菌种生化反应检查标准操作规程

菌种生化反应检查标准操作规程（共3篇）

篇1：菌种生化反应检查标准操作规程

菌种生化反应检查标准操作规程

依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。

目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。

原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。

吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。

甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。

V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。

内容：

1材料、设备

1．1 材料：

1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。

1．1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1．1．3 试剂

蛋白胨

氯化钠NaCl分析纯

葡萄糖C6H12O6分析纯

溴麝香草酚兰C27H28Br2O5S分析纯

对二甲基氨基苯甲醛C9H11NO分析纯

戊醇C5H15O分析纯

浓盐酸HCl分析纯

甲基红C15H15N3O2分析纯

无水乙醇CH3CH2OH分析纯

氢氧化钠NaOH分析纯

氢氧化钾KOH分析纯

α-萘酚C10H7OH分析纯

硫酸镁MgSO4•7H2O分析纯

磷酸氢二钾K2HPO4分析纯

磷酸二氢铵NH4H2PO4分析纯

枸椽酸钠C6H5Na3O7·2H2O分析纯

琼脂粉分析纯

1．2 器皿

盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。

1．3 仪器、设备

PH计PHC-3C型上海大中分析仪器厂

电子秤ES-200A型沈阳腾龙电子仪器公司

电子天平ACS太原

恒温培养箱HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂

水浴箱6 LiterLKB

生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂

1．4 其它材料

硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球（1ml及10ml）玻棒、接种环、透气栓。2方法

2．1 准备工作

2．1．1 工作环境：在十万级洁净室内进行，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。

2．1．2 器皿清洁要求

经本室洗刷间处理烤干后用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，经121.3℃，60分钟高压蒸汽灭菌备用。

2．1．3调试仪器设备

2．1．3．1 确认PH计运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．2 确认电子秤运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．3 确认电子天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．4 确认培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。

2．1．3．4 确认水浴箱运行状态良好。已挂有“备用”标志牌。

2．1．4溶液及培养基的配制：

2．1．4．11N NaOH 100ml

摘下电子秤“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。

用电子秤称取NaOH 4克，加注射用水80ml溶解，用量筒定容至100ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．21%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml

摘下电子天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。用电子天瓶称取1克溴麝香草酚兰，加1N NaOH 1.6ml，加注射用水定容至100ml。置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．30.4%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml

用电子天平称取溴麝香草酚兰0.4克加1N NaOH 0.64ml，加注射用水至100ml装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．4 95%乙醇500ml

量取475ml无水乙醇，加注射用水定容500ml，装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．5 甲基红试剂 500ml

用电子天平称取甲基红0.1克，溶于95%乙醇300ml，然后加注射用水定容至

500ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．6 枸氏试剂 100ml

摘下水浴箱“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，设定56℃，预热。用电子天平称取对二甲基氨基苯甲醛5克，加入到75ml戊醇内，置于56℃水浴中，不断摇动使其溶解，取出冷却后徐徐滴入浓盐酸25ml，滴加时随滴随摇，以免骤热。放置一夜，即成淡褐色透明液体，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，保存于冷暗处或冰箱内。

2．1．4．7 40%氢氧化钾溶液100ml

用电子秤称取40克KOH，充分溶于80ml注射用水，补足体积至100ml，摇匀，盛于250ml试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期、放室温待用。

2．1．4．8 6% α-萘酚酒精溶液100ml

用吸管吸取6mlα-萘酚，用无水乙醇定容至100ml，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．9 75%乙醇的配制

取无水乙醇75ml，用注射用水定容至100ml，混匀，装入250ml试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、体积、批号、日期。室温备用。

2．1．4．10 培养基的配制

2．1．4．10．1 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）1000ml：

摘下pH计“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用电子秤称取蛋白胨10克，NaCl 5克，加入800ml注射用水，混匀，调PH值7.4-7.6，定容1000ml，115.6℃，30分钟高压灭菌。

2．1．4．10．2 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和U-P试验用）1000ml

用电子秤分别称取蛋白胨5克，葡萄糖5克，磷酸氢二钾5克，加800ml注射用水，混匀，调PH7.2-7.4，定容1000ml，115.6℃，30分钟高压灭菌。

2．1．4．10．3 枸椽酸盐培养基1000ml

用电子天平分别称取NaCl5克，MgSO4·7H2O 0.2克，磷酸氢二钾1克，磷酸二氢铵1克，枸椽酸钠2克，琼脂20克，溶于注射用水1000ml，调PH6.8-7.2，加入1% BTB指示剂10ml，摇匀，115.6℃，30分钟高压灭菌。

2．2操作步骤

2．2．1 吲哚试验

2．2．1．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，吹30分钟。在生物安全台内，将蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管，每管2ml。用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌接种于蛋白胨水培养基中，盖上透气栓。

