青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定

青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定（精选6篇）

篇1：青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定

杉木心材精油抑菌活性及其化学成分研究

通过水蒸气蒸馏法提取杉木心材精油,并进行柱层析分离、气-质联用分析和抑菌活性试验,比较分析了精油含量、化学组成和抑菌活性成分.结果表明,杉木心材精油含量为1.794～2.076(w/w);气-质联用分析共分离出47个色谱峰,鉴定出27个化合物(占精油总量的.99%),其中主要成分为柏木脑(76.27%);杉木心材精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌等均有较明显的抑制作用;柏木脑是杉木精油的主要抑菌活性成分.

作 者：叶舟 林文雄 陈伟 俞新妥 YE Zhou LIN Wenxiong CHEN Wei YU Xintuo 作者单位：福建农林大学生命科学学院,福州,350002刊 名：应用生态学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY年，卷(期)：200516(12)分类号：Q599 S78关键词：杉木 精油 抑菌活性 柏木脑

篇2：青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

使用新鲜山茱萸果实（经省药品检验所鉴定确认），留取果肉，干燥备用。由专业微生物实验提供的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、桔青霉、啤酒酵母、蜡状芽孢杆菌、假丝酵母[3]。无菌试管，微生物培养基，恒温加热磁力搅拌器，自动电热压力蒸汽灭菌器，旋转蒸发仪，恒温培养箱，分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 活性成分提取

取8份山茱萸样品各10g，分别使用50mL的石油醚、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、70%乙醇、50g/L氢氧化钠、蒸馏水进行提取。

1.2.2 抑菌活性检验

在无菌试管内接种供试菌种，在37℃的温度下进行24h培养，培养结束后取0.2mL菌悬液放置在培养基上，使用无菌滤纸片分别在8种山茱萸提取物中浸湿，挥发干溶剂后分别平铺在含菌培养皿上，培养一段时间后对抑菌圈直径进行测量[4]。

1.2.3 抑菌活性成分分离

将山茱萸大孔吸附树脂的水洗部分使用甲醇溶液进行溶解，并在硅胶板进行点样分离，展开剂为环已烷∶氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸=10∶4∶30∶1.3，室温下展开，将溶剂挥发后待检。

1.2.4 活性成分检测

使用化学定性方法对活性成分进行检测[5]，主要方法为盐酸+镁粉，溴甲酚绿溶液，三氯化铁—铁氰化钾溶液。

2 结果

2.1 山茱萸抑菌活性成分提取

经比较分析发现，经70%乙醇提取的山茱萸提取物对各种菌种具有良好的抗菌活性（表1）。

2.2 抑菌活性成分分离

经薄层层析分离，得到三个组分，其中组分Ⅰ对金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌没有抑菌活性，组分Ⅱ和组分Ⅲ对金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌均有良好抑菌活性。

2.3 活性成分检测

组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ和盐酸+镁粉进行化学定性检测，组分Ⅰ和盐酸+镁粉呈现阳性反应，说明组分Ⅰ是黄酮类化合物；组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ和溴甲酚绿溶液进行化学定性检测，组分Ⅱ、组分Ⅲ和盐酸+镁粉呈现阳性反应，说明组分Ⅱ、组分Ⅲ是羧酸类化合物；组分Ⅱ、组分Ⅲ和三氯化铁—铁氰化钾溶液呈现阳性反应，说明组分Ⅱ、组分Ⅲ是酚酸类化合物（表2）。

3 讨论

现代中药化学研究发现，山茱萸中含有山茱萸苷、没食子酸、酒石酸、树酯、苹果酸、鞣质等多种有效成份。现代中药药理学研究也发现，山茱萸提取液对于常见的食品微生物具有显著的抗菌效果。抗菌效果的确定可以为山茱萸临床的综合使用以及天然食品防腐剂的临床研究具有十分重要的意义。我们相信，随着中药化学成分研究的不断进步，山茱萸—这种传统中药材一定可以在更多领域发挥更加重要、积极的作用。综上所述，经比较分析发现，经70%乙醇提取的山茱萸提取物对各种菌种具有良好的抗菌活性，经分离、化学定性检测，初步确定山茱萸的抑菌活性成分是酚酸类化合物。

摘要：目的 探讨山茱萸抑菌活性成分提取分离与检测方法。方法 使用生物活性追踪方法对中药山茱萸的抑菌活性成分进行提取、分离, 并使用化学定性方法对活性成分进行检测。结果 经薄层层析分离, 得到三个组分, 其中组分Ⅰ对金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌没有抑菌活性, 组分Ⅱ和Ⅲ对金黄色葡萄球菌和苏云金芽孢杆菌均有良好抑菌活性。组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ和盐酸+镁粉进行化学定性检测, 组分Ⅰ和盐酸+镁粉呈现阳性反应, 说明组分Ⅰ是黄酮类化合物;组分Ⅰ、组分Ⅱ、组分Ⅲ和溴甲酚绿溶液进行化学定性检测, 组分Ⅱ、组分Ⅲ和盐酸+镁粉呈现阳性反应, 说明组分Ⅱ、组分Ⅲ是羧酸类化合物;组分Ⅱ、组分Ⅲ和三氯化铁-铁氰化钾溶液呈现阳性反应, 说明组分Ⅱ、组分Ⅲ是酚酸类化合物。结论 经比较分析发现, 经70%乙醇提取的山茱萸提取物对各种菌种具有良好的抗菌活性, 经分离、化学定性检测, 初步确定山茱萸的抑菌活性成分是酚酸类化合物。

关键词：山茱萸,抑菌活性成分,提取,分离,检测方法

参考文献

[1]赵淑艳, 呼世斌, 吴焕利, 等.山茱萸抑菌活性成分提取分离与检测[J].西北农林科技大学学报, 2007, 35 (6) :223-231.

