流式细胞技术及其应用

流式细胞技术及其应用（共6篇）

篇1：流式细胞技术及其应用

流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述

第二节 数据的显示与分析

第三节 流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节 流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点 ：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快： 5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节 概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能

一、工作原理 大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度

细胞活性

效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术 的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

（3）数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光 对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室

载玻片 检测信号 光学信号

形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号（FL）测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理（图示见上）

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

（二）FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节 数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

（五）流式细胞仪的多参数分析---------多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节 流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液；

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存： 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法（金属网引起细胞破碎）

深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶）

乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法 注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；

2、根据实验目的选择最隹的固定方法；

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质； 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等

常用的几类荧光染料

（二）免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合 共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

（一）单细胞悬液制备的质控

（二）免疫荧光染色的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）

温度 试剂选择

pH 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）

染料浓度 实体组织来源标本用机械法

固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2

（三）仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。

（四）免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）

-------（2）晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰

篇2：流式细胞技术及其应用

流式细胞仪在无脊椎动物细胞学研究中的应用

主要阐述了流式细胞仪在无脊椎动物血细胞分类、细胞免疫学、定量流式细胞分析、染色体核型分析、细胞核、细胞受体分析等研究中的.应用,供研究无脊椎动物的科技工作者参考.

作 者：沙爱龙 SHA Ai-long  作者单位：塔里木大学,动物科学学院,新疆,阿拉尔,843300 刊 名：北京联合大学学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF BEIJING UNION UNIVERSITY(NATURAL SCIENCES) 年，卷(期)： 23(2) 分类号：Q2 关键词：流式细胞仪   无脊椎动物   细胞学   应用  

篇3：流式细胞技术及其应用

1 流式细胞仪的结构及工作原理

流式细胞仪主要分为科研型(又称大型机、分析型)和临床型(又称小型机、台式机)两类,科研型的仪器功能齐全,分析灵活,但操作较繁琐,必须由经过培训的专业人员进行操作;临床型的仪器易于操作,稳定性好,分析速度快,适合在临床实验室中应用。流式细胞仪主要由以下五部分构成:(1)流动室及液流驱动系统;(2)激光光源及光束形成系统;(3)光学系统;(4)信号检测与存储、显示、分析系统;(5)细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射(FSC)光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。

流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液,经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入充满流动的鞘液;当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时,在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱经过激光聚焦区,与入射的激光束垂直相交,经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光;仪器中一系列光学系统,如透镜、光阑、滤片和检测器等,收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号;计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号,对各种指标做出统计分析[1]。

科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中包有细胞,而细胞特质是在进入液滴以前已经被测定了的,如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符,则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷,使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理,做更深入的研究。

2 流式细胞术的临床应用

2.1 在肿瘤学中的应用

流式细胞术在肿瘤学方面的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作[2]。恶性肿瘤的早期诊断是提高治愈和生存率的关键,良恶性肿瘤的鉴别诊断对于确定临床治疗方案具有决定性作用。迄今为止病理形态学诊断一直被视为肿瘤诊断的“金标准”,但由于某些肿瘤,特别在早期缺乏客观明确的诊断指标,不能提高诊断的正确率。

流式细胞术的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃,特别是用流式细胞术分析细胞DNA含量,分辨率高、精确度好,可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料,辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。癌前病变是指某些具有癌变潜能的病变,正确识别癌前病变对早期诊断和预防恶性肿癌具有重要的实际意义。然而临床上所谓癌前病变所包括的实际上是一大组生物学行为迥异的病变,其中一小部分具潜在癌变可能,而大部分完全是良性病变,因此要用病理形态学手段将其区别开来。只有那些不典型增生或称异型增生的上皮具癌变潜能,为了进一步区别不典型增生上皮癌变潜能的大小,通常根据其增生程度和形成表现将其分为I、II、III三级,分级越高,恶变可能性越大。DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。流式细胞术可精确定量DNA含量的改变,即检测出DNA非整倍体的出现,并将其作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志,从而对癌前病变的性质及发展趋势做出评估,有助于癌变的早期诊断[3]。其具体方法是先将实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,再用荧光染料(碘化吡啶P1)染色后对细胞的DNA含量进行分析,最后将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G0/G1期、S期、G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力证据[4]。有资料证实,癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系,增生程度越重,癌变发生率越高。

流式细胞术不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,在肿瘤化疗方面的意义尤为显著。临床工作人员可根据细胞周期各时相的分布情况,结合化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳治疗方案,再依照DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化,及时调整治疗方案,选取有效药物以使对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果[5,6,7,8]。

2.2 在免疫学中的应用

机体免疫状态是机体是否罹患疾病的重要指标,目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态,其中最重要的指标是T、B和NK淋巴细胞的水平。T细胞主要包括Th和Ts细胞亚群。CD3细胞代表外周血中总的成熟T细胞,理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和。但我们检测患者T细胞及其亚群时,往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3的情况。这是因为CD4+细胞其实包括两部分:CD3+/CD4+细胞(真正的Th细胞)和CD3-/CD4+细胞(非Th细胞);CD8细胞也包括两部分细胞:CD3+/CD8+细胞(真正Ts细胞)和CD3-/CD8+细胞(非Ts细胞)。而CD3-/CD8+细胞又可以分为两组:一组为CD3-/CD8+/CD(16+56)+细胞(即NK细胞的一部分);另一组为CD3-/CD8+/CD(16+56)-(一群未知细胞)。由此可见,真正的Th细胞是CD3+/CD4+细胞,真正Ts细胞是CD3+/CD8+细胞。若使用CD4或CD8单标单抗或CD4与CD8双标抗体来检测Th和Ts,而不用CD3抗体进行限定,测出的结果必然会偏离真实值。尤其当患者NK细胞明显增加时,会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞。因此,一定用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞,然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。

