混流式风机工作原理

第一篇：混流式风机工作原理

混流风机与轴流风机、离心风机、斜流风机的区别

斜流(混流)风机，风压系数比轴流风机高，流量系数比离心风机大。添补了轴流风机和离心风机之间的空白。同时具备装简单方便的特点。混流式(或轴向冲流式)风机结合了轴流式和离心式风机的特征，尽管它看起来更像传统的轴流式风机。

离心风机和轴流风机主要区别在于：

1、离心风机改变了风管内介质的流向，而轴流风机不改变风管内介质的流向;

2、前者安装较复杂

3、前者电机与风机一般是通过轴连接的，后者电机一般在风机内;

4、前者常安装在空调机组进、出口处，锅炉鼓、引风机，等等。后者常安装在风管当中、或风管出口前端。此外还有斜流(混流)风机，风压系数比轴流风机高，流量系数比离心风机大。添补了轴流风机和离心风机之间的空白。同时具备装简单方便的特点。

混流式(或轴向冲流式)风机结合了轴流式和离心式风机的特征，尽管它看起来更像传统的轴流式风机。将弯曲板形叶片焊接在圆锥形钢轮毂上。通过改变叶轮上游入口外壳中的叶片角度来改变流量。机壳可具有敞开的入口，但更常见的情况是，它具有直角弯曲形状，使电机可以放在管道外部。排泄壳缓慢膨胀，以放慢空气或气体流的速度，并将动能转换为有用的静态压力。

轴流风机和离心风机在机械通风中的作用

1由于气温和粮温相差较大，第一次通风时间要选在白天，以减小粮温和气温的差距，减轻结露的发生。以后的通风尽量选在晚上进行，因为本次通风是以降温为主，晚上大气湿度相对偏高、温度较低，这样即减少了水份损耗，又充分利用了晚上的低温，提高了降温效果。 2用离心风机通风初期有可能会出现门窗、墙壁结露，甚至表层粮面轻微结露，只要停止风机，打开窗户，开启轴流风机，必要时翻动粮面，将仓内的湿热空气排除仓外就可以。而用轴流风机进行缓速通风就不会出现结露现象，只会出现中上层粮温缓慢上升，随着通风的继续进行粮温会平稳下降。

3用轴流风机进行缓速通风时，由于轴流风机的风量小，另外粮食是热的不良导体，通风初期容易出现个别部位通风缓慢，随着通风的继续进行全仓粮温会逐渐平衡。 4进行缓速通风的粮食必须经过震动筛的清理，并且入到仓内的粮食必须及时清扫自动分级造成的杂质区，否则易造成局部通风不均。

5能耗计算：14号仓用轴流风机累计通风50天，平均每天15小时，共用750小时，水份平均降了0.4%，粮温平均降了23.1度，单位能耗为：0.027kw.h/t.℃。28号仓累计通风6天，共用126小时，水份平均降了1.0%，温度平均降了20.3度，单位能耗为：0.038kw.h/t.℃。 6以轴流风机进行缓速通风的优点：降温效果良好;单位能耗低，在倡导节能的今天尤为重要;通风时机易掌握，不易出现结露;不用单独配备风机，方便灵活。缺点：由于风量小，通风时间长;降水效果不明显，高水份粮不宜用轴流风机进行通风

7离心风机的优点：降温、降水效果明显，通风时间短;缺点：单位能耗高;通风时机掌握不好易出现结露。

第二篇：自己总结：流式细胞仪的原理和用途

流式细胞仪(Flow Cytometry)

1 流式细胞仪的概念及其发展历史

1.1 流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪(flow cytonletry，FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。

1.2 流式细胞仪的发展简史 最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。

宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标

2.1 流式细胞仪工作原理 除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。

流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。

激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级;光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。

从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

计算机和分析系统

经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。

2.1.1 信号的产生、转换和传输 在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物(每种物质携带的标记物不同吗?)通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种;一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管(PMT)。从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA测量等。另一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。

参数(例如：细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构)测量原理

流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π(360°)的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角(即0角)散射(FSC);②侧向散射(SSC)，又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强;培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料;②选用适宜的激光和滤片光学系统;③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

2.1.2 流式细胞仪分选原理 并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。

2.1.3 数据的显示和分析 数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”(Channel No.)来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。