[2]王继光, 李君.RP—HPLC法测定不同时期山茱萸中马钱苷的含量[J].河南科技, 2010 (5) :71-72.

[3]高大威, 范玉生, 刘志伟, 等.山茱萸活性成分的鉴定及降糖效果的研究[J].黑龙江畜牧兽医, 2008 (12) :92-94.

[4]吕晓东, 张永祥, 赵毅民, 等.山茱萸体液免疫抑制活性成分的药理学导向评价分离[J].解放军药学学报, 2002, 18 (6) :357-359.

篇3：植物内生木霉的鉴定及其抑菌活性

关键词：内生木霉菌；分类鉴定；形态特征；生长速率；病原菌；抑菌活性；生防菌

中图分类号： S432.4+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0332-02

收稿日期：2014-04-11

基金项目：江苏省徐州师范大学校基金（编号：10XLA20）。

作者简介：孙勇（1977—），男，江西高安人，硕士，讲师，从事应用微生物学研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蒋继宏，教授。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在生防载体菌而加以利用[1]。木霉属（Trichoderma）属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目黏孢菌类[2]，分布比较广泛，是典型的土壤和木材腐生真菌。木霉菌是有效的生物农药资源，适应性广，生存能力强，对植物病原菌拮抗作用广谱，在防病的同时还能产生多种酶分解土壤中的植物残体、降解大分子化合物以便吸收利用，能与土壤中其他益菌协调生长、不污染环境等[3-5]。笔者在分离植物内生菌的过程中获得了几株植物内生木霉菌，鉴于木霉菌的生防特性，对分离到的内生木霉菌进行了分类鉴定和抗植物病原菌活性分析，为植物内生木霉菌的利用提供依据。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1材料来源6株木霉供试真菌（DBs0-13、DBs57、DBs66、40、171、292）分离自健康植物组织中，为徐州师范大学药用植物重点实验室保藏菌种。

1.1.2抑菌试验用的病原真菌小麦赤霉病菌（Fusarium gramineaum Schwabe）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana f.sp. piricola）、油菜菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]、可可球二孢菌（B. theobromae Pat.），均为徐州师范大学药用植物重点实验室保藏菌种。

1.1.3培养基马铃薯葡萄糖固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH值自然；马铃薯葡萄糖液体培养基（发酵用的培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1木霉菌的活化将冷藏菌种取出，在无菌条件下用接种环挑取供试菌的少量菌丝（或0.5 cm×0.5 cm的菌落）至含PDA培养基的平板中，于28 ℃培养箱中培养3 d。

1.2.2木霉菌株生长速度的测定将活化过的木霉菌落用打孔器打孔，获得的菌饼接于新培养基中，于28 ℃培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测定菌落直径，计算出生长速度，同时观察菌落颜色、形状等。

1.2.3载玻片的培养将灭过菌的PDA培养基于微波炉中融化，待培养基温度降到40～45 ℃时于超净工作台中倒平皿，要倒得尽量薄（0.1～0.2 cm厚），待冷却。在上述培养皿中挑取大约0.5 cm×0.5 cm的培养基于灭过菌的载玻片上，然后挑取培养皿中菌种的菌丝于琼脂块的3个角上，再盖上灭过菌的盖玻片，用记号笔轻轻敲1下，以免盖玻片移动，在玻片上做好标记，于28 ℃培养箱中培养3 d左右（整个过程都要保证无菌状态）。

1.2.4显微特征观察取出培养3 d后的玻片，置于显微分析仪的操作台上，用针尖轻轻挑起蓋玻片的一侧，慢慢地拿起盖玻片，并轻轻地挑掉周围的培养基，在新的载玻片中央滴1滴甲基蓝，盖玻片的一侧先接触液体，然后慢慢地放下盖玻片，用滤纸吸取周围多余液体，置于显微镜下观察，观察菌丝以及孢子并进行拍摄，同时使用测微尺测量孢子的大小（长和宽都要测）。每个菌株的孢子各测30个，记录数据。

1.2.5木霉菌发酵液（相当于稀释10倍）的制备于 500 mL 三角瓶中加入100 mL的PDA液体培养基，包扎，于高压灭菌锅中121 ℃灭菌25 min，无菌条件下用接种针挑取适量活化木霉菌株的菌丝，接种于三角瓶中的培养基中，置于28 ℃的摇床上150 r/min培养7 d，获得各菌株的发酵液，发酵液4 000 r/min离心5 min，取上清液，再在无菌状态下用022 μm滤膜过滤除菌，滤液分别装于灭菌锥形瓶中。

1.2.6抑菌效果的测定将PDA固体培养基加热至熔化，室温静置，待培养基温度降到60 ℃左右时，将木霉菌发酵液与培养基按照体积比1 ∶9充分混匀，混匀后立刻倒平板，在无菌操作台上室温放置至凝固，即制成含发酵液的平板，以不加发酵液的PDA平板为对照。从培养好的4种病原真菌菌落上，用灭过菌的打孔器沿边缘打出直径为0.4 cm的圆形菌块，将菌块分别转接至已凝固的培养基平板表面，并设3个重复，以无发酵液平板为对照，置于25 ℃培养箱下培养3 d。用十字交叉法测定菌落直径并记录数据，根据以下公式计算抑菌率：抑菌率=（对照菌落直径-发酵液处理后的菌落直径）/对照菌落直径×100%。

nlc202309040045

2结果与分析

2.1木霉菌菌落形态和显微形态描述

供试木霉菌得菌落形态和孢子等特征见图1、表1，根据这些特征初步鉴定，DBs0-13为多孢木霉（T. polysporum）、DBs57为里氏木霉（T. reesei）、DBs66为长孢木霉（T. longipile）、40号为绿色木霉（T. viride）、171为康氏木霉（T. koningii）、292为哈茨木霉（T. harizianum）。表1木霉菌相关形态特征

