流式细胞仪大学课件

流式细胞仪大学课件（通用6篇）

篇1：流式细胞仪大学课件

流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述

第二节 数据的显示与分析

第三节 流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节 流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点 ：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快： 5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节 概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能

一、工作原理 大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度

细胞活性

效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术 的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

（3）数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光 对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室

载玻片 检测信号 光学信号

形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号（FL）测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理（图示见上）

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

（二）FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节 数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

（五）流式细胞仪的多参数分析---------多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节 流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液；

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存： 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法（金属网引起细胞破碎）

深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶）

乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法 注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；

2、根据实验目的选择最隹的固定方法；

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质； 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等

常用的几类荧光染料

（二）免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合 共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

（一）单细胞悬液制备的质控

（二）免疫荧光染色的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）

温度 试剂选择

pH 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）

染料浓度 实体组织来源标本用机械法

固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2

（三）仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。

（四）免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）

-------（2）晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰

篇2：流式细胞仪大学课件

1．1 流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。

1．2 流式细胞仪的发展简史 最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。

宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。2 流式细胞仪的工作原理和技术指标

2．1 流式细胞仪工作原理 除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。

流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。

激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。

从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

计算机和分析系统

经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。

2．1．1 信号的产生、转换和传输 在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物（每种物质携带的标记物不同吗?）通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管（PMT）。从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA测量等。另一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。

参数（例如：细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构）测量原理

流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π（360°）的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

2．1．2 流式细胞仪分选原理 并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。

2．1．3 数据的显示和分析 数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。

除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。

数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。

2．2 流式细胞仪性能的技术指标 流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为5000～10000，分选速度控制在1000以下。流式细胞仪测量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的，即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。主流流式细胞仪型号及其特性介绍

目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名称Coulter）和德国的Partec公司。

3．1 BD公司流式细胞仪介绍 BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。现在市场上供应的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）、FACS CAlibur（流式细胞仪）、FACSA ria（流式细胞分选仪）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分选流式细胞仪）、LSR II（数字化分析型流式细胞仪）。

FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3，CD4，CD8绝对数而设计的。FACSCalibur是全自动多色流式系统，偏重于临床，其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能。配备有二根激光管，可同时检测4个荧光参数。可识别粘联细胞。

BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达70，000细胞/s，分析速度达50，000/s。使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光，多色分析，分析参数可达15色。两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操作。配件BDACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。

FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统，点对点分选，配置FACS Diva数字化系统，提供全面的配套试剂。速度和功能优于FACSV antage。BD LSR II是LSR的数字化升级版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之间，是专为生命科学研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光，四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用。

3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍 Beckman-Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile（早期，现已停产）和EPICS系列为代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式细胞仪，目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号，其中ALTRA具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小，可自动进行5种颜色的分析，适用于免疫学检测，如人类HIV诊断。特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板。特别适合工作量大的实验室。

这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产，其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域，如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵，我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构。

3．3 Partec公司流式细胞仪介绍 与BD和Becman-Coutler公司的产品相比，德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小，造价低，易操作，便于携带，适合植物学研究，适合边远地区和发展中国家。德国Partec公司的产品分为三类：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产品，已停产）。CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I。它是单或双参数的台式小型机，可以进行一些常规分析，如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）、细胞计数、细胞凋亡。它的特点是体积小，易操作，价格低，检测范围广，可以检测多种荧光素（如PI、DAPI、Fluorescein）发出的荧光。PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III（PAS-III）和倍性分析仪PA-II。提供三种激光器的三种组合，可检测十余种荧光染料。最多可检测和记录八个独立荧光参数。倍性分析仪PA能够在2分钟内自动测量植物的倍性水平，检测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物中，异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体。PA-I使用HBO-100汞灯，属于弧光灯，可产生紫外激发光和蓝光。PA-II中增加了488nm氩离子激光器，能够检测几乎所有的荧光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞灯发光是电流经过气体时，气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。

CyFlow（R）SL配备三种激光管，可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究。如HIV扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用l2 V直流电，特别适合边远地区和发展中国家。

国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中（Galbraith，1983），众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法（Michaelson，1991）。应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、检测体细胞杂种（Pfosser，1995；Keller，1996）和游离小孢子培养再生株（Kim，2003）的DNA含量。过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几，且大多是在国外实验室完成的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品，也有少量是BD公司生产的流式细胞仪。BD公司的产品主要定位于医学研究与应用，与Partec产品相比，不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂，数据获取软件可同时检测到的倍性数目少。鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪，在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。

如何选择流式细胞仪

自七十年代出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。

流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。⑴、DNA倍体分析

DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。

流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。⑵、细胞生存能力实验

使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同，染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。

流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片。⑶、计数外周血中检测网织红细胞

使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统。

⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定

使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验

检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⑹、血小板自身抗体检测

血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。⑺、移植交叉配型

原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应

淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片。⑼、检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）

未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下，活化分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，如细胞因子分泌到细胞外则检测不到，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞，因此存在着用CD4来设定细胞群的问题。我们知道CD4不但在T 细胞上表达，还在所有的单核细胞上表达，因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来。那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢？回答是否定的。因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调，甚至完全丧失，所以不适合于设门。用CD3和CD8设门，因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞，因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。FITC标记CD8，PE标记IL-4和，PE-CY5标记IFN-r，APC或PE-CY7标记CD3。

流式细胞仪要求：488nm或633nm（仅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm滤光片。⑽、细胞增殖状态检测

核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。

流式细胞仪要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⑾、染色体分析

流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。

流式细胞仪要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm滤光片。⑿、BrdUrd标记追踪细胞分化

通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G1、S、G2、M期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。⒀、淋巴细胞亚群分析