除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。

数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。

2.2 流式细胞仪性能的技术指标 流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数(CV值)来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为5000～10000，分选速度控制在1000以下。 流式细胞仪测量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的，即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。

3 主流流式细胞仪型号及其特性介绍

目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD(Becton-Dickinson)公司、Beckman-Coulter公司(原名称Coulter)和德国的Partec公司。

3.1 BD公司流式细胞仪介绍 BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs(fluorescence activated cell sorter)，即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。现在市场上供应的型号有五种：FACSCount(小型流式细胞仪)、FACS CAlibur(流式细胞仪)、FACSA ria(流式细胞分选仪)、FACSV antage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)。

FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3，CD4，CD8绝对数而设计的。FACSCalibur是全自动多色流式系统，偏重于临床，其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能。配备有二根激光管，可同时检测4个荧光参数。可识别粘联细胞。

BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达70，000细胞/s，分析速度达50，000/s。使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光，多色分析，分析参数可达15色。两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操作。配件BDACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。

FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统，点对点分选，配置FACS Diva数字化系统，提供全面的配套试剂。速度和功能优于FACSV antage。 BD LSR II是LSR的数字化升级版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之间，是专为生命科学研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光，四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用。

3.2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍 Beckman- Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile(早期，现已停产)和EPICS系列为代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式细胞仪，目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号，其中ALTRA具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小，可自动进行5种颜色的分析，适用于免疫学检测，如人类HIV诊断。特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板。特别适合工作量大的实验室。

这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产，其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域，如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵，我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构。

3.3 Partec公司流式细胞仪介绍 与BD和Becman-Coutler公司的产品相比，德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小，造价低，易操作，便于携带，适合植物学研究，适合边远地区和发展中国家。德国Partec公司的产品分为三类：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy为早期产品，已停产)。CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I。它是单或双参数的台式小型机，可以进行一些常规分析，如核DNA测定(检测倍性或细胞周期)、细胞计数、细胞凋亡。它的特点是体积小，易操作，价格低，检测范围广，可以检测多种荧光素(如PI、DAPI、Fluorescein)发出的荧光。PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III(PAS-III)和倍性分析仪PA-II。提供三种激光器的三种组合，可检测十余种荧光染料。最多可检测和记录八个独立荧光参数。倍性分析仪PA能够在2分钟内自动测量植物的倍性水平，检测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物中，异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体。PA-I使用HBO-100汞灯，属于弧光灯，可产生紫外激发光和蓝光。PA-II中增加了488nm氩离子激光器，能够检测几乎所有的荧光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞灯发光是电流经过气体时，气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。

CyFlow(R)SL配备三种激光管，可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究。如HIV扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用l2 V直流电，特别适合边远地区和发展中国家。

国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中(Galbraith，1983)，众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法(Michaelson，1991)。应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量(Baird，1994;Jacob，1996;HALL，2000)和倍性水平(Costich，1993;Meng，2002)、检测体细胞杂种(Pfosser，1995;Keller，1996)和游离小孢子培养再生株(Kim，2003)的DNA含量。过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几，且大多是在国外实验室完成的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品，也有少量是BD公司生产的流式细胞仪。BD公司的产品主要定位于医学研究与应用，与Partec产品相比，不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂，数据获取软件可同时检测到的倍性数目少。鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪，在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。

如何选择流式细胞仪

自七十年代出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。

流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。 ⑴、DNA倍体分析

DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。

流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。 ⑵、细胞生存能力实验

使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同，染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。

流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片。 ⑶、计数外周血中检测网织红细胞

使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。 流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统。

⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定

使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。 流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。 ⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验

检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。 流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。 ⑹、血小板自身抗体检测

血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。

流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。 ⑺、移植交叉配型

原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。 仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。 ⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应

淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。 流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片。 ⑼、检测细胞内因子(TH1/TH2细胞检测)

未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下，活化分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，如细胞因子分泌到细胞外则检测不到，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞，因此存在着用CD4来设定细胞群的问题。我们知道CD4不但在T 细胞上表达，还在所有的单核细胞上表达，因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来。那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢?回答是否定的。因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调，甚至完全丧失，所以不适合于设门。用CD3和CD8设门，因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞，因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。FITC标记CD8，PE标记IL-4和，PE-CY5标记IFN-r，APC或PE-CY7标记CD3。