2.2供试木霉对病原真菌的抑制作用

由表2可知，多孢木霉菌DBs0-13和171康氏木霉对4种病原真菌都有抑菌作用；其他4种木霉菌（DBs57、DBs66、40、292）除对小麦赤霉病菌没有抑制作用外，对其他病原菌也有较强的抑制作用。对小麦赤霉病菌抑制作用最强的是171；对苹果轮纹病菌抑制作用最强的是40，抑菌率为4885%；对油菜菌核病菌、可可球二孢菌抑制作用最强的是DBs0-13，抑菌率分別为62.89%、41.12%。综合抑菌结果可知，在所有供试木霉中DBs0-13的抑菌效果最好，是值得开发的生防菌。

3结论

6种内生木霉菌对苹果轮纹菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，而对小麦赤霉菌基本上不具有抑制作用（除了DBs0-13和171号木霉菌），与空白对照相比成负抑制状态，很有可能对小麦赤霉菌的生长反而具有促进作用。其中，DBs0-13具有比较高的抑菌率，而且其抑菌范围较宽，是比较好的生物农药资源，可以作田间试验以进一步开发利用。

参考文献：

[1]邹文欣，谭仁祥. 植物内生菌研究新进展[J]. 植物学报，2001，43（9）：881-892.

[2]孙勇，缪倩，孙颖，等. 6种植物中内生镰刀菌的分离和鉴定[J]. 江苏农业科学，2010（5）：437-439.

[3]李梅云，谭丽华，方敦煌，等. 哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究[J]. 微生物学通报，2006，33（6）：79-83.

[4]王芊. 木霉菌在生物防治上的应用及拮抗机制[J]. 黑龙江农业科学，2000，42（1）：412-431.

[5]刘连妹. 绿色木霉HT01的生物学特性和抑菌特性[J]. 西北农业学报，2008，17（6）：179-183.唐梅，龚明福，罗燕，等. 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内生细菌KLXD06粗蛋白的提取[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：334-335.

篇4：青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定

关键词 香草兰 ；芽孢杆菌 ；16S rDNA 鉴定 ；脂肽类化合物

分类号 S435.73 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.009

Abstract Ten bio-control Bacillus strains were selected via dual culture method from the isolates obtained from vanilla rhizosphere of Wanning city and Qionghai city in Hainan province. The selected isolates were highly antagonistic against vanilla pathogens：Fusarium oxysporum，Phytophthora nicotianae and Erwinia carotovora. Seven B. amyloliquefaciens strains， two B. subtils strains and one B. methylotrophicus strain were identified by the assays of 16S rDNA sequence and the phylogenefic tree. Lipopeptide compound analysis via dual culture method showed that all 10 lipopeptide extractions from each bio-control strain exhibited highly antagonistic against F. oxysporum and P. nicotianae， while 4 lipopeptide extractions were highly antagonistic against E. carotovora. Lipopeptide compound analysis via MALDI-TOF/TOF -MS showed that strain VX2R11 produced Surfactin and IturinA，while strain VX2S02 produced Iturin A， suggesting that strainVX2R11and VX2S02 might via the production of IturinA to antagonize pathogens F. oxysporum and P. nicotianae， while strainVX2R11 might via the production of Surfactin to antagonize pathogen E. carotovora.

Keywords Vanilla fragrans ； Bacillus spp ； 16S rDNA sequence ； lipopeptide

香草兰[Vanilla fragrans（salisb.）Ames（V.planifolia）]是一种经济附加值极高的热带经济作物，素有“食品香料之王”的称誉。香草兰根（茎）腐病是一种危害极大的土传病害，其病原物是尖孢镰刀菌（Fusarium. oxysporum）[1]。镰刀菌土传病害是世界性防治难题，其化学防治成本高、风险大；而且香草兰栽培品种极其单一，没有抗性品种，目前对该病害严重缺乏简单有效的防治手段。近年来，香草兰根（茎）腐病已在我国香草兰种植区爆发流行，造成很多香草兰种植园荒废，严重阻碍了香草兰产业的发展[2]。同时，香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病也是香草兰上重要病害，其病原物分别为烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）和胡萝卜欧文氏杆菌（Erwinia carotovora），每种病害每年给香草兰产业造成约15%～30%的损失，也是香草兰生产上的重要问题。

生物防治技术日益兴起，其防治谱广和对环境友好的特点使其成为当前的研究热点之一。目前，国内外已经开始利用生防菌防治香草兰病害的探索。Ramalingam等[3]发现荧光假单胞（Fluorescent pseudomonads）等生防菌株在温室和田间均能够显著降低香草兰根（茎）腐病的严重度。Radjacommarea等[4]发现17株木霉（Trichodema）对包括香草兰根（茎）腐病菌有抑制活性，其中2株木霉菌与荧光假单胞菌和壳多糖相结合获得了良好的大田防病效果。曾会才等[5]发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OBS-2菌株在盆栽和大田试验上对香草兰根（茎）腐病和香草兰疫病具有良好的防治效果。李霞等[6]在对搜集到的9株木霉、枯草芽孢杆菌和荧光假单孢菌进行了平板抑制活性分析。

迄今为止，国内外对香草兰生防菌筛选和应用的报道极少，对香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病的报道几乎空白。已报道的生防菌株也多为分离自其他作物的外源菌株，鲜有来自香草兰生境的天然生防菌。这些香草兰生防菌的生防机制也尚未见报道。本研究以香草兰上主要病害香草兰根（茎）腐病、香草兰疫病和香草兰软腐病菌为靶标，对香草兰根际生防细菌开展了筛选、鉴定及作用机理分析等工作，为进一步研究香草兰重要病害的绿色高效防控提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