外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片，液量绝对计数系统。⒁、白血病免疫分型

CD45设门三色白血病免疫分型。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。⒂、血小板分析

血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。⒃、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测

根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。T系白血病微小残留病灶检测

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。B系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。

髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。

⒄、细胞凋亡分析

DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。⒅、肿瘤耐药分析

P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⒆、强直性脊柱炎诊断

检测淋巴细胞B27表达强度及百分比，诊断强直性脊柱炎。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⒇、PNH诊断

外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD55、CD59表达强度或百分比，确诊夜间阵发性血红蛋白尿。

篇3：高校流式细胞仪使用效益分析

流式细胞仪(Flow Cytometer)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器。它以流式细胞术为理论基础,集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体[1,2,3],具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点[4,5,6],被广泛应用于生物学、临床医学、遗传学、免疫学、药物学等众多研究领域。通过CNKI数据库检索统计,近十年来共收录以“流式细胞仪”为关键字的论文约为15万篇。

流式细胞仪属于大型贵重仪器设备,专业性强且价格较高,单一高校拥有量偏少。因此本文选取本地区部分高校10台流式细胞仪,对其使用现状和存在的问题进行分析,通过搜集并研究样本数据,有针对性地提出加强高校流式细胞仪使用效益的建议与意见。

1 流式细胞仪使用效益分析

大型仪器设备是一个复杂的投入产出系统,对设备的效益评价涉及到很多相关的指标,使用全部指标是不可能也是不现实的,实际效益评价只能选择部分指标进行评价[7]。因此本文选择年使用机时、承担科研项目数和发表论文数三项指标来对流式细胞仪进行使用效益分析。

1.1 年使用机时分析

根据教育部办法的《高等学校仪器设备管理办法》和《高等学校贵重仪器设备年度效益评价表》中,对03类和04类大型贵重仪器设备进行了规定,其中03类仪器仪表专用设备使用机时最低为800 h/年,通用设备使用机时最低为1400 h/年,04类机械类使用机时最低为800 h/年。流式细胞仪为07类,医疗设备类大型仪器设备,并未对其使用机时有明确规定。但地方教育主管部门和高校本身,一般以800 h/年作为衡量所有类型大型仪器设备使用机时是否合格的标准[8]。样本平均年使用机时数据,见表1。

由表1看出,样本流式细胞仪年使用机时均达到额定使用机时800 h要求,平均年使用机时为875 h。流式细胞仪在高校主要应用于科研中,其科研机时占总体比例88%,且样本中80%流式细胞仪的教学机占总机时数不足10%甚至为0。由此可见,流式细胞仪在高校集中应用于科研项目中,在教学使用及开放共享方面略有不足。

1.2 科研项目分析

大型仪器设备是重大科研项目研究与开发主体工具,其在科研成果中作用的大小,直接反应大型仪器设备的使用水平和效益[9]。样本年科研项目统计,见表2。

由表2可以看出,流式细胞仪所承担项目数差异较大。但从整体平均来看,其承担项目多为国家级项目及国家级重大项目,二者总和占总体科研项目的68%,而校局级项目数占总体最少,仅为8%。由此可见,流式细胞仪在高校所承担的科研项目较前端,但同时也应积极参与低级别项目的申请,以提高其使用效率。

1.3 发表论文分析

科研任务是高等学校的重要任务[10],因此,科学研究同样是评价大型仪器设备使用效益的重要指标之一,期刊发表论文数是科学研究成果主要表现。样本年均发表论文数统计,见表3。

由表3可以看出,应用流式细胞仪刊发的期刊中,高水平文章(三大检索论文)占总体的60%,但国内论文数仅占总体28%,且论文发表数量较少。这也说明了流式细胞仪在高校中的所参与的科研项目使用较前端,但国内普遍应用较少,同时,参与使用的教师与学生数量也略低。

2 提高高校流式细胞仪使用效益建议

2.1 提高流式细胞仪在教学中的使用

高校大型仪器设备对提高教师的教学科研水平以及学生的动手能力有很大帮助,因此人才培养是大型仪器设备使用效率评价重要组成部分。样本所有流式细胞仪虽然都满足额定800机时要求,但教学机时明显不足,仅占总体年使用机时的3%。由于流式细胞仪单体价格高,数量较少,满足师生普遍应用不现实,但可以通过增加实验演示课程,让更多的学生接触到这一先进性的大型仪器设备,并能有效的增加仪器设备的使用机时,从而提高流式细胞仪的使用效益。

2.2 扩大流式细胞仪使用范围

样本流式细胞仪在各自所承担的科研项目中,虽然级别较高,但数量明显不足。同样,在涉及流式细胞仪发表的期刊论文中,高水平文章比较较高,但数量同样明显不足。因此,扩大流式细胞仪的使用范围,不应局限于某一课题组或某一教研室,充分挖掘流式细胞仪潜在作用,以提高其使用效益。

2.3 加强流式细胞仪的开放共享

高等院校大型仪器设备开放共享,是实现资源优化,避免闲置浪费的重要途径。目前国家正加大推动非涉密和无特殊限制的大型仪器设备向社会开放使用。样本流式细胞仪的其他机时仅占总机时的9%,且70%的流式细胞仪并无开放共享。因此,加强流式细胞仪的开放共享,亦是充分发挥其使用价值,提高其使用效益的重要途径。

3 结语

所调研的样本流式细胞仪,90%均为医科院校所有,涉及专业有免疫、肿瘤、临床检验诊断和流行病与卫生统计等,而流式细胞仪应用范围不应仅局限于此。本文通过对流式细胞仪的使用情况研究,就目前存在问题提出建议与意见,以提高各高校相关人员对流式细胞仪在科研和教学中使用的重视程度,扩大其使用范围,探索其使用功能。

参考文献

[1]周丽,周振英.流式细胞仪研制的技术进展[J].分子诊断与治疗杂志,2003,15(1):11-17.