自然杀伤细胞(NK),又称裸细胞,因其表面没有类似T细胞和B细胞的表面标志。后来随着免疫力学的发展,发现了NK细胞的一些表面标志,如CD16、CD56等,但单用CD16和CD56的抗体无法正确鉴定出NK细胞,因此必须使用CD(16+56)抗体。这里还有一点必须引起足够重视,即NK细胞一定是CD3阴性表达细胞。所以CD3-/CD(16+56)+细胞才是真正的NK细胞。

B细胞的表面标志是CD19,理论上CD3-/CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但实际检测中,CD3+/CD19+细胞很少,可以忽略不计,所以CD19+细胞就是B淋巴细胞[9,10,11,12,13,14]。

利用抗原抗体特异性反应原理,将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作为荧光标记(荧光探针),这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合。当细胞被激光器发射的激光照射后,细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的继发荧光,带荧光探针的单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号,这就代表了细胞表面的抗原量。这些荧光通过流式细胞仪的识别和分辨,从而实现对细胞表面抗原的定量检测。细胞免疫反应一般分两种:直接免疫反应,即细胞表面抗原与带荧光探针的单克隆抗体特异结合的免疫反应;间接免疫反应,细胞表面的抗原与单克隆抗体结合,带荧光的第二抗体又与抗体结合,也使这个抗原-抗体复合物也带上荧光探针。

流式细胞术与单克隆抗体结合,对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得很大的进展,克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估有重要意义。通过检测各种免疫细胞的表面标志及细胞内各种细胞因子等,通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态,指导治疗。流式细胞术通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测[15]。此外,用流式细胞术检测红细胞、粒细胞抗体及血小板减少性疾病,均有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点[16]。

2.3 在血液学中的应用

流式细胞术通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析,对各种血液病的诊断、治疗和预后判断起到重要作用。流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体,借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表形参数对各种急性白血病的诊断和鉴别就起了举足轻重的作用。

流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面。目前国内外均主张采用FCM CD45/SSC双参数散点图设计方法进行白血病免疫分型,采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群,这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰,从而提高免疫分型的准确性[17]。

此外,流式细胞术在网织红细胞的测定及应用、血栓与止血中的应用、微小残留病灶(MRD)的检测等方面均有广泛的应用。

2.4 在其他方面的应用

随着近年来流式细胞术的发展以及与临床工作结合的紧密性日益加强,FCM已广泛应用于临床医学,通过对多药耐药基因、凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定、检测器官移植后血液或移植内免疫成分变化、与荧光染料联合应用判断细菌的活力和功能状态等方法,在细胞凋亡和多药耐药基因检测、器官移植、临床细菌学、细胞生物学、优生遗传领域等都得到了充分的应用,有着广阔的前景。

3 结语

流式细胞术以其分辨率高、分辨细胞数量大、参数多、准确性高、速度快等优点而广泛应用于生物医学研究中,并逐步成为医学临床检验领域中极具发展潜力的高技术平台。随着流式细胞分析技术与方法的迅速发展,流式细胞术在临床的应用范围也不断拓展,并将成为推动临床医学发展的重要手段之一。

摘要：流式细胞术是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。随着其分析技术和方法的日臻完善,流式细胞术在医学临床及科学研究上发挥了非常重要的作用。本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍,并对其在肿瘤学、血液学及免疫学等方面的临床应用进行了综述。

篇4：流式细胞术及其应用

关键词：流式细胞术；工作原理；临床应用

中图分类号：R197.39 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）10-0068-02

1 流式细胞仪的结构及工作原理

流式细胞仪主要分为科研型（又称大型机、分析型）和临床型（又称小型机、台式机）两类，科研型的仪器功能齐全，分析灵活，但操作较繁琐，必须由经过培训的专业人员进行操作；临床型的仪器易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室应用。流式细胞仪主要由以下五部分构成：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束形成系统；③光学系统；④信号检测与存储、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射（FSC）光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满流动的鞘液；当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时，在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱经过激光聚焦区，与入射的激光束垂直相交，经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光；仪器中一系列光学系统，如透镜、光阑、滤片和检测器等，收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号；计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中包有细胞，而细胞特征是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理，做更深入的研究。