本研究中平板对峙培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA），细菌培养所用培养基为Luria-Bertani（LB）培养基；生防菌发酵所用培养基为Landy培养基[7]。

1.1.2 菌株

本研究所用3种病原菌香草兰根（茎）腐病菌、香草兰疫病菌和香草兰细菌性软腐病菌均来自中国热带农业科学院香料饮料研究所。

1.1.3 试剂和引物合成

本研究基因组的提取和PCR扩增均使用天根生化科技（北京）有限公司“快速DNA提取扩增套装”试剂盒完成；PCR片段纯化均采用天根生化科技（北京）有限公司“琼脂糖凝胶回收试剂盒”完成；PCR引物的合成均在深圳华大基因科技服务有限公司完成；其他试剂如氯化钠、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钾、L-苯丙氨酸、硫酸锰、五水硫酸铜、七水硫酸亚铁等均为分析纯。PCR所用引物为细菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT- 3′）[7]。

1.2 方法

1.2.1 生防菌筛选

采用平板对峙培养法进行生防菌筛选。将香草兰根（茎）腐病和香草兰疫病的病原菌在PDA平板上活化后打成直径0.5 cm的圆形菌丝块，然后将菌丝块接种在新平板中央并在四周接种活化后的香草兰根际细菌。将浓度为109 cfu/mL的香草兰细菌性软腐病菌以2%比例加入到冷却至约50℃的PDA培养基中，摇匀后倒平板；然后将浓度为109 cfu/mL的香草兰根际细菌液5 μL接种在含菌平板上。所有平板均放置在28℃恒温培养箱中培养，5～7 d后测量抑菌圈直径。

1.2.2 生防菌16S rDNA序列分析鉴定

生防菌提取基因组DNA后，采用细菌16S rDNA通用引物进行16S序列扩增[7]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后通过紫外凝胶成像仪检测并切胶回收，回收产物送到深圳华大基因科技服务有限公司测序。测序结果在NCBI网站的基本局部比对搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）进行序列比对分析。

将本研究获得的生防菌16S rDNA序列上传到GenBank，下载近源菌株的16S rDNA序列用于系统发育树的构建。用Clustal X 2.1和MEGA6.06软件进行系统发育树构建[7]。

1.2.3 脂肽类化合物分析

将待测菌株接种在LB培养基中200 r/min 37℃条件下培养12 h；然后以3%比例转接入50 mL landy培养基，在200 r/min 30℃条件下发酵40 h；用酸沉淀法[8]提取脂肽类化合物，粗提物浓缩至3 mL后经0.22 μm孔径滤膜过滤后备用。采用平板对峙培养法检测各菌株脂肽类粗提物的抑菌活性，方法见本研究“1.2.1生防菌筛选”，仅将“接种生防菌”更换为“滴加10 μL脂肽类粗提物”。通过AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF-MS仪器进行飞行时间质谱检测，根据质谱结果初步判断物质种类[9-10]。

2 结果与分析

2.1 生防菌筛选

通过平板对峙培养法从香草兰根际细菌中筛选到对香草兰根（茎）腐病菌、香草兰疫病菌和香草兰细菌性软腐病菌3种病原菌均有良好抑菌效果的菌株10株；对香草兰根（茎）腐病菌和香草兰疫病菌的抑菌圈平均直径均>15 mm，对香草兰细菌性软腐病菌的抑菌圈平均直径均>10 mm（图1、表1）。

2.2 香草兰根际生防菌鉴定

以生防菌DNA 为模板扩增 16S rDNA 片段，获得大小约 1.5 kb的 PCR片段，将测序结果在 NCBI 网站通过BLAST 软件与 GenBank 中己知序列进行比对分析。结果表明：GenBank 中与10株生防菌16S序列同源性最高的菌株均为芽孢杆菌属菌株；其中菌株VD18S15与甲基营养型芽孢杆菌 HB26的 16S rDNA 的序列同源性为 99%，菌株VD18R19和VX1R02与枯草芽孢杆菌 168的16S rDNA 的序列同源性均为100%，菌株VD18S27与解淀粉芽孢杆菌D15的 16S rDNA 的序列同源性为100%，菌株VD21R27和VX1S06与解淀粉芽孢杆菌 D12的 16S rDNA 的序列同源性均为100%，菌株VX2R11和VX2S02与解淀粉芽孢杆菌的 16S rDNA 序列同源性均为100%，菌株VX4S09和VX4S18与解淀粉芽孢杆菌 SQR-7的 16S rDNA 序列同源性均为100%。

以1株荧光假单胞菌株WCS365（登陆号：KP253039）为外群，以枯草芽孢杆菌168（登陆号：KP318826）、甲基营养型芽孢杆菌HB26（登陆号：KM659227）和解淀粉芽孢杆菌SQR-7（登陆号：KC888017）为参照，构建系统发育树（图2）。结果发现：10株生防菌被聚类为3个分支；其中菌株VX4S09、VX2S02、VX4S18、VD18S27、VD21R27、VX2R11、VX1S06与解淀粉芽孢杆菌SQR-7聚类在同一分支，菌株VD18S15与甲基营养型芽孢杆菌 HB26被聚类在相同分枝，菌株VD18R19和VX1R02与枯草芽孢杆菌168被聚类在同一分支。