[2]李娟,王静.流式细胞仪在医学检验中的应用[J].中国实用医药,2010,5(36):101-102.

[3]王敬春,苗术,黄海涛.流式细胞仪在细胞凋亡检测中的应用[J].齐齐哈尔医学院学报,2007,(8):970-971.

[4]王秀丽,范乃军,赵光,等.流式细胞术在临床肿瘤学中的应用[J].实用医药杂志,2012,29(5):464-466.

[5]马莉,顾健,吴蔚,等.BD Calibur流式细胞仪维护方法与技巧[J].中国医学装备,2013,(12):128-129.

[6]农乐根.流式细胞术的工作原理及临床应用[J].右江医学,2005,33(3):301-303.

[7]满杰.高校国家重点实验室管理模式与运行机制的探讨[J].科技管理研究,1999,(3):20-21.

[8]阎冰,张小蒙,刘彦强,等.高校不同分类的大型仪器设备使用效益分析[J].中国现代教育装备,2015,(9):4-6.

[9]汪明东.构建效益评价指标体系,提高仪器设备效益[J].中国现代教育装备,2007,(8):107-110.

篇4：流式细胞仪检测技术与质量控制

【摘要】流式細胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。

【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制

流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。

2 检测方法

2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。

2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。

3 方法学评价 该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。

4 讨论

流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。

标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对于只作胞内染色的样本，根据待分析细胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。

流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性等[2]。仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞仪质控中的一种常用的标准品。

精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。但细胞周期和倍体分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小于2%。灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数（MESF）法。该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球组成（包括未标记荧光的空白微球），表明该微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪灵敏度的回归曲线，回归曲线与Y轴的交点即为该机的灵敏度，或叫做最低检测限度[3]。准确度及其校准流式细胞仪的准确度同精密度和灵敏度相比不很重要，但随着定量流式细胞技术的发展和荧光定量分析在实际工作中的需求越来越大，流式细胞仪准确度的评价和质控品也开始受到重视，在样品中加入内标或某些生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞，可对仪器准确度进行有效监测。当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过调整荧光补偿，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果的可靠性。荧光补偿是流式细胞术多色分析前必须进行的仪器校准，通常采用每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色，来进行仪器补偿调整，也可以通过商品化荧光补偿试剂进行。当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，Levey-Jennings质控图是目前在临床检验质量控制中使用较多的方法，根据Levey-Jennings质控图的评价要点来观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，自2000年以来，我国由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评工作，现已开展的项目包括T细胞亚群分析和CD34绝对计数。

【参考文献】

[1] 崔巍，牛福玲，何丽云，王硕仁.流式细胞术检测细胞凋亡的分析软件比较.北京中医药大学学报.2001.（6）45-47

[2] 陶德定；冷彦；覃吉超；余源；龚建平.新鲜肿瘤标本活细胞与固定细胞的DNA含量分析比较.癌症：英文版.200120（5）：502-504

篇5：流式细胞仪大学课件

本指导原则旨为注册申请人准备及撰写流式细胞仪配套用检测试剂注册申报资料提供指导，同时也为技术审评部门对注册申报资料进行技术审评提供参考。

本指导原则是对流式细胞仪配套用检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

二、范围

本指导原则中“流式细胞仪配套用检测试剂”是指标记有特定发光物质（如荧光素、量子点等）、针对各类血细胞或组织细胞分化抗原的单克隆抗体试剂以及相关 的质控品和校准品，这些抗体与血细胞或组织细胞的各类抗原分子特异性结合，与适用的流式细胞仪配套使用，对人血液、骨髓液或其它体液组织标本中的被标记细 胞或分子进行分类和计数。由于多方面差异，本文内容将不包括预期用途为利用流式细胞术进行特异性目的细胞分选的检测试剂。

本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

三、注册申报要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办 法（试行）》（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料形式与基本要求》（国食药监械[2007]609号）的相关要求。

流式细胞分析是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析的检测手段，可以在短时内高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞测得多个参数。流 式细胞分析主要靠流式细胞仪和各种特定发光物质标记的单克隆抗体试剂组合检测来实现。流式细胞仪是集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论等技术原理 于一体进行流式细胞分析的仪器，其工作原理为：将待测细胞或微粒进行特异性染色标记后制成细胞悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细 胞或微粒的缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液喷出，包绕着细胞或微粒高速流动形成圆形流束（鞘流），依次通过流式细胞仪的检测区域。被荧光染色的细胞在激光束 的照射下产生散射光和激发荧光。前向散射光（forward scatter,FSC）和侧向散射光（side scatter,SSC）检测器把散射光信号转换成电信号，荧光则被聚光器收集，不同颜色荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增管（PMT）检测器，把荧光 信号转换成电信号。散射光信号和荧光信号经过放大后，再经过数据化处理输入电脑并储存，根据散射光和荧光信号对细胞或微利进行分类或计数。其中，FSC反 映了细胞体积的大小，SSC则反应细胞部分结构的信息；荧光信号强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度。临床流式细胞分析是将流 式细胞分析技术与方法应用于临床医学，与临床疾病的诊断、分型、治疗、预后及预防等相结合的综合应用学科。其应用范围广泛，包括细胞生物学、血液免疫学、肿瘤学、感染性疾病、造血干细胞移植、器官移植等多个方面。临床流式细胞分析要求实验人员对整个分析系统、各种相关实验技术和方法有深入理解和掌握，并能 对检测结果给予合理的医学解释。

