流式蛋白方法总结

2024-04-28

流式蛋白方法总结（共6篇）

篇1：流式蛋白方法总结

菠萝蛋白酶的提取方法：

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。（2）离子交换色谱法

离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。（3）固定化金属离子亲和色谱法

固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍，回收率达 94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，Pawan Gupta等（2007）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。Cu2+ 与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。（4）超滤法

超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。(5)双水相萃取法利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。(6)反胶团萃取法

生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化 5.2 倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。(7)新型纳米吸附剂法

随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，Haitao Zhang 等（2010）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。

供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在 4℃冷室中预冷 12h，组织捣碎机捣碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提 10min，4 层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为 1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入 4℃冷室中预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min，4 层纱布过滤，滤液在 4000 rpm 条件下，离心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中备用。1.纳米 TiO2吸附法

（纳米 TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）

供试酶液中加纳米 TiO2搅拌均匀→离心（4000 rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000 rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点： ① 吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。② 超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。③ 冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。④ 纳米 TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附时间＞吸附温度高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）

供试酶液→加 4%高岭土，搅 20min，10℃吸附 30~60min→静置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 调 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，搅 30min→压滤，滤液用 1:3（体积比）盐酸调 pH5.0→搅拌→加滤液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，2002）。操作要点：

①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入 4%的高岭土，搅拌约 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用 16%的 NaOH 溶液调节吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附质量为 7%~9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用 1:3 的盐酸调节 pH 至 5.0 左右，搅拌加入压滤液质量 25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

3.超滤浓缩有机溶剂沉淀提取

供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。

操作要点：①超滤：供试酶液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至 0~4℃，边搅拌边加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即为湿酶。

③干燥：将湿酶在 0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5 离子交换层析条件的确定（D.R.马歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂 1mL，用蒸馏水充分冲洗，定量到 10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品，配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中，混匀，离心取上清液，测酶活性。离子强度：取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 缓冲液充分润洗 1~4 号试管，使离子树脂与相应缓冲液平衡，去掉多余缓冲液，向各管中加入 1mL 样品及等量缓冲液。混匀，静置 10min，离心取上清，测酶活性。吸附容量：取4支2mL离心管加入同初始缓冲液平衡后的离子交换树脂0.2mL。用离心管处理样品，于1、2、3、4号管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的样品。混匀，离心取上清液，测酶活性。离子交换层析：（1）PH的确定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸盐缓冲液（2）洗脱液的浓度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作为梯度洗脱的上限浓度。（3）吸附容量的测定为保证柱层析效率和菠萝蛋白酶的回收率拟选择 1mL 为最佳吸附容量。

离子交换法的详细步骤.1 离子交换介质处理与转型

用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%），作真空脱气处理备用。2 装柱与平衡

将所有材料和试剂平衡至室温，配制初始缓冲液为 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液（含 0.01%的 EDTA）和洗脱液为 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）。根据试验中柱子（1.1cm×30.0cm）的类型取所需量的凝胶，打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速通过，稳定柱子。用 3~4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。同时连接紫外检测仪，等流出液在检测仪上绘出的基线稳定后平直即可。3 加样

略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。.4 洗脱

加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，开始洗脱，同时连接紫外检测仪，调整横流泵为 1mL/min，同时以自动部分收集器收集，每5min 收集一管，分别测定每管的蛋白浓度及酶活。

二．蛋白含量测定方法

采用考马斯亮兰 G-250 法（George R，1973）测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的标准蛋白溶液。②考马斯亮兰 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀释至 1L，过滤后贮于棕色瓶中。③标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min后，在 595nm 波长下比色测定（应在 1h 内完成），以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标。根据表 1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 为吸光度，x 为蛋白质浓度 μg/mL。

酶的活力测定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml与15ml的具塞试管中，置于37摄氏度恒温水浴中保温十分钟，准确取一定量的的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀释至1ml，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37摄氏度的恒温水浴中，准确反应10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，终止反应，用力混匀，在37摄氏度恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测为其吸光度A。另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得吸光度A0。

菠萝蛋白酶活性的单位定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下（PH7.0 ,37加减1摄氏度）酶作用于干酪素底物1min产生1ug酪氨酸所需酶量。

篇2：流式蛋白方法总结

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。间相互作用的实验方法比较)