2.3 脂肽类化合物分析

10株生防菌发酵后均能成功得到脂肽类粗提物。所有的脂肽类粗提物对病原真菌F. oxysporum VFO62和病原细菌P. nicotianae VPN01的抑菌圈平均直径均>15 mm，大部分粗提物的抑菌圈平均直径达20 mm以上（表1、图3）。说明脂肽类化合物在这10株生防芽孢杆菌的抑制真菌机制和抑制卵菌机制中均起重要作用。但是对病原细菌 E. carotovora VEC03的抑菌效果呈现两极分化，出现强烈抑菌和完全不抑菌两组（表1、图3）：VD18R19、VD18S15、VX1S06、VX2R11等4个菌株的抑菌圈平均直径均 >20 mm；其他6个菌株检测不到抑菌效果。该结果表明，脂肽类化合物在菌株VD18R19、VD18S15、VX1S06和VX2R11的抑制细菌机制中起重要作用；同时推测，其他6株生防菌可能产生其他种类的抑细菌物质。

从生防菌脂肽类粗提物中选取对真菌、卵菌和细菌均有良好抑制效果的VX2R11以及仅对真菌和卵菌抑制效果良好的VX2S02进行MALDI-TOF/TOF-MS检测。检测图谱显示（图4），菌株VX2R11在m/z值为1 030.631 0，1 044.621 9，1 058.660 9处有离子峰的出现，这3个离子峰对应于表面活性素的分子质量[9]； 在m/z值为1 065.534 1，1 079.546 6，

1 093.562 1，1 109.535 8处有离子峰的出现，这4个离子峰对应于伊枯草素A的分子质量[10]。菌株VX2S02在m/z值为1 065.504 0，1 079.515 4，

1 093.533 1，1 109.505 4处有离子峰的出现，这4个离子峰对应于伊枯草素A的分子质量[10]。MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析结果表明，菌株 VX2R11 产生脂肽类化合物表面活性素和伊枯草素A，菌株 VX2S02 仅产伊枯草素A。

3 讨论与结论

香草兰通常种植于温暖、潮湿、荫蔽的环境中，该环境适于病原菌孳生，极易产生病害。本研究从香草兰根际筛选生防菌，希望利用香草兰生境中天然的生防菌来抑制病原菌数量达到防病的目的。本研究以香草兰上3种重要的病害为靶标进行抑菌筛选，得到了广谱生防菌10株。经过16S rDNA序列鉴定和系统发育树分析，发现10株生防菌均为芽孢杆菌属菌株，包含解淀粉芽孢杆菌7株、枯草芽孢杆菌2株和甲基营养型芽孢杆菌1株。芽孢杆菌类生防菌广泛分布于各种自然环境中，容易进行人工培养，可以产生芽孢抵抗紫外线、干旱、高温、低温等逆境，耐贮藏和运输，使芽孢杆菌类生防菌在开发和应用上更具优势。

当前国内外对香草兰生防菌的研究多在应用层面，对其生防机制知之甚少。脂肽类化合物是芽孢杆菌产生的最主要的抑菌物质[11-14]，其分子量一般在900～2 000[15]。本研究通过生防菌脂肽类化合物分析来探讨其生防机制。采用酸沉淀法提取生防菌脂肽类化合物进行抑菌分析，结果发现，10株生防菌脂肽类粗提物对病原真菌和卵菌有良好的抑菌效果，4个菌株的脂肽类粗提物对病原细菌抑制效果良好。该结果说明，脂肽类化合物在生防菌抑制香草兰病原真菌、卵菌和细菌过程中起重要作用。

为了进一步分析香草兰生防菌的生防机制，本研究选出2个菌株，脂肽类粗提物对3种病原菌均有良好抑制活性的VX2R11菌株以及仅抑制2种病原菌的VX2S02菌株进行MALDI-TOF/TOF-MS检测，发现菌株 VX2R11产生表面活性素和伊枯草素A两种脂肽类化合物，菌株 VX2S02 仅产生伊枯草素A。前人研究表明，芽孢杆菌产生的脂肽类化合物中，表面活性素对细菌和病毒有良好的抑制活性[12，16]，伊枯草素A对真菌和卵菌具有强烈的抑制活性[14-15]，与本研究结果相符。由此推断，菌株VX2R11及VX2S02对香草兰根（茎）腐病菌和香草兰疫病菌的拮抗效果可能通过产生伊枯草素A实现；菌株VX2R11对香草兰细菌性软腐病菌的拮抗效果可能通过产生表面活性素实现；菌株VX2S02对病原细菌的拮抗效果可能来自于菌株产生的非脂肽类物质，其物质种类还有待于进一步研究。

本研究从拮抗物质的角度初步探讨了香草兰根际生防菌的生防机制。此外，还可能存在竞争、诱导寄主植物抗性等生防机制，需要更多的深入研究。虽然生防菌的应用目前尚不成熟，但是生防芽孢杆菌自身的天然、环境友好、易培养、耐贮藏、广谱等特性赋予其广阔的应用前景。

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篇5：青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定

关键词：车前草；内生真菌；分离；抑菌活性

中图分类号：Q939.9 文献標志码：A 文章編号：1002—1302（2016）01—0353—04

植物内生菌（Endophyte）是指在一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织器官或细胞间隙内的细菌、真菌或放线菌。研究证实，内生菌和宿主问的生态关系密切，发挥着多种生物学功能。有些内生菌对植物病原菌具有拮抗作用，可保护植物免受病害侵袭；有些内生菌可使宿主体内形成某些次生代谢产物；有些内生菌能产生与宿主相同或类似的生理活性成分；还有些内生菌只是与宿主具有共生或伴生关系，其生物学作用尚未被揭示。目前从植物内生菌中已分离到较多的生防菌种，但有关车前草内生菌资源的研究却未见报道。车前草作为我国传统中药，别称车轮菜，是车前科植物车前（Plantago asiatica L.）或平车前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有清热、利尿、通淋、凉血、祛痰、解毒等药理功效，可用于痰热咳嗽、吐血衄血、热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痈肿疮毒等疾病治疗。迄今，关于车前草品种资源、种植技术、活性成分及其生物学功能等方面已有较多报道，却无关于其内生菌相关的研究报道。本研究从车前草叶中分离内生真菌，并测定其对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等4种指示菌的抑菌活性，旨在筛选出具有抑菌活性的车前草内生菌，再筛选出具有明显抑菌效果的菌株，优化其发酵条件，为进一步发掘抑菌活性物质并开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物 分离内生菌所用材料为无病虫害、生长旺盛的车前草叶片组织，采自山东省淄博职业学院郊外。