（二）产品说明书

说明书承载了产品预期用途、实验操作方法、检测结果解释以及相关注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学 解释的重要依据，也是体外诊断试剂注册申报的重要文件之一。流式细胞仪检测专业性较强，对产品说明书的编制进行必要的指导显得更为重要。该类产品说明书除 对单克隆抗体试剂做必要的介绍外，还应对样本采集、样本处理及保存、仪器校准、检测质量控制、结果分析等相关步骤做详细描述，以保证分析结果的准确性和可 重复性。

产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性及完整 性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以 规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。结合相关法规要求及流式细胞分析的特性，下面对流式细胞仪配套用检测试剂说明书的重点内容作详细说 明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

1.【产品名称】

单色试剂通用名称建议采取以下命名方式：被检标志物名称+检测试剂盒（流式细胞仪法-荧光素）。多色试剂可以结合靶抗原、目标细胞或组织、荧光素及临床预期用途等信息综合判断。

2.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：

（1）适用的样本类型：如全血、骨髓液、组织细胞等，并明确对所需抗凝剂的要求。

（2）待测靶抗原的特征简介，如分子结构、分子量、产生和代谢主要途径、表达细胞等。

（3）与被检标志物相关的临床背景介绍、正常表达情况、异常表达的主要疾病、与其他抗原的共表达情况以及可能的医学解释等。

（4）强调：实验操作人员应接受过流式细胞仪检测的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备合理的生物安全防备设施及防护程序。

3.【主要组成成份】

（1）主要是对特定荧光素标记的单克隆抗体特征的描述，应包括抗体特异性（CD标志），杂交瘤细胞，免疫球蛋白特征（Ig链），纯化方式，荧光激发及发射波长，偶联的荧光素，抗体浓度以及其他非抗体成分组成及浓度。

（2）如包括多种不同荧光素标记的单克隆抗体，则应对不同的抗体分别列表详述上述特征。

（3）建议将实验需要但本试剂盒未提供的主要成分进行列举：如与之配套使用的红细胞溶解试剂，稀释剂，细胞/血球计数仪等。

4.【储存条件及有效期】

试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、运输稳定性等。以及当试剂表面变化或变质时情况的描述及相关警示。

5.【样本要求】

样本采集和处理的目标是获得均匀的单细胞悬液，同时必须尽量保证细胞的活力和完整性，防止目标细胞的损失。样本操作不宜过度，避免对细胞结构和抗原性造成破坏。故对于流式细胞分析而言，样本处理对实验结果至关重要，应尽量减少由于样本采集或处理不当对实验造成的影响。

在产品说明书中应重点对以下内容予以明确：

（1）所需的样本量、采样方法（对抗凝剂或抗凝管的要求）及样本采集的注意事项，尽量引述相关标准操作规程。

（2）样本处理：溶血洗涤（或非洗涤）、细胞分离和提纯描述、离心和固定等方法；样本保存、转运的条件和方法。

（3）染色前稳定性：即采样后在合理的保存条件下，多长时间内必须进行抗体标记（染色）；如果不同抗凝剂样本的稳定时间有差异，则应分别进行阐述。

（4）染色后稳定性：即样本在完成抗体标记后至上机分析前可以稳定保存的条件及期限。最好结合染色前稳定性的要求对上机分析前的稳定性进行综合评价。

（5）避免使用的样本类型，如有微生物污染、乳糜、凝集或细胞活力不达标准等，在一般情况下应避免使用上述样本，除非样本有不可替代性，则应说明处理该种样本的方法，并应在结果报告时明示。

（6）达到最佳染色效果所要求的目标细胞计数。①尽量采用公认的国际或国内标准操作方法进行细胞计数，保证计数准确性；②详述计数与预期不符时应采取的处理方法（浓缩或稀释等）；③提醒实验操作人员细胞计数的注意事项。

（7）样本活力要求及评估方法：为避免非活性细胞的非特异性结合，应评估细胞活性并设定有活力细胞的百分比下限，并推荐相关的有活力细胞评估方法。

（8）优化为最佳染色效果所需注意的重要信息；其他有关样本采集、处理及保存的注意事项。

6.【适用机型】所有适用的仪器型号，如对配套用软件有要求也应做特别说明，并提供与仪器或软件有关的重要信息以指导用户操作。

7.【检验方法】对于流式细胞分析而言，实验操作步骤对实验结果的影响至关重要，因此，应详细说明达到最佳染色效果的实验操作各个步骤，包括：

（1）试剂使用条件：温度/湿度条件、试剂用量、染色时间、是否需无菌操作等。

（2）简述试验开始前流式细胞仪的设置方法，校准及质控程序。

（3）详细阐述试验操作步骤、注意事项。如对照的设定方式及类别（同型阴性对照、阳性对照、正常人血细胞对照等），设门方法举例及代表性数据图示；靶细胞分类计数的方法及步骤、计算公式以及相关注意事项。

（4）校准：适用校准品的生产企业、产品名称及货号等详细信息，校准品的使用方法、推荐的校准周期及相关注意事项。

（5）质量控制：适用质控品的生产企业、产品名称及货号等详细信息，质控品的使用方法、对质控结果的必要解释以及推荐的质控周期等；建议在本部分注明以下字样：如果质控结果与预期不符，提示检测结果不可靠，不应出具检测报告。如质控不合格应提供相关的解决方案。

8.【参考值（参考范围）】

应注明待测标记细胞或分子在常用样本类型的正常参考值（范围），简单介绍设定该参考值（范围）所选健康人群的特征，如有必要，需对不同年龄段人群、不同性别或具有明确地理差异人群的参考值分别进行详述。

建议注明以下字样“由于地理、人种、性别及年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考值（范围）”。

9.【检验结果的解释】

由于流式细胞仪分析技术的专业性较强，检测过程中的影响因素较多且同一分析目标在不同人群的表达复杂多样，因此，流式细胞检测的数据分析、结果解释和出 具临床报告经常具有较大的挑战性，结果解释不当可能对病人的诊治造成很大影响。建议负责数据解释和出具报告的实验人员需经过正规的技术培训且有一定的临床 经验，二者结合有助于对实验数据做出合理的医学解释。