2 临床应用

2.1 在肿瘤学中的应用

流式细胞术的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，特别是用流式细胞术分析细胞DNA含量，分辨率高、精确度好，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。癌前病变是指某些具有癌变潜能的病变，正确识别癌前病变对早期诊断和预防恶性肿癌具有重要的实际意义。有人发现流式细胞术检测肿瘤胸腔积液DNA指数、RNA指数、PCNA的流式细胞术检测结果对于恶性胸腔积液的诊断具有一定的价值，特别是对于部分细胞学检测阴性的恶性胸腔积液的诊断可能具有重要的临床意义。DNA、RNA同时检测对于诊断DNA正常而RNA发生异常改变的恶性胸腔积液具有重要价值，可以弥补单项DNA检测的不足。三者联合检测对于恶性胸腔积液的诊断价值大于单项或两项联合检测，具有较低的漏诊率和误诊率。有人通过研究发现流式细胞术可以准确地对细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达进行定性、定量、定位的分析，较为系统地反映了细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达特性和肿瘤的生物学特性。还有人发现流式细胞术可以提高颈淋巴结隐匿转移的检出率，与半连续切片HE染色法有差异，可以作为口腔鳞癌颈淋巴结隐匿转移的检测方法。隐匿转移与肿瘤原发灶部位、病理分级临床T分期无相关关系。有人应用流式细胞术检测35例多发性骨髓瘤患者的细胞表面的CD38、CD138、CD19、CD56、CD45、CD44抗原的表达情况，可以区分骨髓瘤和良性浆细胞，是多发性骨髓瘤的重要诊断依据。

2.2 在免疫学中的应用

流式细胞术与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得很大的进展，克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估有重要意义。此外，用流式细胞术检测红细胞、粒细胞抗体及血小板减少性疾病，均有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。有人对25例肺癌患者和30例健康人的外周血淋巴细胞亚群的水平检测分析发现肺癌患者CD3+、CD4+细胞及CD3+、CD4+/CD3+、CD8+比值较对照组显著减少，CD3+、CD8+显著增多，因此流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚型抗原表达可作为肿瘤患者免疫监测的手段。还有人应用流式细胞术检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体是自身免疫性中性粒细胞减少症实验简便、快捷的诊断方法，有助于自身免疫性中性粒细胞减少症的诊断、鉴别诊断和疗效判断。有人用钙离子荧光探针结合流失细胞术检测肉仔鸡肠道B淋巴细胞胞内Ca2+浓度，且二十五碳五烯酸（EPA）极显著降低了B细胞内的Ca2+浓度。此研究建立了肉仔鸡肠道B淋巴细胞胞内Ca2+浓度流式细胞术测定方法，为检测肉仔鸡肠道B淋巴细胞内其它离子成份奠定了基础。由此可以看出，流式细胞术正在逐渐的应用到畜禽中。

2.3 在血液学中的应用

流式细胞术通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、治疗和预后判断起到重要作用。流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别就起了举足轻重的作用。流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面。目前国内外均主张采用FCMCD45/SSC双参数散点图设计方法进行白血病免疫分型，采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰，从而提高免疫分型的准确性。此外，流式细胞术在网织红细胞的测定及应用、血栓与止血中的应用、微小残留病灶（MRD）的检测等方面均有广泛的应用。

2.4 在其他方面的应用

随着近年来流式细胞术的发展以及与临床工作结合的紧密性日益加强，FCM已广泛应用于临床医学，通过对多药耐药基因、凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定、检测器官移植后血液或移植内免疫成分变化、与荧光染料联合应用判断细菌的活力和功能状态等方法，在细胞凋亡和多药耐药基因检测、器官移植、临床细菌学、细胞生物学、优生遗传领域等都得到了充分的应用，有着广阔的前景。念珠菌是人类最常见的条件致病菌，也是院内感染的主要病原菌。近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤化疗药物等的广泛应用，其感染率不断上升，菌种也在不断的变迁，因此选择快速、简便的药敏试验方法测定抗真菌药物对病原性真菌的抑制活性，为临床选择用药提供依据，从而有效的预防和控制真菌感染。有人用流式细胞术快速检测30株白色念珠菌分离菌株对伊曲康唑的敏感性，发现本方法具有很好的重复性。流式细胞术具有快速、敏感、可靠的优势，在临床抗真菌药物敏感性检测中具有很大的应用前景。也有人利用流式细胞术检测疟原虫感染患者的血液红细胞，建立了一种新的疟疾辅助诊断技术。还有人应用流式细胞术对36株临床分离已经确定为产超广谱β-内酰胺酶的菌株进行药敏试验检测，发现该方法与传统方法检测结果具有一致性，但是更为快速客观、便于自动化，在联合药敏试验方面有较大的临床应用前景，为流式细胞仪应用到细菌药敏试验奠定基础。

3 结语

篇5：流式细胞技术及其应用

流式细胞仪配套用检测试剂 注册申报资料技术指导原则

（征求意见稿）

二O一一年八月

目录

一、前言………………………………………………………………

二、范围………………………………………………………………

三、注册申报资料要求

（一）综述资料…………………………………………………

（二）产品说明书………………………………………………

（三）拟定产品标准及编制说明………………………………

（四）注册检测…………………………………………………

（五）主要原材料研究资料……………………………………

（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料…………………

（七）分析性能评估资料………………………………………

（八）参考值（范围）确定资料………………………………

（九）稳定性研究资料 …………………………………………

（十）临床试验研究资料…………………………………………

四、名词解释……………………………………………………………

五、参考文献……………………………………………………………

一、前言

本指导原则旨为注册申请人准备及撰写流式细胞仪配套用检测试剂注册申报资料提供指导，同时也为技术审评部门对注册申报资料进行技术审评提供参考。

本指导原则是对流式细胞仪配套用检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其它方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