一、酵母双杂交系统

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。

二、噬茵体展示技术

在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。

三、等离子共振技术

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

(另补充2：检测两种蛋白质之

四、荧光能量转移技术

荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。

五、抗体与蛋白质阵列技术

蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。

六、免疫共沉淀技术

免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|Pansobin”，因为SPA|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

七、pull-down技术

蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中

钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较

研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式，是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些？(补充：研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结1)这些检测方法各有什么优缺点？总结如下。1.生化方法

●共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析（需要补充）

●蛋白质亲和色谱基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。

GST pull down技术：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。

Epitope-tag技术：表位附加标记技术就是将附加的抗原融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。

以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。

●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。

●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。

2.等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。

3.遗传学方法使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。

●基因外抑制子。基因外抑制子是通过一个基因的突变来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。

●合成致死筛选指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。

4.双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。

5.荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。

此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。

篇3：流式蛋白方法总结

研究表明,Rp1L基因表达的核蛋白L7/L12是布鲁菌中比较重要的疫苗靶蛋白,具有高度的氨基酸序列保守性,可以促进INF-γ基因的转录和表达,从而提高机体的免疫能力[3]。本试验应用流式细胞仪筛选出分泌核蛋白L7/L12抗体的杂交瘤细胞株,与传统方法比较可提高单克隆抗体的表达量及活性,还可以减少单克隆抗体的筛选步骤,同时为后续基因工程疫苗机理和布鲁菌检测方法的研究奠定基础。

1 材料

1.1 试验动物

Balb/c雌性小鼠,6~8周龄,由齐齐哈尔大学动物实验室提供。

1.2 菌体及细胞

含重组表达载体p ET28a-L7/L12的大肠杆菌Rosetta(DE3)、SP2/0骨髓瘤细胞,由齐齐哈尔大学动物实验室提供。

1.3 主要试剂

聚乙二醇(PEG)、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂,Sigma公司生产;羊抗鼠Ig G-HRP,购自Thermo公司;HAT培养基、HT培养基、RPMI 1640培养基,购自Invitrogen公司;藻红蛋白标记试剂盒,购自Innova Biosciences公司;TMB显色液及其他试剂,Amresco公司生产;NC膜和3 mm滤纸,购自Whatman公司。

1.4 主要仪器

流式细胞仪,购自ABI公司;Ni-NTA纯化预装柱,购自GE公司。

2 方法

2.1 重组布鲁菌核蛋白L7/L12的表达及纯化

将含重组表达载体p ET28a-L7/L12的Rosetta(DE3)菌株活化,并接种至LB液体培养基(氨苄西林浓度为100μg/m L)中,37℃振荡培养过夜;次日取1%培养液转接于LB液体培养基(氨苄西林浓度为100μg/m L)中,37℃振荡培养至OD600值为0.4~0.6时,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达[4]。收集菌体进行超声波破碎,离心后分别收集菌体上清液和沉淀,SDS-PAGE电泳分析重组核蛋白L7/L12-组氨酸(His)的表达情况。在目的蛋白可溶性表达时,可以直接应用Ni-NTA纯化预装柱对菌体上清液进行纯化,再用紫外分光光度仪测定蛋白浓度[4,5]。

2.2 免疫小鼠

用无菌PBS缓冲液稀释纯化后的重组核蛋白L7/L12-His至200μg/m L,加入等体积的弗氏完全佐剂进行混匀乳化,取6~8周龄雌性健康Balb/c小鼠,首次免疫剂量为100μg,分别在小鼠背部皮下、腹腔及腿肌进行多点注射;首次免疫15 d后进行第2次免疫,取等量蛋白加入弗氏不完全佐剂,免疫方法同首次免疫;首次免疫30 d后进行第3次免疫,方法同第2次免疫;于细胞融合前3天腹腔注射等剂量蛋白(不加佐剂)进行末次加强免疫。