产品说明书中的本部分内容应对上述情况进行必要的建议，还应对设门方法、数据分析、异常值处理、临床相关提示等内容做出合理解释。

10.【检验方法局限性】

（1）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

（2）使用该试剂的其他限制，如样本、保存方法、保存时间，特殊患者可能出现的不正确结果，仪器设置不当的影响等。

（3）是否与经其他试剂或仪器获得的同类数据具直接可比性。

11.【产品性能指标】 详述以下性能指标：

（1）精密度：简要说明精密度评价的方法，建议以列表的方式列出批内/批间、日内/日间、运行内/运行间精密度等信息，以标准差（SD）和变异系数（CV）的形式表示精密度研究结果。

（2）线性：包括细胞计数浓度范围和待测目标物阳性细胞百分比浓度范围两类，申请人应至少对其中一个进行合理验证并在此列出，简要注明实验方法、所用仪器及软件等信息。

（3）对比试验研究：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果、图示。

（4）分析特异性：有关交叉反应和干扰因素的验证信息。如：对溶血、高脂、黄疸等内源性干扰因子的浓度限值要求（如有必要），样本中可能存在某些内生物 质与待测抗原有相似化学结构或抗原表位，如自身抗体、蛋白、激素或近期服用的某些药物（如生物制剂），这些物质可能与试剂中的单克隆抗体发生交叉反应而影 响检测结果，如未进行相关研究也应提供相关警示说明。

12.【注意事项】应至少包括以下内容：

（1）生物安全性警告：接触到的临床样本、质控/校准品、实验废弃物等材料应当作为潜在传染物进行处理，并且采用符合法规的预防措施对其处理。

（2）有关仪器设置的警示，如：流式细胞仪未经正确校准、荧光渗漏未行合理补偿以及检测区域（设门）未精确定位，则可能产生错误的检测结果。

（3）有关试剂准备的注意事项：如冷藏避光保存、切勿冷冻、使用前恢复室温等

（4）针对某些白细胞浓度过高或过低的情况，在样本处理时需采用的特殊处理方式，如血样稀释或细胞浓缩等操作。

（5）试剂特殊成分或操作使用试剂危害性的警告及注意事项：如叠氮化钠、甲醛等；使用不当的处理方式

（6）保证试验结果准确的其他操作注意事项。

（三）拟定产品标准及编制说明

拟定产品标准应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》的相关规定。另外，对于国产第三类体外诊断试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。

该类产品注册检测的技术要求主要包括：准确度、线性、精密度、染色稳定性等相关指标，具体要求的设置应参考相关的国家/行业标准（如有）执行，企业标准要求不得低于国家/行业标准要求。

（四）注册检测

对于首次注册产品，申请人拟定申报产品的产品标准后，应当在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续3个生产批次样品的注册检测。

对于已经有国家参考品的流式细胞检测项目，在注册检测时应采用相应的国家参考品进行,对于目前尚无国家参考品的项目，生产企业应建立自己的质控体系并提供相应的内部参考品。

（五）主要原材料研究资料

应提供主要原材料如单克隆抗体、标记荧光素的选择、来源、制备过程、质量标准和质检报告等研究资料。若主要原材料为企业自行生产，则应详述原材料（主要 是单克隆抗体）的制备及生产过程、杂交瘤细胞的选择、技术指标、质量控制、国际相关权威机构（如国际人类白细胞分化抗原协作组织，HLDA）的认证情况（如有）等；如主要原材料来自外购，则应详述抗体的名称及生物学来源，外购方名称，提交外购方出具的有关单克隆抗体后杂交瘤细胞的性能分析或检验证书，详 述申请人对该抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。对荧光染色方法、染料选择依据，多色标记中荧光的交叉重叠验证等研究。

（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料

1、生产工艺的研究资料主要包含：

（1）主要生产工艺介绍，可以图表方式（工艺流程图）表示。

（2）生产工艺中关键步骤的质量控制要求及质控方法。

（3）生产工艺的确定资料，如：生产工艺的选择依据，生产工艺的优化过程及方法等。

2、反应体系的研究资料主要包含：

（1）反应原理介绍。

（2）产品说明书中描述的最佳反应条件各步骤的确定方法，包括需要的样本体积、样本的处理、保存时间，反应时间、温度的确定、抗体的用量（重要）、是否需反向加样、溶血/洗涤操作、去除干扰等。

（3）如产品说明书中使用了其他前处理试剂或流式细胞仪、仪器设定方法、或分析软件等达到最佳反应条件，则应将使用这些试剂或仪器的研究内容包含至该项资料中。

（4）应说明配合该产品所使用的分析方法并进行验证，如不同平台方法、不同软件分析、操作注意事项等。

（5）不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。

（6）质量控制：同型阴性对照、正常成人样本对照、商业化阳性质控品、荧光信号与散射光结合对各细胞群的确认等。

（七）分析性能评估资料

企业应提交原厂在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每一项性能的评价，都应包括研究目的、实验设计、可接受标准、实验数据、统计 方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、所用软件、临床样本来源等。对用于多色流式细 胞分析的试剂（如CD3/CD4/CD8淋巴细胞亚群检测试剂），其待测每个指标（如CD3、CD4和CD8三个指标）的所有分析性能均应分别进行相关的 验证。分析性能评价的实验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。

1.准确度

对测量准确度的评价主要包括：与国家标准品（和/或国际标准品）的偏差分析和方法学比对两种方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。