1.1.2指示菌 指示菌为金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌，由淄博职业学院制药与生物工程系实验室提供。

1.1.3培养基 内生真菌分离和纯化采用PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水补足体积至1 L，pH值7.2～7.4；指示菌生长采用营养琼脂培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水补足体积至1 L，pH值自然；液体发酵采用PD培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水补足体积至1 L，pH值为7.2～7.6。以上各种培养基均在0.1 MPa、121℃条件下高温灭菌30 min后备用。

1.1.4药敏试纸 药敏试纸购自北京赛为思生物技术开发中心，氯霉素药敏试验纸片浓度30μg/片，强力霉素药敏试验纸片浓度30μg/片，杆菌肽药敏试验纸片浓度10μg/片，青霉素药敏试验纸片浓度10μg/片，庆大霉素药敏试验纸片浓度10μg/片。

1.2试验方法

1.2.1内生菌分离与纯化 内生真菌分离参照组织块点植法进行。取新鲜车前草的叶片组织，用自来水洗净，消毒纸吸干，75%乙醇溶液浸洗15～30 s，无菌水反复冲洗后吸干，0.1%氯化汞漂洗1～2 min，无菌水冲洗吸干。将消毒后的叶片切成0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，种植于加有30 mg/L链霉素的PDA平板上，每平皿接种3块，于28℃下静置避光培养，待叶片组织边缘长出菌丝后，用接种针挑取少许边缘菌丝接种到新的PDA培养基上，反复纯化至单一培养菌株，置于4℃冰箱保存待用，分别将菌种编号为Y₁、Y₂、…、Y_n。

为检测试验材料表面是否彻底消毒，取以上最后1次冲洗液涂布于PDA培养基平板上，于同等条件下培养作为对照，如对照平板无菌丝长出即表明消毒彻底，后续试验所分离到的真菌来自叶片内部。

1.2.2内生真菌发酵液的制备 在内生真菌纯化用的PDA培养基上，用0.4 cm打孔器在平板上各打取6块菌饼，接种于装有PD培养基的100 mL摇瓶中，静置1 d后，于28℃、180 r/min恒温培养5 d，制备成单个内生真菌的发酵产物。将摇瓶取下静置后，取上层清液于3 500 r/min离心10 min，取上层清液于4℃保存备用。

1.2.3配制1×10⁶CFU/mL的指示菌悬液 用接种环取少许指示菌分别接于等量PD营养培养基中，置于37℃下活化培养1 d。依据微量稀释法将活化后的指示菌配成1×106CFU/mL悬液，作为内生真菌抑菌作用的后续研究材料。指示菌包括金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。

1.2.4内生真菌发酵液抑菌活性 采用滤纸扩散法测定内生真菌的抑菌活性。在无菌条件下，取1×10⁶ CFU/mL的指示菌悬液100μL，均匀涂布于营养琼脂培养基上，将吸有真菌发酵液、直径6 mm的无菌滤纸圆片置于培养基中，每种发酵液重复3次，以无菌水为对照，同时以氯霉素、青霉素、杆菌肽、强力霉素、庆大霉素等药敏试纸作抑菌效果对比，37℃培养7～8 h后，用游标卡尺采用十字交叉法测其抑菌圈直径，取其平均值作为该菌株发酵产物的抑菌直径。各样品抑菌效果的判定标准为：抑菌圈直径>15 mm为高度敏感，抑菌圈直径10～15 mm为中度敏感，抑菌圈直径7～9 mm为低度敏感，无抑菌圈者为不敏感。

nlc202309031610

1.2.5最强抑菌活性菌代谢产物的抑菌作用 无菌条件下，取100μL指示菌悬液均匀涂布于LB培养板上，35 min后将浸泡最强抑菌活性菌发酵液（2 h）、直径6 mm的无菌滤纸片圆片，贴附到指示菌平板上，同时做氯霉素、强力霉素、杆菌肽、庆大霉素、青霉素等药敏试纸的对比试验，每个处理重复3次，37℃培养1 d，观察各培养板指示菌的生长状况及抑菌圈大小，测定各处理抑菌圈直径，即为相应样品抑菌圈值。

1.2.6最低抑菌浓度（MIC） 将最强抑菌活性菌发酵液蒸发浓缩干燥，配制成一定质量浓度，采用琼脂二倍稀释法、滤纸圆片扩散法，设置3组平行试验，各设8个梯度，测定车前草内生真菌发酵液对大肠杆菌的MIC值。

1.3数据处理

采用SPSS 17.0统计软件分析试验数據。

2结果与分析

2.1内生真菌发酵液抑菌作用

从车前草叶中分离到具有抑菌活性的内生真菌共14株，其中至少对1种指示菌具有中等抑菌作用（抑菌直径>10 mm）的有11株；至少对1种指示菌具有高抑菌活性（抑菌直径>15 mm）的内生真菌有8株，占总分离菌株数量的42%；另有5株内生真菌对各指示菌均无抑制作用（表1）。

2.2内生真菌抑菌效果

由表2可见，所分离到的车前草内生真菌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，共有12株内生真菌对其有抑菌活性，占总分离菌株数量的63%；对粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌具有抑菌活性的菌株分别占总分离菌株数量的47%、58%、37%。总的来说，分离到的内生菌对指示菌的抑菌活性有差异，具有一定的特异性。