2.3 血清效价的检测

采用间接ELISA方法测定小鼠血清效价,并分别设置阴性对照和空白对照,用包被液稀释纯化后的重组核蛋白L7/L12-His至2μg/m L,加到96孔酶标板中,100μL/孔,4℃包被过夜。次日,用PBST洗涤3次,每次5 min;吸干液体后每孔加入200μL含5%脱脂奶粉的PBST,37℃封闭1 h;PBST洗涤3次,每次5 min;拍干待用。试验组每孔加入100μL适当稀释的免疫小鼠血清,阴性对照为稀释的未免疫小鼠血清,空白对照加入PBST,37℃孵育1 h;然后用PBST洗涤3次,每次5 min;拍干后每孔加入100μL羊抗鼠Ig G-HRP(按照1∶5 000比例稀释)温育1 h;PBST洗涤3次,每次5 min;拍干后加入TMB溶液显色10 min左右,加入终止液终止反应,用酶标仪测定OD450值[6]。

2.4 应用流式细胞仪筛选单克隆抗体

末次免疫3 d后,按照1∶10比例将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合,1 000×g离心3 min;弃上清液,将管底细胞敲击松散后置37℃水浴箱中,并沿管壁加入1 m L预热的PEG,45 s内滴加完毕;静置45 s后缓慢加入RPMI 1640培养基10 m L终止反应,1 000×g离心3 min;弃上清液,将细胞重悬于HAT培养基(含20%胎牛血清)中,再与制备好的饲养层细胞混匀,加到T-75培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱中培养5 d;加入10 m L HAT培养基,之后换成含20%胎牛血清的HT培养基继续培养。

按照藻红蛋白标记试剂盒说明书标记重组核蛋白L7/L12-His,制备标记好的藻红蛋白-L7/L12-His蛋白,用流式细胞仪筛选单克隆抗体。待细胞密度生长至培养瓶1/4时,将筛选后的融合细胞吹打至悬浮,收集细胞悬液,1 000×g离心3 min;弃上清液,用无菌PBS洗涤细胞后离心;弃上清液,加入PBS稀释好的藻红蛋白-L7/L12-His蛋白,结合40 min;用无菌PBS洗涤细胞3次,将其置于流式细胞仪中筛选,并将筛选出的阳性细胞株分至96孔细胞培养板中,每孔为单细胞,将培养基血清浓度调整至30%,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。

2.5 杂交瘤细胞株的体外培养及检测

当96孔细胞培养板中细胞生长至单孔的60%时,取细胞培养上清液,采用间接ELISA法检测抗体,筛选出表达量较高的单克隆细胞株。

2.6 免疫杂交鉴定杂交瘤细胞株

对纯化后的重组核蛋白L7/L12-His进行SDS-PAGE电泳,同时点样Marker进行对照;电泳结束后,采用半干法进行转膜,200 m A转膜40 min;将重组核蛋白L7/L12-His转移至硝酸纤维素膜上,用丽春红染色拍照后洗掉,将膜封闭;1 h后弃掉封闭液,以杂交瘤细胞株分泌的细胞上清液作为一抗孵育2 h;洗膜后加入羊抗鼠-HRP二抗孵育,将硝酸纤维素膜放入超敏发光液A和B中,混合均匀,待荧光显色后进行曝光。经显影定影后,将胶片清洗干净,风干,拍照。

2.7 单克隆抗体特异性的检测

对牛型布鲁菌菌体蛋白、重组核蛋白L7/L12-His、含重组表达载体p ET28a-L7/L12的大肠杆菌Rosetta(DE3)(阴性对照)、布鲁菌外膜蛋白进行SDS-PAGE电泳和转膜,然后分别用筛选出的细胞株上清液进行Western-blot检测。

3 结果与分析

3.1 布鲁菌重组核蛋白L7/L12-His的表达及纯化

重组核蛋白L7/L12-His为可溶性表达,在菌体上清液中,分子质量约为14.0 ku,与预期结果相符。菌体破碎后其上清液经Ni-NTA纯化预装柱纯化,并用紫外分光光度计测定,结果蛋白浓度为1.5 mg/m L。重组核蛋白L7/L12-His的表达及纯化结果见图1。

3.2 免疫小鼠血清效价的检测

通过间接ELISA法测定免疫小鼠血清效价,分别对阴性血清和免疫小鼠血清进行稀释,稀释度为1∶200~1∶12 800,根据(阳性血清-空白对照)/(阴性血清-空白对照),即P/N>2.1为阳性的原则选取血清最佳稀释倍数,根据表1数值计算,血清稀释度为1∶800时P/N呈阴性,其最大值为2.081,以其为血清最佳稀释倍数,测定血清效价为1∶6 400。