二、范围

本指导原则中“流式细胞仪配套用检测试剂”是指标记有特定发光物质（如荧光素、量子点等）、针对各类血细胞或组织细胞分化抗原的单克隆抗体试剂以及相关的质控品和校准品，这些抗体与血细胞或组织细胞的各类抗原分子特异性结合，与适用的流式细胞仪配套使用，对人血液、骨髓 液或其它体液组织标本中的被标记细胞或分子进行分类和计数。由于多方面差异，本文内容将不包括预期用途为利用流式细胞术进行特异性目的细胞分选的检测试剂。

本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

三、注册申报要求

（一）综述资料

综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、方法学特征、生物安全性评价、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料形式与基本要求》（国食药监械[2007]609号）的相关要求。

流式细胞分析是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析的检测手段，可以在短时内高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞测得多个参数。流式细胞分析主要靠流式细胞仪和各种特定发光物质标记的单克隆抗体试剂组合检测来实现。流式细胞仪是集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论等技术原理于一体进行流式细胞分析的仪器，其工作原理为：将待测细胞或微粒进行特异性染色标记后制成细胞悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液（鞘液）在高压下从鞘液喷出，包绕着细胞或微粒高速流动形成圆形流束（鞘流），依次通过流式细胞仪的检测区域。被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。前向散射光（forward scatter,FSC）和侧向散射光（side scatter,SSC）检测器把散射光信号转换成电信号，荧光则被聚光器收集，不同颜色荧光被双色反光镜转向不同的光电倍增管（PMT）检测器，把荧光信号转换成电信号。散射光信号和荧光信号经过放大后，再经过数据化处理输入电脑并储存，根据散射光和荧光信号对细胞或微利进行分类或计数。其中，FSC反映了细胞体积的大小，SSC则反应细胞部分结构的信息；荧光信号强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度。临床流式细胞分析是将流式细胞分析技术与方法应用于临床医学，与临床疾病的诊断、分型、治疗、预后及预防等相结合的综合应用学科。其应用范围广泛，包括细胞生物学、血液免疫学、肿瘤学、感染性疾病、造血干细胞移植、器官移植等多个方面。临床流式细胞分析要求实验人员对整个分析系统、各种相关实验技术和方法有深入理解和掌握，并能对检测结果给予合理的医学解释。

（二）产品说明书

说明书承载了产品预期用途、实验操作方法、检测结果解释以及相关注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，也是体外诊断试剂注册申报的重要文件之一。流式细 胞仪检测专业性较强，对产品说明书的编制进行必要的指导显得更为重要。该类产品说明书除对单克隆抗体试剂做必要的介绍外，还应对样本采集、样本处理及保存、仪器校准、检测质量控制、结果分析等相关步骤做详细描述，以保证分析结果的准确性和可重复性。

产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性及完整性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。结合相关法规要求及流式细胞分析的特性，下面对流式细胞仪配套用检测试剂说明书的重点内容作详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。

1.【产品名称】

单色试剂通用名称建议采取以下命名方式：被检标志物名称+检测试剂盒（流式细胞仪法-荧光素）。多色试剂可以结合靶抗原、目标细胞或组织、荧光素及临床预期用途等信息综合判断。

2.【预期用途】应至少包括以下几部分内容：（1）适用的样本类型：如全血、骨髓液、组织细胞等，并明确对所需抗凝剂的要求。

（2）待测靶抗原的特征简介，如分子结构、分子量、产生和代谢主要途径、表达细胞等。

（3）与被检标志物相关的临床背景介绍、正常表达情况、异常表达的主要疾病、与其他抗原的共表达情况以及可能的医学解释等。

（4）强调：实验操作人员应接受过流式细胞仪检测的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备合理的生物安全防备设施及防护程序。

3.【主要组成成份】

（1）主要是对特定荧光素标记的单克隆抗体特征的描述，应包括抗体特异性（CD标志），杂交瘤细胞，免疫球蛋白特征（Ig链），纯化方式，荧光激发及发射波长，偶联的荧光素，抗体浓度以及其他非抗体成分组成及浓度。

（2）如包括多种不同荧光素标记的单克隆抗体，则应对不同的抗体分别列表详述上述特征。

（3）建议将实验需要但本试剂盒未提供的主要成分进行列举：如与之配套使用的红细胞溶解试剂，稀释剂，细胞/血球计数仪等。

4.【储存条件及有效期】

试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、运输稳定性等。以及当试剂表面变化或变质时情况的描述及相关警示。5.【样本要求】

样本采集和处理的目标是获得均匀的单细胞悬液，同时必须尽量保证细胞的活力和完整性，防止目标细胞的损失。样本操作不宜过度，避免对细胞结构和抗原性造成破坏。故对于流式细胞分析而言，样本处理对实验结果至关重要，应尽量减少由于样本采集或处理不当对实验造成的影响。

在产品说明书中应重点对以下内容予以明确：（1）所需的样本量、采样方法（对抗凝剂或抗凝管的要求）及样本采集的注意事项，尽量引述相关标准操作规程。

（2）样本处理：溶血洗涤（或非洗涤）、细胞分离和提纯描述、离心和固定等方法；样本保存、转运的条件和方法。

（3）染色前稳定性：即采样后在合理的保存条件下，多长时间内必须进行抗体标记（染色）；如果不同抗凝剂样本的稳定时间有差异，则应分别进行阐述。

（4）染色后稳定性：即样本在完成抗体标记后至上机分析前可以稳定保存的条件及期限。最好结合染色前稳定性的要求对上机分析前的稳定性进行综合评价。

（5）避免使用的样本类型，如有微生物污染、乳糜、凝集或细胞活力不达标准等，在一般情况下应避免使用上述样本，除非样本有不可替代性，则应说明处理该种样本的方法，并应在结果报告时明示。（6）达到最佳染色效果所要求的目标细胞计数。①尽量采用公认的国际或国内标准操作方法进行细胞计数，保证计数准确性；②详述计数与预期不符时应采取的处理方法（浓缩或稀释等）；③提醒实验操作人员细胞计数的注意事项。