（1）国家（国际）标准品的检测及偏倚情况

如果研究项目有相应国家（国际）标准品，则使用国家（国际）标准品进行验证，重点观察对相应标准品检测结果的偏差情况。

（2）方法学比对

采用国内/国际普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏 倚。如偏倚很小或在允许的误差范围内，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结 果。

在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本采集及处理的差异、浓度分布范围及不同浓度范围的可接受标准及合理的统计学分析等要素。

2.精密度：

精密度是指在规定的检测条件下，相互独立的测试结果间的一致程度，本类试剂的精密度评价主要考虑细胞计数结果和荧光强度两方面。建议采用多个水平的质控 品用于细胞计数精密度的评价，各个浓度均应在试剂盒的线性范围内且有一定的临床意义（医学决定水平），通常包括该检测指标的正常范围、异常低值和高值样 本。对于质控品或校准品的精密度评价，应包括其所有质控或校准项目，如荧光信号及散射光要求等。

在进行精密度评价时，除申报试剂本身的影响外，还应对操作者、适用机型、不同软件及实验地点等要素进行相关的验证。企业应制定合理的精密度评价方案，例 如：在每个适用机型上进行至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整运行，每天内两次运行间的时间间隔不少于3小时，从而对批内/批间、日间、运行内/运行间、不同操作者间的精密度以及各变量综合的总精密度进行评价。除精密度质控品外，建议选择适量临床采集的新鲜病人样本（包括所有适用样 本类型）作为无靶值质控品进行精密度评价，以更好地模仿临床检测环境。

3.线性范围：

本类产品线性主要包括稀释细胞浓度范围和标记抗体阳性细胞的百分率范围两种线性范围。企业可根据实际需要及以往的研究习惯自行选择其中一种对线性的要求 进行验证。企业应对每个测量参数建立合理的线性范围，在建立一个参数的线性范围时，应该尽量将预期测定范围加宽，在合理范围内选择7-11个浓度水平，每 个水平2-4份复制液，取每个浓度水平重复测量的均值用于线性回归分析，依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出最宽的线性范围，拟合回归直线的判定系数（R2）应大于0.95。

建立稀释细胞浓度线性范围时，所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，建议采用混合血浆或自体血浆进行稀释，同时应考虑多倍稀释可能造成的基 质效应。对于标记抗体阳性细胞百分率的线性范围，建议企业选择经确认的阳性细胞株和阴性细胞株按照恒定的细胞总数将两种细胞进行不同比率的混合，阳性细胞 数与阴性细胞数比例可以从0%到100%不等，从而确认合理的有关阳性细胞百分率的线性范围。

4．特异性：

（1）采用多种方法对申报抗体与靶抗原结合的特异性验证研究，如采用竞争性抑制法、抗体与抗原纯品的结合研究、免疫印迹技术或胞膜抗原的基因转染技术等 方法对抗原抗体结合的特异性进行相关的验证；有关靶抗原的细胞或组织分布特异性的研究，如抗体与不同细胞系的反应谱等。

（2）交叉反应性：验证所申报单克隆抗体除与目标抗原的结合外，是否与样本中可能存在其它内生或外源物质发生交叉反应，如与待测抗原有相似化学结构或抗原表位的蛋白、激素或近期服用的某些药物等。

（3）干扰：本处所指的干扰是指经过生产商指定的样本处理方法后，检测时是否还存在其他影响结果干扰因素或干扰物质。如有，生产商应进行说明并验证，使 用医学相关水平的干扰物浓度进行验证，另外，亦建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行评价。

（八）参考值（范围）确定资料

应详细描述用于参考值（范围）确定健康人群的地域、年龄、性别等特征，并对统计分析方法进行详细解释。可以参考国内或国际有关参考值（范围）制定的指南文件推荐的方法进行。不同种族、年龄或性别人群如有明显差异应分别进行相关的统计分析并设置不同的参考值（范围）。

（九）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、高温加速破坏稳定性、运输稳定性以及 开瓶稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

样本稳定性主要考虑染色前和染色后稳定性，前者是指样本采集后至染色（标记）前的稳定性，后者是指染色（标记）后到上机分析前的稳定性。样本染色前、染 色后稳定性需结合试剂的稳定性研究综合进行考虑。可以在合理的温度范围内选择多个时间点（应至少包括范围的上限和下限温度），每间隔一定的时间段对采集样 本或标记后样本进行全性能的分析验证，从而确认样本染色前和染色后的合理保存条件和有效期。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（十）临床试验研究

1.样本例数

考虑到流式细胞仪配套用检测试剂种类繁多、临床用途广泛但主要原料、生产工艺及检测原理等非常相似的特点，该类试剂临床试验研究的总样本数为不少于500例。

2.临床研究单位的选择

流式细胞仪配套用检测试剂的临床研究应在三家以上（含三家）省级医疗卫生单位进行，对于特殊使用目的产品可以在相应的市级以上专科医院或其它诊疗机构开 展临床研究。建议在国内不同城市选择临床单位，尽量使各单位的临床样本有一定地域代表性；临床研究单位须具有流式细胞仪专业的技术人员及相应的仪器设备，确保该项研究的实施。实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和参比试 剂都应处于有效的质量控制下，定期对仪器进行校准，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。流式细胞仪检测的专业性较强，实验操作人员须接受过流式细胞 仪技术的专业培训，并经过考核合格后上岗，具备实验室检测和临床病情相结合的流式细胞仪相关的检测经验，3.研究方法

（1）境内已有同类试剂批准上市产品的临床研究：

选择中国境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对照试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明考核试剂与已上市产品等效或优于已上市产品。

（2）境内尚无同类试剂批准上市的产品临床研究：

可以选择国外已上市、普遍认为质量较好的同类产品作为对照试剂，采用考核试剂与之进行对比试验研究，证明本品与对照试剂等效或优于对照试剂。同时，还应 结合每个患者的临床病情对申报试剂的检测结果进行综合判断，如有必要，需对研究对象进行相关的跟踪监测研究，以综合判断申报试剂的检测结果，验证其与临床 病情的一致性。