2．2．1．2 于37℃恒温培养箱中培养48小时后取出，每管加2-3滴枸氏试剂，轻轻振摇，使戊醇分散于液体中，将培养物静置，待戊醇升至培养液面后，如有吲哚存在，就可以被提取在戊醇层中，反应呈玫瑰红色者为阳性，以“+”表示，仍呈黄色者为阴性以“-”表示。

2．2．2 甲基红试验

2．2．2．1 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基分装于灭菌中试管中，每管2ml。用接种环（火焰灭菌，冷却后）接种细菌于葡萄糖蛋白胨水培养基中，用透气栓盖好。

2．2．2．2 37℃恒温培养箱培养2-3天后，取出滴加甲基红试剂2-3滴，可立即观察，显现红色为阳性，用“+”表示，否则为阴性，用“-”表示。

2．2．3 V-P试验

2．2．3．1 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管中，每管2ml。用接种环（火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该培养基中，用透气栓盖好。

2．2．3．2 37℃恒温培养箱培养2-3天取出后，在每管中加入0.4ml 4%的KOH和1ml 6% α-萘酚酒精溶液，混匀，室温下静置5-15分钟，如出现红色为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。

2．2．4 枸椽酸盐利用试验

2．2．4．1 将灭菌后的枸椽酸盐培养基冷却至50℃左右，在生物安全台中用吸管分装于试管中，每管5ml，倾斜放置。斜面培养基冷却后，用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该斜面培养基中，用透气栓盖好。

2．2．4．2 37℃恒温培养箱中培养24小时，观察，有菌生长，培养颜色由绿

变为深兰者为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。

工作场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。结果判定

3．1判定标准

吲哚、甲基红、U-P及枸椽酸盐利用四项试验，合称为IMVIC试验，鉴别大肠杆菌的结果应为“++--”。

3．2判定结果

判定结果经二人复核，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。

4清场

4．1配液清场

4．1．1称取药品之后将药品瓶盖好，放回药品柜中。

4．1．2将电子秤、电子天平和PH计切断电源后，清洁干净，放回原处，填写使用记录，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。生物安全台，用75%酒精棉擦拭台内，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。

4．1．3清洁操作台面，用专用抹布擦净。

4．1．4地面用专用拖布拖净。

4．2操作清场

4．2．1试验完毕，含细菌的中试管121.3℃，60分钟高压灭菌。

4．3 清场结束后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，挂上“清场合格”标志牌，并填写清场记录。注意事项

5．1 各种培养基的标识一定要醒目，以免判定时失误。

5．2 清场时，必须将带菌的器皿先送高压灭菌处理后，再送洗刷组处理。

5．3 所有工作均应经二人复核，并及时填写工作记录。

篇2：菌种生化反应检查标准操作规程

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目

菌种传代操作规程

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审

核

批

准

制订日期

审核日期

批准日期

颁发部门

质量部

生效日期

分发部门

化验室

一、目的：为使菌种传代操作规范化、制度化，故建立此规程

二、适用范围：菌种传代须按本规程执行。

三、责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。

四、正文：

1、培养基的制备

按微生物限度检查用稀释剂、培养基配制操作规程及斜面配制操作规程配制好相应培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、用胰酪大豆胨琼脂斜面培养基，白色念珠球菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，制备好的培养基预培养48小时后，确认无菌落生长方可使用。

2.菌种传代

2.1菌种传代前应准备好适于该菌种生长的培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护的生物安全柜内进行。

2.2点燃酒精灯，在火焰上部操作，将原有的菌种斜面（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管）持在左手拇指、食指及中指之间，菌种管在前，接种管在后，使试管内斜面向上，两支试管口平齐，应斜持试管呈45°角，以免管底凝集水浸湿培养基表面。用右手在火焰旁转动两支试管胶塞，以便接种时易于拨取。再用右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上灼烧。将接种环烧红约30s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，以彻底灭菌。用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔除两支试管的胶塞，持住。在将试管口在火焰上通过以杀灭管口的细菌，但勿烧的过热，将烧灼的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养

GMP管理文件

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菌种传代操作规程

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基上，如有溶印则表明接种环未冷却，待冷后，再从斜面上挑取少许菌苔。取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上由下而上划

“Z”字型曲线，当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上胶塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的胶塞。最后将接种环烧灼灭菌放置备用。

3.培养

将以上接种好的各菌管放入相应温度的培养箱内，白色念珠菌放入23-28℃培养箱内培养24-48h，黑曲霉放入23-28℃培养箱内培养5-7天，其它菌种放入30-35℃培养箱内培养18-24小时。