3.3 流式细胞仪筛选结果(见图2)

由图2可知,该样品有2个明显的峰值,第2个信号峰即为高效表达L7/L12抗体的细胞。

3.4 单克隆抗体效价的检测结果

通过ELISA检测,对比OD450值选出其中3株表达量较高的杂交瘤细胞株D6、E7、G9,对细胞株上清液进行1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800梯度稀释,ELISA检测发现,细胞培养上清液效价均可达到1∶1 600~1∶3 200,将其继续传代3个月以上,并用液氮冻存,复苏后进行ELISA检测,结果这3株杂交瘤细胞均可以高效、稳定分泌L7/L12蛋白抗体。

3.5 杂交瘤细胞株培养上清液的免疫杂交鉴定(结果见图3)

由图3可知,细胞株分泌的单克隆抗体均可以与重组蛋白发生特异性免疫反应,分子质量约为14.0 ku。

3.6 单克隆抗体特异性检测结果

3株单克隆抗体均可以与布鲁菌全蛋白和原核表达的核蛋白L7/L12特异性结合,而不与另外2个样品反应,说明其特异性较好,不存在交叉反应,以D6杂交瘤细胞株Western-blot分析为例,结果见图4。

4 讨论

布鲁菌病主要由布鲁菌引起,可以导致人畜共患病[1]。近年来,全球人与牲畜的发病率呈攀升趋势。目前,主要应用疫苗预防布鲁菌病,广泛使用的疫苗是弱毒疫苗,对机体的保护效果比较好。但此类疫苗也存在两方面缺陷,一方面是不能辨别人畜的抗体产生来源;另一方面是具有返祖现象、毒性较大,会对机体造成伤害。因此,针对布鲁菌病防治的进一步研究极为重要[7,8]。

齐齐哈尔大学动物学实验室应用p ET28a成功地表达了具有免疫原性的核蛋白L7/L12,创新性地应用流式细胞仪筛选出高效表达单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Western-blot检测结果表明,该抗体效价高,免疫特异性较强。与传统方法比较,该方法缩短了筛选时间,节约了人力、物力,而且可以避免传统筛选方法造成的抗体交叉反应现象。

制备单克隆抗体的重要因素之一是制备纯度较高、具有免疫原活性的重组蛋白,本试验优化了菌体培养条件,使其可溶性表达,避免了包涵体的变性及复性等操作,极大地保留了蛋白的天然结构和活性。本试验应用重组核蛋白L7/L12制备单克隆抗体,便于纯化,且分子质量较小,不影响免疫小鼠。

可以确定,经流式细胞仪筛选的杂交瘤细胞株是单克隆细胞株,细胞培养上清液的效价达1∶3 200,Western-blot检测结果表明,分泌的单克隆抗体能与牛型布鲁菌全菌体蛋白和重组核蛋白L7/L12发生特异性免疫反应,因此可应用此单克隆抗体检测布鲁菌,同时也为后续研究基因工程疫苗的机制奠定了基础。

摘要：为了制备牛型布鲁菌核蛋白L7/L12的单克隆抗体,试验采用流式细胞仪与间接ELISA相结合的方法进行单克隆筛选,以及Western-blot分析。结果表明:最终筛选出3株表达量较高的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液的抗体效价可达1∶3 200,3株单克隆抗体均能与核蛋白L7/L12发生特异性结合,无其他交叉反应。

关键词：布鲁菌,核蛋白L7/L12,单克隆抗体,效价,流式细胞仪,杂交瘤

参考文献

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[7]蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社,2001.