4.试验方案

临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确 说明原因。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。

5.临床病例选择

绝大多数采用流式细胞仪方法检测的血细胞或组织细胞抗原对于疾病诊断的灵敏度和特异性较低，与器官/组织定位、疾病良恶性区分以及与病情的进展程度虽有 一定关联但多无明确的量值-病情相关关系，而且，多数情况下，该类试剂在用于病变的诊疗时需要多个标记物组合检测才能体现其临床意义。因此，在进行临床研 究时，除有针对性选择目的性较强的病例外，还应选择部分其他相关的抗原表达类似或需鉴别诊断的病例。

临床研究试验中应包括对部分来自正常健康人群的样本作为正常对照。验证试剂的正常参考值（范围），比较正常组和疾病组结果，以便对申报产品的临床性能做 出全面分析。建议对健康人群例数的选择以不超过50例为宜。对于新试剂或临床意义有待明确的试剂，可适当增加正常样本数。不管是健康人群或不同病种的患 者，每一组受试者的最小入选人数均须满足统计学分析的基本要求。

6.结果差异样本的验证

在数据收集过程中，对于两种试剂的检测结果有明显差异的样本，应采用临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂或其他标准方法进行验证试验，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

7.统计方法：对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、ROC曲线分析等。对于对比实验的等效性研究，最常用是对实验试剂和 对照试剂的两组检测结果的相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（r值）或判定系数（R2）、回归方程斜率及y轴截距等指标。在临床研究方案中应明确统 计检验假设，即评价实验试剂与对照试剂是否等效的标准。

8.临床试验结果报告

根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。

（1）临床试验总体设计及方案描述

①临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍；

②病例纳入/排除标准、不同病种的预期选择例数及健康人群的选择标准；

③样本类型，样本的收集、处理及保存等；

④统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。

（2）具体的临床试验情况

①考核试剂和参比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息；

②对各研究单位的病例数、病种分布情况进行总合，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比；

③质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况，对检测精密度、质控品回收（或测量值）、抽查结果评估；

④具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。

（3）统计学分析

①数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。

②相关性和一致性分析

用回归分析验证两种试剂结果的相关性，以y=a+bx和R2的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是参比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R2是判定系数，同时应给出b的95%（或99%）置信区间，定量值结果应无明显统计学差异。

另外考虑到某些检测指标在不同的样本浓度区间、不同年龄段人群或不同疾病来源的样本可能有较明显的差异，因此，如有必要，建议以上述相关要素为依据分组并对各组数据分别进行统计分析，以更好的验证两种试剂的相关性。

（4）讨论和结论

对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。

四、名词解释

1.准确度（accuracy）：一个测量值与可接受的参考值间的一致程度。

2.精密度（precision）：在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。

3.线性（linearity）：在给定测量范围内，给出的测量结果与样品中实际存在的被测量物的值成比例的能力。线性是描述一个测量系统的测量示值或测量结果相关于样本的赋值符合直线的属性。

4.分析特异性（analytical Specificity）：测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估 的潜在干扰物清单来描述，并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度（潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物）。

五、参考文献：

1.《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械[2007]229号）

2.《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械[2007]240号）

3.《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国食药监械[2007]240号）

4.NCCLS EP9-A2：Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples;Approved Guideline-Second Edition(September 2002).5.NCCLS EP5-A2:E, valuation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices;Approved Guideline-Second Edition(August 2004).6.NCCLS EP6-A: Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach;Approved Guideline.7.H20-A2:Reference Leukocyt(WBC)Differential Count(Proportional)and Evaluation of Instrumental Methods;Approved Standard—Second Edition.8.H42-A2:Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry;Approved Guideline—Second Edition.9.H43-A2:Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells: Approved Guideline—Second Edition.10.H44-A2: Methods for Reticulocyte Counting(Automated Blood Cell Counters, Flow Cytometry, and Supravital Dyes);Approved Guideline—Second Edition.11.H52-A: Fetal Red Cell Detection;Approved Guideline.12.ILA26-A: Performance of Single Cell Immune Response Assays;A pproved Guideline.13.王建中：《临床流式细胞分析》，上海科学技术文献出版社

14.杜立颖，冯任青：《流式细胞术》，北京大学出版社

15.冯仁丰，《临床检验质量管理技术基础》（第二版），上海科学技术文献出版社

篇6：高端流式细胞分选仪的选型评价

本文着重介绍高端流式细胞仪的选型评价,以便为设备的购置提供技术评估和参考依据。

1 工作原理(见图1)

一束激光聚焦的液流束上,若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点,当每个悬浮液滴颗粒通过光束时,会按某种方式把光散射,同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光,对检测器检测的散射光和荧光被充电的液滴中的细胞在通过高压静电偏转板时收集到指定的容器中。这样,就实现了细胞的定量分析与分选。

2 选型技术评价

2.1 构成与功能

流式细胞仪主要由液流系统、激发光器件、信号检测系统和控制系统构成。

具体工作过程是:将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室;在鞘液的约束下,细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱,后者与入射的激光束垂直相交,液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号,计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号,对各种指标做出统计分析[1,2]。

具有细胞分选功能的流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选,它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体,可以产生高频振荡,使液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷,当带电液滴通过电场时,便会在电场的作用下发生偏转,然后落入相应的收集器中,从而实现细胞的分选[3]。

目前,流式细胞分选仪已广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学、药物开发等医学研究和临床工作中。现代高端流式细胞仪每秒可以实时检测定量分析、分选数万个细胞,仪器可选用3~9根激光管,最多可检测18个荧光参数,以满足多种科学研究的需要。