在具有抑菌活性的14株内生真菌中，以Y₁₁的效果最好，在对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌抑菌试验中的抑菌圈直径>15 mm，并表现出一定的广谱特性，可见该菌株抑菌作用显著，具有很高的研究价值和应用前景。因此，以Y₁₁为车前草高抑菌活性内生真菌，进行该菌株与常用抗生素的对比研究，并进一步探讨其最低抑菌浓度。

2.3 Y9发酵液与抗生素抑菌活性对比

如表3所示，与几种常用抗生素相比，车前草内生真菌Y₁₁发酵液对4种指示菌均有较好的抑菌作用。Y₁₁发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与强力霉素、杆菌肽接近，显著弱于青霉素（P<0.05），显著强于氯霉素（P<0.05）；对粪链球菌的抑制作用也相对较强，与对照抗生素抑菌效果接近；对大肠杆菌的抑菌圈大于青霉素、庆大霉素，却小于氯霉素、强力霉素、杆菌肽；对沙门氏菌的抑菌圈只是略大于氯霉素。可见，Y₁₁发酵液具有较强的抑菌效果，且广谱性较好，但特异性不如部分供试抗生素。

2.4对大肠杆菌的最低抑菌浓度

从表4可见，将Y₁₁发酵液浓缩干燥后，其对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度分别为0.125、0.250、0.031、1.000 g/L，反映出车前草最强抑菌株的抑菌特性。

3讨论

3.1车前草内生真菌的分离结果

现有研究证实，植物内生真菌遍存在于各种植物体内，可作为微生物资源进行应用开发，成为新型生物医药。其原因是内生真菌能与宿主植物形成特殊生境心，二者均具备类似代谢物的合成途径，即可产生宿主植物所富集的生物活性物质。车前草所含生物活性物质抑菌功能显著，具有重要的医药价值，目前却无相关内生真菌的研究。现代生物学中，体外抑菌试验常被作为抑菌研究的主要方法，能准确地揭示供试品的抑菌效果，不受内环境各因素的干扰，且具有重复性好的特点。因此，要研究车前草内生真菌的抑菌作用，可先分离纯化出内生真菌，再进行发酵液体外抑菌试验。

本试验对车前草内生真菌进行分离纯化，共获取19株活菌，并全部进行发酵，获取代谢产物进行抑菌试验，筛选出1株Y₁₁菌株，具有最强抑菌作用。车前草内生真菌的获取受到生境、品种、分离、纯化等因素的影响，个样研究已揭示其代表性，但有關车前草内生真菌的分离研究还有待进一步探讨。

3.2车前草内生真菌的抑菌作用

内生真菌可脱离宿主植物独立生长，在适宜生境中能通过发酵获得大量目的活性产物，依据该特性可获取新源天然药物，以缓解某些药用植物资源短缺、生长周期长、生态系统损害等现象，并能为新药开发与濒危药用植物保护等难题提供重要思路。研究证实，车前草体内能合成多种活性物质，并具有广谱抗菌效果，可能与其共生的内生真菌有关。

一直以来，抗生素在人与动物疾病防治中发挥着巨大功能，但由于病原菌耐药性增加、药物残留等问题的日益凸显，使得寻求天然、高效、绿色的替代品更加重要。本研究从车前草叶片内共分离到19株内生真菌，其中8株发酵液至少对1种指示菌具有较强的抑菌效果，而其他不具有抑菌活性的内生真菌极可能是由于所取组织部位处在代谢休眠期，也可能因培养条件不适等。可见，内生真菌合成抑菌活性物质还受到外界环境温度、pH值以及培养时间等因素的影响，有待深入研究。后续研究证实，Y₁₁发酵液对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌均表现出较强的抑制作用，尤其是对前三者具有很好的抑菌效果，可与部分抗生素相媲美，且具有较低的最低抑菌浓度，预示Y₁₁菌株具有非常高的开发价值，极可能取代部分抗生素进行应用。

3.3结论

本研究从车前草内生真菌中筛选出Y₁₁菌种，其代谢活性产物对金黄葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等指示菌均表现出很好的抑菌作用，且效果与部分常用抗生素相近，具有良好的应用价值。因此，下一步有必要研究车前草内生真菌活性产物的抑菌成分、理化特性、作用机制以及活菌株培养时间、pH值、温度、营养素构成等条件优化，为车前草抗菌活性物开发利用提供依据。

篇6：青梅抑菌作用及其抑菌成分的分离鉴定

关键词：淫羊藿；内生真菌；抑菌活性

中图分类号：S482.2+92；Q939.9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0327-03

淫羊藿，为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿等多种淫羊藿的茎叶[1]，主产于贵州、辽宁等省[2-3]，夏、秋季采收，割取茎叶，除去杂质，晒干。淫羊藿茎叶含有淫羊藿苷和挥发油。中医学认为淫羊藿性味辛甘、温，有补肾壮阳、祛风除湿的功效；同时，淫羊藿还可以抑制血管运动中枢，扩张周围血管，使血压下降，对脊髓灰质炎病毒、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等有显著的抑制作用。淫羊藿在临床上主要用于治疗生殖、骨关节、呼吸系统疾病[4-5]。

植物内生真菌（endophyte fungus）是指在健康植物寄生的、在各种组织和器官内部或细胞间隙中进行部分或全部生活周期而不使宿主表现明显病理症状的一类真菌[6]。有研究发现，内生真菌普遍存在于植物组织内，并和宿主植物长期共生，与宿主在遗传、生理、代谢等方面相互渗透、同步进化，形成互利互惠的共生关系，使得它极有可能与宿主交换遗传信息，从而产生相似或相同生理活性的次级代谢产物[7]。1993年Stierle等从短叶红豆杉内生真菌中分离得到紫杉醇后，国内外学者从多种药用植物中陆续分离得到产生活性物质的内生真菌[6，8]，因此具有重要经济价值的药用植物内生真菌已成为筛选新药物的潜在资源[9-12]。