（7）样本活力要求及评估方法：为避免非活性细胞的非特异性结合，应评估细胞活性并设定有活力细胞的百分比下限，并推荐相关的有活力细胞评估方法。

（8）优化为最佳染色效果所需注意的重要信息；其他有关样本采集、处理及保存的注意事项。

6.【适用机型】所有适用的仪器型号，如对配套用软件有要求也应做特别说明，并提供与仪器或软件有关的重要信息以指导用户操作。

7.【检验方法】对于流式细胞分析而言，实验操作步骤对实验结果的影响至关重要，因此，应详细说明达到最佳染色效果的实验操作各个步骤，包括：

（1）试剂使用条件：温度/湿度条件、试剂用量、染色时间、是否需无菌操作等。

（2）简述试验开始前流式细胞仪的设臵方法，校准及质控程序。

（3）详细阐述试验操作步骤、注意事项。如对照的设定方式及类别（同型阴性对照、阳性对照、正常人血细胞对 照等），设门方法举例及代表性数据图示；靶细胞分类计数的方法及步骤、计算公式以及相关注意事项。

（4）校准：适用校准品的生产企业、产品名称及货号等详细信息，校准品的使用方法、推荐的校准周期及相关注意事项。

（5）质量控制：适用质控品的生产企业、产品名称及货号等详细信息，质控品的使用方法、对质控结果的必要解释以及推荐的质控周期等；建议在本部分注明以下字样：如果质控结果与预期不符，提示检测结果不可靠，不应出具检测报告。如质控不合格应提供相关的解决方案。

8.【参考值（参考范围）】

应注明待测标记细胞或分子在常用样本类型的正常参考值（范围），简单介绍设定该参考值（范围）所选健康人群的特征，如有必要，需对不同年龄段人群、不同性别或具有明确地理差异人群的参考值分别进行详述。

建议注明以下字样“由于地理、人种、性别及年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考值（范围）”。

9.【检验结果的解释】

由于流式细胞仪分析技术的专业性较强，检测过程中的影响因素较多且同一分析目标在不同人群的表达复杂多样，因此，流式细胞检测的数据分析、结果解释和出具临床报告 经常具有较大的挑战性，结果解释不当可能对病人的诊治造成很大影响。建议负责数据解释和出具报告的实验人员需经过正规的技术培训且有一定的临床经验，二者结合有助于对实验数据做出合理的医学解释。

产品说明书中的本部分内容应对上述情况进行必要的建议，还应对设门方法、数据分析、异常值处理、临床相关提示等内容做出合理解释。

10.【检验方法局限性】

（1）本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

（2）使用该试剂的其他限制，如样本、保存方法、保存时间，特殊患者可能出现的不正确结果，仪器设臵不当的影响等。

（3）是否与经其他试剂或仪器获得的同类数据具直接可比性。

11.【产品性能指标】 详述以下性能指标：

（1）精密度：简要说明精密度评价的方法，建议以列表的方式列出批内/批间、日内/日间、运行内/运行间精密度等信息，以标准差（SD）和变异系数（CV）的形式表示精密度研究结果。

（2）线性：包括细胞计数浓度范围和待测目标物阳性 细胞百分比浓度范围两类，申请人应至少对其中一个进行合理验证并在此列出，简要注明实验方法、所用仪器及软件等信息。

（3）对比试验研究：简要介绍参比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果、图示。

（4）分析特异性：有关交叉反应和干扰因素的验证信息。如：对溶血、高脂、黄疸等内源性干扰因子的浓度限值要求（如有必要），样本中可能存在某些内生物质与待测抗原有相似化学结构或抗原表位，如自身抗体、蛋白、激素或近期服用的某些药物（如生物制剂），这些物质可能与试剂中的单克隆抗体发生交叉反应而影响检测结果，如未进行相关研究也应提供相关警示说明。

12.【注意事项】应至少包括以下内容：

（1）生物安全性警告：接触到的临床样本、质控/校准品、实验废弃物等材料应当作为潜在传染物进行处理，并且采用符合法规的预防措施对其处理。

（2）有关仪器设臵的警示，如：流式细胞仪未经正确校准、荧光渗漏未行合理补偿以及检测区域（设门）未精确定位，则可能产生错误的检测结果。

（3）有关试剂准备的注意事项：如冷藏避光保存、切勿冷冻、使用前恢复室温等

（4）针对某些白细胞浓度过高或过低的情况，在样本 处理时需采用的特殊处理方式，如血样稀释或细胞浓缩等操作。

（5）试剂特殊成分或操作使用试剂危害性的警告及注意事项：如叠氮化钠、甲醛等；使用不当的处理方式

（6）保证试验结果准确的其他操作注意事项。

（三）拟定产品标准及编制说明

拟定产品标准应符合《办法》和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》的相关规定。另外，对于国产第三类体外诊断试剂，应参考《中国生物制品规程》（2000年版），将拟申报产品的主要原材料、生产工艺及半成品检定等内容作为附录附于标准正文后，并在正文的“产品分类”项中引出该附录内容。