4.保存

除铜绿假单胞菌需室温保存外，将其它传代培养后的菌种应放入4-6℃的冰箱冷藏保存。

篇3：菌种生化反应检查标准操作规程

1 标准操作规程中涉及的医学术语定义

药品不良反应:是指合格药品在正常用法用量下出现的与用药目的无关的或意外的有害反应。药品不良反应报告和监测:是指药品不良反应的发现、报告、评价和控制的过程。新的药品不良反应:是指药品说明书中未载明的不良反应。药品严重不良反应:是指因服用药品引起以下损害情形之一的反应: (1) 引起死亡; (2) 致癌、致畸、致出生缺陷; (3) 对生命有危险并能够导致人体永久的或显著的伤残; (4) 对器官功能产生永久损伤; (5) 导致住院或住院时间延长。

2 制定标准操作规程的依据和组织

根据《中华人民共和国药品管理法》、《药品不良反应报告和监测管理办法》、制定本规程。药事管理委员会负责全院药物不良反应 (ADR) 监察工作的组织、计划、实施和协调等工作。

3 药品不良反应上报程序

3.1 组织机构

医院设立药品不良反应监测小组, 由分管院长任组长, 医务处主任、药械科主任任副组长, 秘书1名由药械科指定人员担任, 门诊药房、中心药房主管及各临床科室高年资医师任组员兼联络员, 药械科为ADR监测工作运作的常设部门。

3.2 工作职责

3.2.1 ADR报告和监测管理小组秘书职责:

(1) 把ADR监测工作列入单位年度目标管理考核中, 并对本单位ADR监测工作开展情况进行评价、总结, 每年>1次; (2) 一般ADR每季度集中向江苏省药品不良反应监测中心报告; (3) 新的、严重的ADR于发现之日起15d内报告, 死亡病例须及时报告。

3.2.2 医务处职责:

(1) 督促医师认真详细地填写药品不良反应报告表, 并向医师宣传药品不良反应报告和监测管理办法; (2) 组织相关专业人员对发生严重不良反应的药品进行分析、评价, 必要时采取相应控制措施, 以防止损害继续扩大; (3) 组织相关专业人员对发生严重不良反应的病患实施必要的救治。

3.2.3 药剂科职责:

(1) 制定药品不良反应相关知识的宣传、培训计划, 在本单位开展宣传、培训活动; (2) 安排药品不良反应报告与监测管理小组联络员进行具体的药品不良反应数据收集、整理、上报等日常工作; (3) 组织临床药师参与主任医师查房、病例讨论、药物治疗方案制定、和建立患者药历, 及时主动的发现ADR; (4) 若遇热源反应或危机生命的ADR, 应将药品留样并保存于冰箱, 切勿冷冻。

3.2.4 兼职联络员职责:

(1) 对可疑发生ADR的患者 (住院) 身体情况进行记录, 严重者应立即告知医师处理, 紧急情况 (包括严重的, 特别是致死的不良反应) , 应以最快通讯方式将情况报告药械科, 并填写《药品不良反应/事件报告表》; (2) 护理人员也可填写《药品不良反应/事件报告表》; (3) 及时《药品不良反应报告表》送至临床药学研究室。

3.3 我院病患发生ADR后的处理流程

我院发生ADR后, 严格按照本规程中所涉及的职责, 高效的完成不良反应的上报, 见图1。

4 文档管理

我院所有发生药品不良反应的病例资料严格保存, 秘书负责文档存取, 办理借阅和返还手续, 文件存档5年。

5 结论

药物是一把双刃剑, 在发挥对疾病治疗的同时, 也可能出现与治疗作用无关的不良反应[1]。因此, 制定一个适合自己医院的不良反应的标准操作规程对安全、经济、有效及合理的应用药物, 最大程度的避免和减少ADR发生具有重要的意义。近年来, 各家医院都在通过规章流程建设、宣传培训等全方位对药品不良反应上报的探索和实践, 不断优化上报流程, 取得了积极成效[2]。标准操作规程一经制定就具有内部法规性质, 所有相关工作人员必须知晓并严格按标准执行, 同时完善药品信息;定期编撰医院药讯, 介绍药政法规、合理用药知识、ADR、常用药品及新进药品的规格、用法用量、适应证、配伍禁忌及注意事项等, 让临床科室上报的不良反应更具有针对性和规范性[3、4]。因此, 只有严格执行了标准操作规程, 才能使的我院上报不良反应更加的规范、高效、有序。

关键词：不良反应,标准操作规程,药品

参考文献

[1] 江滨, 顾俊, 史录文.中国药品不良反应监测的现状及发展策略[J].中国药事, 2005, 19 (2) :84-85.

[2] 陈超, 郭代红.医疗机构药品不良反应监测的优化实践[J].中国药物警戒, 2010, 7 (3) :164-166.

[3] 孙锐, 陈邦元.我院2010-2012年度167例药品不良反应报告分析[J].中国疗养医学, 2013, 22 (6) :546-547.