抑菌试验方法总结

抑菌试验方法总结（精选3篇）

篇1：抑菌试验方法总结

黄连提取物对耐药金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch,三角叶黄连 Coptis deltoidea C.Y.Chenget Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎.多年生草本,苦,寒.归心、脾、胃、肝、胆、大肠经.

作 者：李俊超 赵迎虎 李伟奇 刘湘新 作者单位：湖南农业大学动物医学院,湖南长沙,410128刊 名：中兽医医药杂志英文刊名：JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：28(3)分类号：S853.74关键词：

篇2：马缨丹抑菌试验研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

植物材料:马缨丹,采自广东省潮州市慧如公园,洗净后80℃烘干备用。

供试菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),由韩山师范学院微生物室提供。

1.1.2 试剂

95%乙醇、氯化钠、盐酸等均为分析纯,广州化学试剂厂;牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉均为生物化学试剂,广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 仪器

LDZX-50KB不锈钢自动型压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);SW-CJ-IC型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);SPX-270型培养箱(宁波市科技园区新江南仪器有限公司);DGX-9243B-1鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司);SHB-III型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);RE-52D旋转蒸发器(上海春泸西仪器厂);HH-2恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂);PHS-3D pH计(上海雷磁);FA1104型电子天平(上海衡平仪器仪表厂)。

1.1.4 培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基和液体培养基。

1.2 方法

1.2.1 马缨丹水煎煮液的制备

称取100g马缨丹,剪碎并研磨,加入500mL蒸馏水,浸泡30mim,小火煮沸30min,抽滤得滤液,药渣再加500mL蒸馏水,小火煮沸30min,再次抽滤得滤液,合并两次滤液,然后小火加热蒸发浓缩至100mL,制成含生药量为1g/mL马缨丹水煎煮液,4℃保存待用。

1.2.2 马缨丹乙醇提取液的制备

称取100g马缨丹,剪碎并研磨,加入500mL 95%乙醇,浸泡3h后抽滤得滤液,药渣再加500mL 95%乙醇,浸泡3h后再次抽滤得滤液,合并两次滤液,用低温(≤60℃)减压蒸馏回收乙醇,浓缩制成含生药量为1g/mL马缨丹乙醇提取液,4℃保存待用。

1.2.3 菌悬液的制备[9]

将供试菌种分别接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上,37℃恒温培养24h后,取1环接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,置37℃恒温培养24h。进行平板菌落计数,根据计算结果用无菌生理盐水将菌液调至约为106cfu/mL,4℃保存待用。

1.2.4 抑菌实验方法

1.2.4.1 抑菌圈大小测定[10,11]

用无菌刻度吸管吸取1mL供试菌液置于无菌培养皿中,再倒入溶化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约15mL,轻轻转动培养皿,使菌液与培养基混合均匀,冷凝制成平板。将含生药量为1g/mL的马缨丹水煎煮液和乙醇提取液,前者用无菌水后者用少量乙醇溶解后加无菌水稀释成浓度为0.8g/mL、0.6g/mL、0.4g/mL、0.2g/mL、0g/mL(对照)的药液。用无菌镊子将直径为6mm的灭菌干燥滤纸片分别放入装有各浓度药液的培养皿中浸泡30mim,然后取出滤纸片,在培养皿内壁上滤去多余的药液,将滤纸片贴入上述平板的表面,每皿贴4片,每菌每种浓度重复做3次,贴好滤纸片的平板在室温下放置20mim后倒置于37℃恒温培养24h,取出测定抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。

1.2.4.2 最小抑菌浓度(MIC)测定

采用试管2倍稀释法测定MIC[11]。取10支灭菌试管,各管分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基1mL,在第1管中加入1mL灭菌的1g/mL马缨丹提取液,混匀后吸取1mL加入到第2管中,依次类推,直至第8管,第8管吸取1mL弃去,使其成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等浓度梯度。向1~8管中分别加入0.05mL菌液,第9管不加马缨丹提取液,加菌液0.05mL作为对照,以观察细菌的生长情况。第10管加马缨丹提取液1mL,混匀后,不加菌液,以观察提取液是否被污染。重复实验3次,将各管置于37℃恒温培养24h,观察结果。若药液透明,可直接判定结果,若色泽较深,则用接种环挑取1环培养液于牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线培养18~24h,观察结果,以无菌生长的最低稀释度为MIC。