该类产品注册检测的技术要求主要包括：准确度、线性、精密度、染色稳定性等相关指标，具体要求的设臵应参考相关的国家/行业标准（如有）执行，企业标准要求不得低于国家/行业标准要求。

（四）注册检测

对于首次注册产品，申请人拟定申报产品的产品标准后，应当在国家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行连续3个生产批次样品的注册检测。

对于已经有国家参考品的流式细胞检测项目，在注册检 测时应采用相应的国家参考品进行,对于目前尚无国家参考品的项目，生产企业应建立自己的质控体系并提供相应的内部参考品。

（五）主要原材料研究资料

应提供主要原材料如单克隆抗体、标记荧光素的选择、来源、制备过程、质量标准和质检报告等研究资料。若主要原材料为企业自行生产，则应详述原材料（主要是单克隆抗体）的制备及生产过程、杂交瘤细胞的选择、技术指标、质量控制、国际相关权威机构（如国际人类白细胞分化抗原协作组织，HLDA）的认证情况（如有）等；如主要原材料来自外购，则应详述抗体的名称及生物学来源，外购方名称，提交外购方出具的有关单克隆抗体后杂交瘤细胞的性能分析或检验证书，详述申请人对该抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。对荧光染色方法、染料选择依据，多色标记中荧光的交叉重叠验证等研究。

（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料

1、生产工艺的研究资料主要包含：

（1）主要生产工艺介绍，可以图表方式（工艺流程图）表示。

（2）生产工艺中关键步骤的质量控制要求及质控方法。（3）生产工艺的确定资料，如：生产工艺的选择依据，生产工艺的优化过程及方法等。

2、反应体系的研究资料主要包含：（1）反应原理介绍。

（2）产品说明书中描述的最佳反应条件各步骤的确定方法，包括需要的样本体积、样本的处理、保存时间，反应时间、温度的确定、抗体的用量（重要）、是否需反向加样、溶血/洗涤操作、去除干扰等。

（3）如产品说明书中使用了其他前处理试剂或流式细胞仪、仪器设定方法、或分析软件等达到最佳反应条件，则应将使用这些试剂或仪器的研究内容包含至该项资料中。

（4）应说明配合该产品所使用的分析方法并进行验证，如不同平台方法、不同软件分析、操作注意事项等。

（5）不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。（6）质量控制：同型阴性对照、正常成人样本对照、商业化阳性质控品、荧光信号与散射光结合对各细胞群的确认等。

（七）分析性能评估资料

企业应提交原厂在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每一项性能的评价，都应包括研究目的、实验设计、可接受标准、实验数据、统计方法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适用仪器、所用软件、临床样本来源等。对用于多色流式细胞分析的试剂（如 CD3/CD4/CD8淋巴细胞亚群检测试剂），其待测每个指标（如CD3、CD4和CD8三个指标）的所有分析性能均应分别进行相关的验证。分析性能评价的实验方法可以参考相关的CLSI-EP文件或国内有关体外诊断产品性能评估的文件进行。

1.准确度

对测量准确度的评价主要包括：与国家标准品（和/或国际标准品）的偏差分析和方法学比对两种方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。

（1）国家（国际）标准品的检测及偏倚情况 如果研究项目有相应国家（国际）标准品，则使用国家（国际）标准品进行验证，重点观察对相应标准品检测结果的偏差情况。

（2）方法学比对

采用国内/国际普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。如偏倚很小或在允许的误差范围内，说明两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结果。

在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量 标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本采集及处理的差异、浓度分布范围及不同浓度范围的可接受标准及合理的统计学分析等要素。

2.精密度：

精密度是指在规定的检测条件下，相互独立的测试结果间的一致程度，本类试剂的精密度评价主要考虑细胞计数结果和荧光强度两方面。建议采用多个水平的质控品用于细胞计数精密度的评价，各个浓度均应在试剂盒的线性范围内且有一定的临床意义（医学决定水平），通常包括该检测指标的正常范围、异常低值和高值样本。对于质控品或校准品的精密度评价，应包括其所有质控或校准项目，如荧光信号及散射光要求等。

在进行精密度评价时，除申报试剂本身的影响外，还应对操作者、适用机型、不同软件及实验地点等要素进行相关的验证。企业应制定合理的精密度评价方案，例如：在每个适用机型上进行至少20天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整运行，每天内两次运行间的时间间隔不少于3小时，从而对批内/批间、日间、运行内/运行间、不同操作者间的精密度以及各变量综合的总精密度进行评价。除精密度质控品外，建议选择适量临床采集的新鲜病人样本（包括所有适用样本类型）作为无靶值质控品进行精密度评价，以更好地模仿临床检测环境。3.线性范围：

本类产品线性主要包括稀释细胞浓度范围和标记抗体阳性细胞的百分率范围两种线性范围。企业可根据实际需要及以往的研究习惯自行选择其中一种对线性的要求进行验证。企业应对每个测量参数建立合理的线性范围，在建立一个参数的线性范围时，应该尽量将预期测定范围加宽，在合理范围内选择7-11个浓度水平，每个水平2-4份复制液，取每个浓度水平重复测量的均值用于线性回归分析，依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出最宽的线性范围，拟合回归直线的判定系数（R）应大于0.95。