流式细胞仪要求：488nm或633nm(仅限APC染料)光源，525nm、575nm、675nm，767nm滤光片。 ⑽、细胞增殖状态检测

核增殖抗PCNA、Ki6

7、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。

流式细胞仪要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。 ⑾、染色体分析

流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合;Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。

流式细胞仪要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm滤光片。 ⑿、BrdUrd标记追踪细胞分化

通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G

1、S、G

2、M期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。 流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。 ⒀、淋巴细胞亚群分析

外周血CD

3、CD

4、CD

8、CD

19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片，液量绝对计数系统。 ⒁、白血病免疫分型

CD45设门三色白血病免疫分型。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。 ⒂、血小板分析

血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。 ⒃、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测

根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。 T系白血病微小残留病灶检测

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。 B系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。

髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。

⒄、细胞凋亡分析

DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测。 流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。 ⒅、肿瘤耐药分析

P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测。 流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。 ⒆、强直性脊柱炎诊断

检测淋巴细胞B27表达强度及百分比，诊断强直性脊柱炎。 流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。 ⒇、PNH诊断

外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD

55、CD59表达强度或百分比，确诊夜间阵发性血红蛋白尿。

流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。

第三篇：水泵风机的参考接线原理图

消防水泵 注：

1、水泵回路二次原理接线图参见图集10D303-3 P188-190页。 双电源污水泵 注：

1、水泵回路二次原理接线图参见图集10D303-3 P197-199页。 排烟(加压送风)风机 注：

1、风机回路二次原理接线图参见图集10D303-2 17-18页。

第四篇：流式细胞仪分析技术及应用(课件)

流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述

第二节 数据的显示与分析

第三节 流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节 流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司;BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点 ：1.单个细胞水平分析;2.多参数分析(同时多种荧光素标记)水平分析;3.灵敏度高;4.可分析大量细胞;5.速度快： 5000-10000个细胞/秒;6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况;7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节 概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。 分为三大类：(1)类为台式机(临床型)：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机(科研型)特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。 流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成

细胞功能

一、工作原理 大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度

细胞活性

效率;②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术， DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性;③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

了检测速度与统计分析精确性。 概括为三个系统结构：(1) 液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液(PBS或生理盐水)：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

(2) 光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射

1 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：(LP) ：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片(SP) ：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片(BP) ：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

(3) 数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光 对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室

载玻片 检测信号 光学信号

形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术(如染色)，因此称为细胞的物理参数。(波长与激光相同。)主要分为: ①前向散射光(0°散射)FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光(90°散射)SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC(表示细胞大小)SSC(表示细胞内颗粒的复杂程度)这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号(FL)测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号;

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件(滤光片、双色分光镜等)，可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1 、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度(如FL2-W)常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号(FL2-A)与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”(gate)方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号(FL2-W)要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理(图示见上)

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液

2 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。 检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

(二)FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个/秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。 第二节 数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个(字或双字)。同时当只检测1 个参数时(如DNA)，可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、 参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

(一)单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度(FSC、SSC、FL

1、FL2)四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

(二)双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。 在二维图中，任选FSC、SSC、FL

1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体;X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。 在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

(三)二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

(四)三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL

1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

(五)流式细胞仪的多参数分析--------- 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。 第四节 流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液;

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml;

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底;

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色;

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。 外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存：

3 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法(金属网引起细胞破碎)

深低温保存法(一年) 酶处理法(选择最适宜消化酶)

乙醇或甲醇保存法(2周) 化学试剂处理法(导致细胞成活率降低)

甲醛或多聚甲醛保存法(2月) 表面活性剂处理法 注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存;

2、根据实验目的选择最隹的固定方法;

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法;如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法;往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞;

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数;②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL) F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收;④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差;⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度(激发波长)的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长(发射波长)的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器;APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质; 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管(即PMT1);PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管(即PMT2);PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管(即PMT3 或PMT4),等等

常用的几类荧光染料

(二)免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合

共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。

4 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

(一)单细胞悬液制备的质控

(二)免疫荧光染色的质控 适当的制备方式(不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等)

温度 试剂选择

pH 样品处理(蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等)

染料浓度 实体组织来源标本用机械法

固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2

(三)仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异(CV)。 PMT(光电倍增管)校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 绝对计数校准: 保证计数的准确性。

(四)免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。 第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞(CD34+细胞)的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。 荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比;

