浓度IC50值，其结果反映了这六种类黄酮清除DDPH自由基的能力强弱，同时也表现了PPA较小程度地削弱了类黄酮清除DDPH自由基的能力。

PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的影响。图2所示PPA对类黄酮抗亚油酸氧化能力的影响，随着PPA浓度的增大，其对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用就随之增强。PPA（0.082U）对木犀草素抗亚油酸氧化的抑制作用最强，达到44.21%；PPA对槲皮素抗亚油酸氧化活性的抑制作用最弱，仅为17.56%。PPA对六种类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用强度大小顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。这种结果表明，PPA与类黄酮发生相互结合作用后，在亚油酸乳化体系中，PPA的长分子链可能更紧密地包裹和缠绕类黄酮的活性基团，促使PPA与类黄酮的结合位点及强度发生变化，从而导致PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用增强，具体作用机理有待进一步研究。这也说明PPA与类黄酮相互作用的强弱程度，不仅与两者的化学构造有关，亦与两者混合后所形成的复合物所处的微环境息息相关。

PPA对类黄酮还原能力的影响。抗氧化剂（类黄酮）给出自身电子而具有还原作用，还原能力越强，抗氧化活性越强。试验中的抗氧化剂可使铁氰化钾中的三价铁还原成二价铁，而还原生成的二价铁（亚铁氰化钾）通过与三氯化铁发生进一步反应生成普鲁士蓝，其在700nm处有一强吸收，其吸光值越大，还原能力就越强。

由图3可知，随着PPA浓度的增加，其对类黄酮还原能力的抑制作用也随之增强，但增加幅度不大。PPA（0.082U）对木犀草素还原能力的抑制作用最大，为17.04%；PPA对槲皮素还原能力的抑制作用最小，仅为6.75%。PPA对六种类黄酮还原能力的抑制作用强度大小顺序为木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。

结论

采用ORAC抗氧化体系评价法、DDPH自由基清除法、抗亚油酸氧化法、还原能力法这四种不同的抗氧化活性评价方法，评价了六种类黄酮在与PPA反应前后其抗氧化活性的变化情况。PPA对类黄酮ORAC抗氧化体系、清除DDPH自由基以及还原能力的抑制作用均不明显，最大抑制率分别为19.88%、18.91%、17.04%但在脂质体系内，PPA对类黄酮抗亚油酸氧化的抑制作用程度较大，最大抑制率为44.21%。对于上述四种抗氧化活性评价方法，PPA对这六种类黄酮抗氧化活性的抑制作用强弱顺序均为：木犀草素>香叶木素>柚皮素>二氢杨梅素>山奈酚>槲皮素。