1.2.4.3 温度对抑菌效果影响测定

将浓度为0.5g/mL的两种马缨丹提取液经121℃高压蒸汽灭菌处理后,采用1.2.4.1中所用的滤纸片法测定抑菌圈直径,以确定高压蒸汽灭菌对马缨丹提取液抑菌效果的影响。

1.2.5 数据分析

所得数据采用SPSS 17.0软件分别进行多重比较分析和t检验分析。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小的测定结果

采用滤纸片法测定马缨丹水煎煮液和乙醇提取液的抑菌圈直径,结果见表1。

由表1可知,当马缨丹两种提取液生药含量大于0.4g/mL时,它们对3种细菌都有一定的抑制作用,抑菌效果依次为:枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。马缨丹乙醇提取液在较大浓度(1.0g/mL)时,对3种细菌的抑制效果都强于其水煎煮液。随着两种提取液浓度的增大,抑菌圈直径也逐渐增大,但当药液浓度较低(≤0.6g/mL)时,随着药液浓度的增大,马缨丹两种提取液对大肠杆菌的抑制作用变化不明显。

由表1还可见,当马缨丹乙醇提取液浓度在1g/mL时,其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别可达14.5mm和13.4mm,具很好的抑菌效果;另外,在此浓度时,马缨丹水煎煮液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达13.0mm,也具有很好的抑菌效果。

2.2 最小抑菌浓度的测定结果

注:数据为平均值±标准差,同列不同英文小写字母和同行不同英文大写字母均表示差异显著(P<0.05)。数据为3次平行实验的结果,因为滤纸片的直径为6mm,所以在抑菌圈直径为6mm,抑菌作用实际为0。

采用试管2倍稀释法测定马缨丹两种提取液对3种细菌的MIC,结果见表2。

注:表2中“-”表示无菌生长;“+”表示有菌生长。

从表2可知,马缨丹两种提取液对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC小于其对大肠杆菌的MIC,即两种提取液对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用较强,而它们对大肠杆菌的抑制作用较弱。马缨丹乙醇提取液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别是1/64g/mL、1/16g/mL和1/32g/mL,都比水煎煮液对3种细菌的MIC即1/32g/mL、1/8g/mL和1/16g/mL低,即前者抑菌效果强于后者。

2.3 温度对抑菌效果影响的测定结果

马缨丹两种提取液灭菌前后对供试细菌的抑菌圈直径见表3。

注:数据为平均值±标准差;**表示差异极显著(P<0.01);*表示差异显著(P<0.05)。数据为3次平行实验的结果,因为滤纸片的直径为6mm,所以在抑菌圈直径为6mm,抑菌作用实际为0。

表3结果表明,马缨丹两种提取液中的抑菌物质热稳定性较好,经121℃高压蒸汽灭菌处理后,两者对枯草芽孢杆菌的抑制效果较灭菌前有极显著增强,乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较灭菌前也有极显著增强,水煎煮液对金黄色葡萄球菌的抑制效果较灭菌前稍有增强,而它们对大肠杆菌的抑制作用,灭菌前后变化不大。分析原因,可能是灭菌时,高温加热过程中,不同成分间发生系列化学反应,生成了新的抗菌物质,而不同细菌对这类抗菌物质的耐性存在差异。

3 讨论

国外学者Deepak Ganjewala和O. Oluwadayo Sonibare等人[12,13]在近两年中,研究了用乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂制备马缨丹花和叶的提取液以及从叶中提取挥发油开展抑菌试验的研究,结果发现马缨丹的花和叶的提取液以及从叶中提取的挥发油对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑制作用。本文将马缨丹全株作为材料制备水煎煮液和乙醇提取液,探讨它们对上述3种细菌的体外抑菌效果,未见有相关报道,本试验为充分利用马缨丹的抑菌价值提供了一定的依据。

本实验采用水煎煮法和乙醇提取法制备的马缨丹提取液化学成分复杂,抑菌效果可能是其中多种有效成分共同作用的结果,以后可考虑对提取液进行成分分离,并对有抑菌效果的物质进行结构分析和鉴定。究竟哪种有效成分抑菌效果最好,还有待进一步研究。

目前,马缨丹主要用于园林观赏和治疗一些疾病,本实验研究结果为拓宽马缨丹的应用领域奠定了基础,今后,可考虑将马缨丹应用于食品、化妆品及饲料等产品的防腐,开发新型优质产品,充分利用这种入侵植物化废为宝。