本试验以贵州省贵阳市郊的野生淫羊藿（Epimedium）为材料进行内生真菌的分离，并对其抗菌活性进行初步研究，以获得产生生物活性次生代谢产物的药用微生物，进而为新型抗菌物质的获得开辟一条新路径。

1 材料与方法

1.1 样品采集与内生真菌的分离

淫羊藿样品采自贵州省贵阳市郊。采集的新鲜植物样品4 ℃保存，72 h内处理。

1.2 供试指示菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由贵州师范大学微生物实验室保存。

1.3 试验流程

淫羊藿内生真菌分离及抑菌活性试验流程见图1。

1.4 内生真菌的分离、纯化

将采集的新鲜样品用自来水洗净泥土等脏物，根、茎、叶分别切为0.5 cm的小片。在无菌条件下，对样本进行表面消毒，具体步骤如下：无菌水冲3次，Tween-20 处理30 s，8%次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水冲洗3 次，75%乙醇浸泡5 min，无菌水洗涤3次。同样无菌条件下将样本切成0.2 cm×0.2 cm 大小接种于PDA平板上，28 ℃培养至出现菌落，从菌落边缘取菌丝分别接种于新鲜平板，经反复转接得到纯化菌株，保藏待用[13]。

1.5 指示菌的培养

将枯草芽胞杆菌和大肠埃希菌的单菌落接种于5 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃培养18 h，将金黄色葡萄球菌单菌落接种于LB培养基，用无菌水制备浓度约为 2.2×105 CFU/mL 的菌悬液，灰霉病菌在PDB培养基里 28 ℃ 摇床振荡3 d，取100 μL 菌悬液接种于PDA固体培养基上，用玻璃环涂抹，进行抑菌试验。

1.6 抗菌活性菌株的初选

采用琼脂块法对所分离得到的内生真菌进行抗菌活性的初选，具体步骤如下：用打孔器从在PDA平板上生长的菌落上截取直径为6.0 mm的琼脂块，用无菌镊子将琼脂块放置于涂有指示菌的PDA平板上，28 ℃培养3 d，观察及测量抑菌圈直径[14]，重复3次。

1.7 抗菌活性菌株的复选

检测活性菌株发酵液的抑菌活性，作为活性菌株的复选方法，具体步骤如下：将初选菌株接种于100 mL PDB液体培养基中，28 ℃摇床培养8 d，4 000 r/min 离心15 min，收集上清，过滤除菌，用旋转蒸发仪将90 mL发酵液缩至1 mL。将纸片放在涂有指示菌的PDA平板上，点入20 μL发酵液在纸片上，28 ℃培养3 d，观察并测量抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿内生真菌分离结果

采用组织分离法从淫羊藿叶、茎、根中共分离得到23株菌落形态特征有差异的内生真菌，其中A类菌株有6株，B类有10株，K类有7株，试验部分菌株形态见图2，其生态学和分子生物学鉴定还有待研究。

2.2 淫羊藿内生真菌抑菌活性初步测定

用琼脂块法从23株内生真菌中初选抗菌活性较强的菌株。结果表明，A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株内生真菌对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和灰霉病菌均有一定的抑菌活性（表1）。

由表1可知，对大肠埃希菌抑菌效果最好的是K6、K7，抑菌圈直径分别达17.0、18.0 mm，其次是A4、B3、B8，抑菌圈直径为13.0 mm。B3对枯草芽孢杆菌抑菌圈直径达到 18.0 mm，效果最好。对金黄色葡萄球菌抑菌效果显著的是B3、K7、K6，抑菌圈直径分别为15.0、14.0、13.0 mm。对真菌指示菌灰霉病菌而言，K6抑制其生长的效果最好，抑菌圈直径为12.0 mm，其次，A3、B3、K7的抑菌效果也很好。

nlc202309041316

3 结论

本试验通过琼脂块法从淫羊藿中筛选得到了具有抗菌活性的A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株菌株，测定了其抑菌直径，根据初选试验可以得出结论：从不同指示菌株来看，对大肠埃希菌抑菌效果最好的是K6和K7；对枯草芽孢杆菌抑菌效果最好的是B3和K6；对金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳的是B3和K7；对灰霉病菌抑菌效果最好的是K6。对于内生真菌来说，A1对大肠埃希菌抑菌效果更好；A3对枯草芽孢杆菌抑菌效果不错；A4对大肠埃希菌抑菌效果更佳；B3对枯草芽孢杆菌抑菌效果更好；B7和B8、K8和K9对几种指示菌的抑菌效果相差不大；K6和K7对大肠埃希菌抑菌效果更佳。

在复选活性测定中有4株菌株具较好的抑菌活性，B3、B8、K9对灰霉病菌菌株有较强的抑菌活性，B3、B7则对大肠埃希菌抑菌活性明显，初步显示B3菌株有广谱的抑菌活性。对初选具抑菌活性的10种菌株的鉴定还有待进一步的分子试验。

植物内生真菌的特殊生境决定了其具有重要的农药和医药应用潜力，而具抗菌、抗肿瘤活性菌株丰富的次生代谢产物已成为药物来源新途径，必将在天然药物研究中得到开发与利用。试验证实，淫羊藿植物内生真菌丰富，分离的部分内生真菌菌株具明显的抗菌活性，对其活性成分进一步分离、分析，对新型药物的筛选具重要意义[15]。

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