2.2 技术参数

2.2.1 荧光检测灵敏度

灵敏度反映仪器能够检测到最弱的荧光信号,直接决定待检测指标能否被检测出。灵敏度的高低是衡量一台仪器性能最重要的指标之一,其主要与细胞(或被测物体)被激光照射的效率和荧光接受的效率有关。一般测出单个细胞上<600个荧光分子、2个细胞间的荧光差>5%即可区分。

2.2.2 流式细胞仪的分辨率

分辨率通常用变异系数CV值来表示,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

2.2.3 前向角散射光检测灵敏度

前向角散射(forward scatter,FSC)反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.1~0.5μm。

2.2.4 分析速度/分选速度

分析/分选速度是指仪器每秒钟可分析/分选的数目。一般分析速度为5 000~10 000 cell/s,分选速度应掌握在1 000cell/s以下。分选速度是流式细胞仪一个重要的性能指标,分选速度的高低受实际样本和振荡频率的限制。

2.2.5 分选纯度和回收率

分选纯度和回收率是评价流式细胞仪工作性能的又一重要指标,彼此相互影响和制约。若要保证回收率,则分析速度下降;若要提高分析速度和分选速度,则需要更改相应的分选模式来保证回收率,则分选纯度变低;若分选模式选纯度,则回收率很低。因此,选购仪器时需要综合考虑这2个指标,把分选纯度和回收率综合到一个最佳的状态。

2.2.6 液滴振荡频率

振荡频率主要影响液滴形成的速度和效率,直接影响分选速度。一般来说,70 000 cell/s的分选速度是保持细胞活性理论最高分选速度,再高的振荡频率也无太大意义。

2.2.7 激光器配置

激光器是流式细胞仪的一个核心部件。

激光器配置的个数以及可同时检测的激光数会大大影响流式细胞仪的工作性能。激光器的功率大小和激发模式均可自由选择。

3 流式细胞分选仪的选型比较

目前,流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现全球生产流式细胞仪的厂商至少有6家,各厂商产品又有不同的系列,各具特色。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型,我们应以应用和自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。

现将目前市面上流行的2类高端流式细胞仪的3种主要机型的主要性能参数比较列举如下,见表1。

从表1我们可以看出,3种机型在荧光检测灵敏度、前向角散射(FSC)光检测灵敏度、回收率等指标的差别并不大,在激光器的数量和配置、喷嘴种类、光学检测参数的个数上各有千秋,主要区别有以下3点:

(1)对于流式细胞仪而言,其对细胞获取的速度与实际上细胞流过的速度并不一致,主要与仪器的信号处理系统的运算频率和细胞信号宽度有关。如果细胞不能被分析到,就不能被分选到。Mo Flo XDP的信号处理系统与细胞分析的效率达到32 bit、100 MHz,而其他2种只能达到16 bit、10 MHz。同时,Aria II在分析速度为70 000 cell/s时,丢失细胞占实际通过的细胞的75%;Mo Flo XDP在分析速度为100 000 cell/s时,开始有丢失;在150 000 cell/s时,丢失20%的细胞。以上分析说明Mo Flo XDP能从样本中分析更多的细胞,效率更高。

注:1 psi≈6.89 k Pa

(2)液滴延迟时间的准确是分选准确的关键。Mo Flo XDP液滴形成速度为20万个/s,KInflux液滴形成速度为18万个/s,Aria II液滴形成速度为10万个/s,说明Mo Flo XDP能兼容的分选细胞的速度最快。

(3)对于激发方式的选择,3种型号各有不同:(1)Mo Flo XDP/In Flux采用空气中激发和分选,液流更稳定,能在高速情况下准确在液滴延迟时间内到达。(2)Aria II/SORP采用石英杯激发,空气中分选,细胞需要通过不同的介质,且速度不一样,高速下细胞密度变大,与流动池和喷嘴接触面变大,不能保证在液滴延迟时间内到达。此外,当Aria II/SORP安装375 nm和UV激光时,必须将激光位置改为空气中激发,以避免光纤破坏。(3)相比而言,Mo Flo XDP/In Flux分选更准确,更容易收集到完整的细胞,产量更高。

综上所述,Mo Flo XDP较其他2种机型综合性能更优,但选购时,要根据实际购买能力和使用需求选择性价比最高的高端流式细胞仪,提高设备的利用价值。

4 结语

随着科技的迅猛发展,流式细胞仪将成为高等院校在医学、药学和生物学等实验教学、科研的重要设备,在临床上会有更广泛、深入的应用前景[4,5]。高端流式细胞仪的选型应根据实际需求有所侧重,使采购选型的决策信息丰富、可信、科学。

摘要：介绍了高端流式细胞仪的工作原理、结构组成和主要技术评价指标,归纳并阐述了各主要技术指标的异同和含义,列举了Beckman CoulterMoFlo XDP、BD FACSAria Ⅲ和BD InFlux3种高端流式细胞分选仪主要机型的选型比较,指出了高端流式细胞仪的选型应根据实际需求有所侧重,使采购选型的决策信息丰富、可信、科学。

关键词：流式细胞分选仪,技术参数,选型评价

参考文献

[1]Grogan W M.Guide to flow cytometry methods[M].New York:Marcel DekkerInc,1990:1-20.

[2]沈二霞.流式细胞仪的原理和临床应用[J].现代医学仪器与应用,2008,20(1):49-53.

[3]王丹,王庆山,蔡殊,等.流式细胞仪的临床应用[J].中国冶金工业医学杂志,2007(z1):23-24.

[4]方清,曾晓军,徐鹰.流式细胞仪的原理和临床中的应用[J].中国医疗前沿:学术版,2008,3(10):84-85,91.