建立稀释细胞浓度线性范围时，所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，建议采用混合血浆或自体血浆进行稀释，同时应考虑多倍稀释可能造成的基质效应。对于标记抗体阳性细胞百分率的线性范围，建议企业选择经确认的阳性细胞株和阴性细胞株按照恒定的细胞总数将两种细胞进行不同比率的混合，阳性细胞数与阴性细胞数比例可以从0%到100%不等，从而确认合理的有关阳性细胞百分率的线性范围。

4．特异性：

（1）采用多种方法对申报抗体与靶抗原结合的特异性验证研究，如采用竞争性抑制法、抗体与抗原纯品的结合研究、免疫印迹技术或胞膜抗原的基因转染技术等方法对抗原

2抗体结合的特异性进行相关的验证；有关靶抗原的细胞或组织分布特异性的研究，如抗体与不同细胞系的反应谱等。

（2）交叉反应性：验证所申报单克隆抗体除与目标抗原的结合外，是否与样本中可能存在其它内生或外源物质发生交叉反应，如与待测抗原有相似化学结构或抗原表位的蛋白、激素或近期服用的某些药物等。

（3）干扰：本处所指的干扰是指经过生产商指定的样本处理方法后，检测时是否还存在其他影响结果干扰因素或干扰物质。如有，生产商应进行说明并验证，使用医学相关水平的干扰物浓度进行验证，另外，亦建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行评价。

（八）参考值（范围）确定资料

应详细描述用于参考值（范围）确定健康人群的地域、年龄、性别等特征，并对统计分析方法进行详细解释。可以参考国内或国际有关参考值（范围）制定的指南文件推荐的方法进行。不同种族、年龄或性别人群如有明显差异应分别进行相关的统计分析并设臵不同的参考值（范围）。

（九）稳定性研究资料

稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、高温加速破坏稳定性、运输稳定性以及开瓶稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方 案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

样本稳定性主要考虑染色前和染色后稳定性，前者是指样本采集后至染色（标记）前的稳定性，后者是指染色（标记）后到上机分析前的稳定性。样本染色前、染色后稳定性需结合试剂的稳定性研究综合进行考虑。可以在合理的温度范围内选择多个时间点（应至少包括范围的上限和下限温度），每间隔一定的时间段对采集样本或标记后样本进行全性能的分析验证，从而确认样本染色前和染色后的合理保存条件和有效期。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（十）临床试验研究 1.样本例数

考虑到流式细胞仪配套用检测试剂种类繁多、临床用途广泛但主要原料、生产工艺及检测原理等非常相似的特点，该类试剂临床试验研究的总样本数为不少于500例。

2.临床研究单位的选择

流式细胞仪配套用检测试剂的临床研究应在三家以上（含三家）省级医疗卫生单位进行，对于特殊使用目的产品可以在相应的市级以上专科医院或其它诊疗机构开展临床研究。建议在国内不同城市选择临床单位，尽量使各单位的临床样本有一定地域代表性；临床研究单位须具有流式细胞仪专业的技术人员及相应的仪器设备，确保该项研究的实施。实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和参比试剂都应处于有效的质量控制下，定期对仪器进行校准，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。流式细胞仪检测的专业性较强，实验操作人员须接受过流式细胞仪技术的专业培训，并经过考核合格后上岗，具备实验室检测和临床病情相结合的流式细胞仪相关的检测经验，3.研究方法

（1）境内已有同类试剂批准上市产品的临床研究： 选择中国境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对照试剂，采用拟申报产品（以下称考核试剂）与之进行对比试验研究，证明考核试剂与已上市产品等效或优于已上市产品。

（2）境内尚无同类试剂批准上市的产品临床研究： 可以选择国外已上市、普遍认为质量较好的同类产品作为对照试剂，采用考核试剂与之进行对比试验研究，证明本 品与对照试剂等效或优于对照试剂。同时，还应结合每个患者的临床病情对申报试剂的检测结果进行综合判断，如有必要，需对研究对象进行相关的跟踪监测研究，以综合判断申报试剂的检测结果，验证其与临床病情的一致性。

4.试验方案

临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床研究机构的方案设臵应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。确定严格的病例纳入/排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。整个试验过程应在临床研究机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。

5.临床病例选择

绝大多数采用流式细胞仪方法检测的血细胞或组织细胞抗原对于疾病诊断的灵敏度和特异性较低，与器官/组织定位、疾病良恶性区分以及与病情的进展程度虽有一定关联但多无明确的量值-病情相关关系，而且，多数情况下，该类试剂在用于病变的诊疗时需要多个标记物组合检测才能体现其临床意义。因此，在进行临床研究时，除有针对性选择目的性较强的病例外，还应选择部分其他相关的抗原表达 类似或需鉴别诊断的病例。

临床研究试验中应包括对部分来自正常健康人群的样本作为正常对照。验证试剂的正常参考值（范围），比较正常组和疾病组结果，以便对申报产品的临床性能做出全面分析。建议对健康人群例数的选择以不超过50例为宜。对于新试剂或临床意义有待明确的试剂，可适当增加正常样本数。不管是健康人群或不同病种的患者，每一组受试者的最小入选人数均须满足统计学分析的基本要求。