摘要：目的:研究马缨丹的体外抑菌效果。方法:制备马缨丹水煎煮液和乙醇提取液,测定其对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度及灭菌前后提取液抑菌效果的变化。结果:当两种提取液生药含量大于0.4 g/mL时,它们对三种细菌的抑菌效果依次为:枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌。马缨丹乙醇提取液对三种细菌的最小抑菌浓度分别为1/64g/mL1、/16g/mL和1/32g/mL,都比水煎煮液的结果1/32g/mL、1/8g/mL和1/16g/mL低。两种提取液经121℃高压蒸汽灭菌处理后对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用有所增强。结论:两种提取液对三种细菌均有不同程度的抑制作用,因此,马缨丹可考虑用于食品、化妆品及饲料防腐等领域,以提高产品质量。

篇3：白接骨丹体外抑菌试验研究

关键词 白接骨丹 抑菌圈范围 敏感度 外伤性感染 葡萄球菌等

资料与方法

供试品的来源及供试液制备：①自接骨丹为多年生草木植物秋季采收，经晾晒后放置1年的全草干品。②取本品100g，置500ml蒸馏水中，浸饱20分钟煎煮30分钟，倒出药液，在药渣中再加入500ml蒸馏水，煎煮20分钟。将2次药液混合，浓缩至1∶[KG-*2]1即为供试液。

供试菌及菌液的制备：选取普通化脓及创伤感染中常见的细菌。即金黄色葡萄球菌、链球菌、八叠球菌、破伤风杆菌、绿脓杆菌 、变形杆菌、大肝杆菌、枯草杆菌、短小芽胞杆菌等。上述菌种均由陕西省药品检验所生测室提供。

以上各细菌临用前各取新鲜菌苔-白金耳于1ml肉汤培养基中，置培养箱37℃培养6小时，作为原液。此时，菌液浓度相当每毫升9亿个。取上述6小时培养物1ml于9ml灭菌肉汤培养基中稀释1∶[KG-*2]1000备用。

培养基及器皿：普通琼脂培养基及肉汤培养基均按《中国药典》2005年版及有关资料配备。试管、刻度吸管、滴管、培养皿、8mm打孔器等，灭菌备用。

抑菌圈范围试验：①试验方法：平板圆孔法。以各种试验菌密集划线于普通营养琼脂平板上，用8mm打孔器打孔，每孔加入无菌试液0.2ml,置37℃环境中培养18小时。②试验结果见表1。

敏感度试验：试验菌液，供试验菌只选用表1中呈较强抑菌作用的菌株。制备方法同上。供试品稀释及接种见表2。

试验方法：试管法：将供试品按等倍稀释为试液1/4、1/8、1/16……等不同浓度，于每管中接种一定量的试验菌液，充分摇匀，置37℃环境中培养18小时，观察结果见表3。

平板法：先将供试品按试管法等倍称释为原液1/2、1/4、1/8……等不同浓度。将各稀释度供试品取1ml分别注入无菌平板内，然后各加已溶化的普通营养琼脂培养基9ml，迅速与供试品混匀、待冷、凝固。对照则用1ml肉汤代替供试品。此时，供试液的稀释度分别为1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320等。将已知各菌以划线法分别接种于平板内，置37℃环境中培养18小时（见表3）。

讨 论

中药白接骨丹通过体外对其有代表性的革兰阳性球菌、杆菌和革兰阴性杆菌等抑菌试验，表明该中药对能引起外伤化脓的金黄色葡萄球菌有高度的抑菌作用（见表1）；对革兰阳性、阴性杆菌基本无抑菌作用。为此，本试验为该药用于外伤性感染提供了选择应用的依据。

由表1看出，该中药的提出液的抗菌作用随浓度增高而增强。提出液对金黄色葡萄球菌的抑菌表现为高度敏感，而稀释为50%供试品对金黄色葡萄球菌的抑菌表现为中度敏感。这就为该药用于临床提出了一定的参考依据。

通过试管法、平板法体外抑菌试验，试管法中该药对金黄色葡萄球菌的敏感度为1∶[KG-*2]64，而平板法则为1∶[KG-*2]80，两种试验方法其结果均在极度范围内，结果基本一致，表明本试验具有一定的可靠性。

由于该试品是经过直接加热浓缩而得，受热温度高、时间长，有可能对其抑菌成分有所影响，所以，如果采用薄

膜蒸发等手段所得供试液，其抑菌效果可能更强。

参考文献