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比;

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ;G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。 在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。 DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。 增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------(1)、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3(caspases-3)

-------(2)晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析;DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰

第五篇：6轴流式流体机械的叶轮理论

对于轴流式流体机械，同样可采用欧拉方程来分析，但由于轴流式流体机械的叶轮数较少，叶片间的流道较宽，分析其实际能头时，要做很多修正。因而，其叶轮理论一般是用机翼理论来分析

§6-1基本名词术语 1.叶轮轮毂半径rh 2.叶片外缘半径rt

3.基元(基元级)叶片：在叶片的任意半径r及r+dr处将两个同心圆柱面切开，则这两个面之间的部分称为基元叶片。

4.翼型：设dr很小，基元叶片展开成平面，其中一个叶片的翼型断面 5.工作面：翼型凹面——正压力面 6.背面：翼型凸面——负压力面

7.翼型中线(骨架线骨线)：翼型两面间内切圆圆心的连线 8.翼弦和弦长：中线端点的连线，长度L称为弦长

9.前缘点和后缘点：中线有两个端点，迎着来流方向的端点另一端点称为后缘点，翼型前缘是圆滑的，后缘是尖锐的

10.前驻点和后驻点：来流接触翼型后开始分离的点称为前驻点，绕流翼型后在后端会合的点称为后驻点

11.翼型厚度：与骨线垂直的翼形两面间的距离，max—最大厚度

maxl

fmaxl12.挠度：翼型中线与翼弦的距离f，f

bl13.翼展：垂直于纸面的翼型长度称为翼长或翼展b，相对翼展

14.前缘方向角：翼型前缘点处中线的切线与翼弦所形成的夹角x1 15.后缘方向角：翼型后缘点处中线的切线与翼弦所形成的夹角x2 16.翼形弯曲角：x1x2y2y1

17.叶栅：相同翼型等距排列的翼型系列 18.叶栅列线：叶栅中各翼型的相对应点的连线 19.平面直列叶栅：叶栅列线为直线

20.栅距：两相邻翼型在叶栅列线方向上的距离t，t2r/z r—为圆柱切面的半径 z—为叶片数

21.叶栅稠密度：弦长l与栅距t之比

tl22.冲角：来流w与弦的夹角称为冲角 23.正冲角：冲角在翼弦以下(工作面迎着来流) §6-2机翼和叶栅的升力理论

一、弧立翼型的升力理论 ①升力Fy:垂直于w ②阻力Fx:平行于w

FyCw2y2blFw2

xCx2bl③Cy—升力系数 与断面形状，冲角，表面粗④Cx—阻力系数

糙度雷诺数

—滑翔角

⑤升阻比tgFx1FyCyFytgFxC

x

切线与纵坐标的夹角为min，tgmin取最小值时，升阻比最大

二、叶栅

1.速度

已知：Q,A,,D,n 对于等半径的叶栅： 圆周速度u1u2u 相对速度的轴向分速

w1mw2mwmcmQA

wmwuwu2wtgww2u1u22wmw1uw2u2cmcm2ccu2uu122

ucu1cu22wuw1uw2u2w1ww2cmc1c212w1uw2uu

2.动力学基本方程式——叶栅

①作用在基元上的力有升力dFy，和阻力dFx其合力为dF ②dF与圆周方向一夹角为90()

③dF的圆周分量为dFudFcos90dFsin() ④使翼型dr转动的推动功率

dPudFsin()

⑤叶片数为Z，则所需总功率

ZdPzudFsin()

⑥流经dr段的流量为dQT，则功率为

dQTHTzudFsin()dFdFycosCy,dFyCyw22bdrdQTZtdrcmHTHTsin()lu2w2gtcmcos22Cy1ucmsin2gtcmsin()cosg,cmw/sin

HTCyltu(cu2cu1)g2cuwwucusincossincoscossin12cu1tg/tg当叶轮以角速度ω转动时，由于叶轮内外半径的不同引起内外断面处圆周速度的不同，而希望内外断面所产生的能头相同，否则形成二次回流，由欧拉方程知

u2外cu2外gu2内cu2内gu2外u2内cu2外cu2内由于c2m内c2m外QA

2外2内扭曲叶片cm2c2外cm2外c2内cm2内w2内y2内cu2内cu2外

y2外u2内u2外+2-2oo0o