篇4：流式蛋白方法总结

方法：应用流式细胞术（FCM）分析GSTπ蛋白的表达。

结果：乳腺癌组织GSTπ表达显著高于癌旁组织（P<0.06）。这种耐药相关蛋白在不同性别、不同年龄、不同病理类型、不同病理类型、不同临床分期和雌、孕激素受体阴性与阳性患者间的表达，经实验和对照组研究均无显著差异（P>0.05）。实验结果研究提示有淋巴结转移组患者GST-π表达在实验中显著高于无淋巴结转移组患者（P<0.05）。

结论：实验研究结果表明，GST-π表达与淋巴结转移状况有关，因而极有可能成为预测乳腺癌预后的另一重要指标。

关键词：GST-π 乳腺肿瘤流式细胞术

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879（2012）09-0014-01

谷胱苷肽S-转移酶-π（GST-π）是GSTs家族的主要成员，是一组具有多种生理功能、参与机体解毒作用的肿瘤细胞和组织中最常见的同工酶，其变化远远早于细胞的形态改变，因而成为许多肿瘤转化的系列化标志物，而且GSTs还具有细胞抗损伤、抗癌变的作用，在许多耐药细胞特别是多药耐药表型的细胞系中高水平表达，故认为GST-π的高表达可能是多药耐药标志之一。为进一步明确GST-π在乳腺癌中的表达意义，本实验研究检测了其在乳腺癌组织中的表达情况，并探讨与患者临床病理特征等因素间的密切关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料。120例乳腺癌患者为厦门市立医院肿瘤科和漳州市立医院肿瘤科2004年12月～2008年12月的住院病例。患者女性，年龄均在26-78岁，中位年龄55.5岁，全部行乳腺癌改良根治术或根治术治疗。肿瘤直径>1.2cm，留取癌组织和距癌边缘1cm以上的癌旁腺体组织。患者全部经病理证实且术前未接受任何放、化疗治疗及其他治疗。组织学分类按照2003年WHO分类，包括浸润性导管癌99例，其他类型21例。临床分期根据1997年UICC分期标准：Ⅰ、Ⅱ期90例，Ⅲ期30例。有腋淋巴结转移者78例，无腋淋巴结转移42例。

1.2 细胞免疫荧光染色的样品制备。首先用组织搓网法制成单细胞悬液，70%冷乙醇4℃固定24h，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤2次，调浓度为1×10⁶/ml。二步法进行免疫荧光染色，100μl细胞悬液先加MGMT单抗（Chemicon，1∶40）或GST-π单抗（B-D Pharmingen，1∶10）10μl。室温避光反应30min后加二抗FITC-IgG1（B-D Pharmingen，1∶10）5μl，室温避光反应30min后上机检测。

1.3 FCM条件。B-D公司FACS Calibur型流式细胞仪，蛋白表达以相对荧光强度（RFI）表示。RFI=加单抗管细胞平均荧光强度/同型对照管细胞平均荧光强度。

1.4 统计学分析。采用SPSS10.0软件，组织耐药相关蛋白表达呈非正态分布，表达用中位数（Median），比较用秩和检验。相关性采用Pearson相关分析。

2 结果

乳腺组织中MGMT和GST-π蛋白表达。乳腺癌组织MGMT和GST-π表达分别为1.00～9.24和0.19～19.67，中位数分别为3.01和0.99；相应癌旁组织2种蛋白表达分别为0.70～2.09和0.30～1.22，中位数分别为1.30和0.72。经秩和检验，乳腺癌组织耐药相关蛋白表达与相应癌旁组织比较差异均有显著意义（P<0.05）。GST-π耐药相关蛋白在不同年龄、不同肿瘤大小、不同病理类型、不同临床分期和雌、孕激素受体阴性与阳性患者间的表达均无显著差异（P>0.05），GST-π表达在有淋巴结转移组患者显著高于无淋巴结转移组患者（P<0.05）。

3 讨论

GST-π在乳腺癌中的表达意义。本研究发现乳腺癌组织GST-π表达高于相应癌旁组织，与有关报道一致，提示GST-π表达增加可能与乳腺癌发生及发展进程有关。同时，GST-π表达与患者的年龄、肿瘤大小、临床病理类型、临床分期和ER、PR表达状况均无关，但与淋巴结转移有关，与文献[8]相似。但国内也有相反研究结果，如Huang等发现GST-π与任何临床病理因素均无关，但GST-π阳性肿瘤却更具侵袭性，患者无瘤生存期短、预后很差。Gilbert等发现GST-π表达与淋巴结转移、肿瘤大小及核分级、组织学类型及年龄均无关，但与ER、PR表达状况呈负相关性。对部分淋巴结转移阴性乳腺癌患者的研究显示，GST-π表达增加与无瘤生存期和总生存期降低有关。

参考文献

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