6.结果差异样本的验证

在数据收集过程中，对于两种试剂的检测结果有明显差异的样本，应采用临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂或其他标准方法进行验证试验，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

7.统计方法：对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、ROC曲线分析等。对于对比实验的等效性研究，最常用是对实验试剂和对照试剂的两组检测结果的相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（r值）或判定系数（R）、回归方程斜率及y轴截距等指标。在临床研究方案中应明确统计检验假设，即评价实验试剂与对照试剂是否等效的标准。

8.临床试验结果报告

根据《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》的要求，2临床试验报告应该对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，应该对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并应包括必要的基础数据和统计分析方法。建议在临床总结报告中对以下内容进行详述。

（1）临床试验总体设计及方案描述

①临床试验的整体管理情况、临床研究单位选择、临床主要研究人员简介等基本情况介绍；

②病例纳入/排除标准、不同病种的预期选择例数及健康人群的选择标准；

③样本类型，样本的收集、处理及保存等； ④统计学方法、统计软件、评价统计结果的标准。（2）具体的临床试验情况

①考核试剂和参比试剂的名称、批号、有效期及所用机型等信息；

②对各研究单位的病例数、病种分布情况进行总合，建议以列表或图示方式给出具体例数及百分比；

③质量控制，试验人员培训、仪器日常维护、仪器校准、质控品运行情况，对检测精密度、质控品回收（或测量值）、抽查结果评估；

④具体试验过程，样本检测、数据收集、样本长期保存、结果不一致样本的校验等。

（3）统计学分析 ①数据预处理、差异数据的重新检测或第三方验证以及是否纳入最终数据统计、对异常值或缺失值的处理、研究过程中是否涉及对方案的修改。

②相关性和一致性分析

用回归分析验证两种试剂结果的相关性，以y=a+bx和R的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是参比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R是判定系数，同时应给出b的95%（或99%）臵信区间，定量值结果应无明显统计学差异。

另外考虑到某些检测指标在不同的样本浓度区间、不同年龄段人群或不同疾病来源的样本可能有较明显的差异，因此，如有必要，建议以上述相关要素为依据分组并对各组数据分别进行统计分析，以更好的验证两种试剂的相关性。

（4）讨论和结论

对总体结果进行总结性描述并简要分析试验结果，对本次临床研究有无特别说明，最后得出临床试验结论。

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四、名词解释

1.准确度（accuracy）：一个测量值与可接受的参考值间的一致程度。

2.精密度（precision）：在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。

3.线性（linearity）：在给定测量范围内，给出的测量结果与样品中实际存在的被测量物的值成比例的能力。线性是描述一个测量系统的测量示值或测量结果相关于样本的赋值符合直线的属性。

4.分析特异性（analytical Specificity）：测量程序只测量被测量物的能力。分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述，并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度（潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物）。

五、参考文献：

1.《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械[2007]229号）

2.《体外诊断试剂临床研究技术指导原则》（国食药监械[2007]240号）

3.《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国食药监械[2007]240号）

4.NCCLS EP9-A2：Method Comparison and Bias Estimation Using

Patient

Samples;

Approved Guideline-Second Edition(September 2002).5.NCCLS

EP5-A2:Evaluation

of

Precision Performance of Clinical Chemistry Devices;Approved Guideline-Second Edition(August 2004).6.NCCLS EP6-A: Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach;Approved Guideline.7.H20-A2:Reference Leukocyt(WBC)Differential Count(Proportional)and Evaluation of Instrumental Methods;Approved Standard—Second Edition.8.H42-A2:Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry;Approved Guideline—Second Edition.9.H43-A2:Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic

Hematolymphoid

Cells:

Approved Guideline—Second Edition.10.H44-A2: Methods for Reticulocyte Counting(Automated Blood Cell Counters, Flow Cytometry, and Supravital Dyes);Approved Guideline—Second Edition.11.H52-A: Fetal Red Cell Detection;Approved Guideline.12.ILA26-A: Performance of Single Cell Immune Response Assays;A pproved Guideline.13.王建中：《临床流式细胞分析》，上海科学技术文献出版社

14.杜立颖，冯任青：《流式细胞术》，北京大学出版社 15.冯仁丰，《临床检验质量管理技术基础》（第二版），上海科学技术文献出版社

篇6：流式细胞技术及其应用

为了进一步了解活性污泥菌群结构及其功能,为污水处理的正常运转提供理论参考,本实验采用荧光原位杂交技术和流式细胞术对活性污泥细胞悬浊液进行微生物细胞检测分析,结果发现污泥中α-,β-和γ-变形杆菌亚纲和丛毛单胞菌属的微生物相对含量分别为15.09%,20.50%,12.00%和8.37%;这表明β-变形杆菌亚纲的.含量最高,为活性污泥中的优势菌群.

作 者：赵现方 陈林海 李宗义 王振河 ZHAO Xian-fang CHEN Lin-hai LI Zong-yi WANG Zhen-he 作者单位：赵现方,王振河,ZHAO Xian-fang,WANG Zhen-he(河南科技学院,生命科技学院,河南,新乡,453003)

陈林海,CHEN Lin-hai(郑州大学,离子束生物工程实验室,郑州,450053)

李宗义,LI Zong-yi(河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007)