观赏灵芝菌种组织分离技术研究

2022-09-11

灵芝 (Ganoderma lucidum) 隶属于非褶菌目灵芝科灵芝属, 种类较多, 已报道的有200余种[1]。在灵芝的栽培过程中, 通过控制温度、光线、空气等环境条件, 可以培养出形态各异、颜色多变的子实体, 也可以制作灵芝盆景, 具有较强的观赏性[2]。菌种是观赏灵芝生产的首要条件, 如何获得优良的菌种直接影响到生产的成败。试验采用子实体组织分离法获得观赏灵芝菌种, 通过镜检和出菇试验验证菌种质量, 提出适宜观赏灵芝的母种培养基与培养条件, 为分离菌种和种质资源的搜集提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采自位于重庆市沙坪坝区凤凰镇的重庆市金琼农业股份合作社, 观赏灵芝采用塑料小袋栽培, 采集头潮菇、外观典型、菌盖表面颜色由白色渐变为浅黄色的单朵菇作种菇。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离

采用子实体组织分离法。

1.2.1.1培养基配制

马铃薯综合培养基作为母种培养基, 配方为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂条18 g、KH2PO43 g、Mg SO41.5 g、VB110 mg、水1000 m L, 具体制作方法如下。

将马铃薯洗净、去皮、挖掉芽眼, 切成大小均匀的小块, 称取200 g, 用小锅加入约1700 m L水, 烧开后放入马铃薯小块, 文火煮20 min。琼脂条剪成小段, 放入马铃薯汁中文火煮熔, 煮熔时间5 min左右, 期间适当搅拌, 防止糊锅。用4层预湿的纱布过滤取汁, 用烧杯量取滤液1000 m L, 加入配方中其他营养物质, 充分搅拌均匀, 趁热用三角瓶和试管分装, 分别用封口袋和棉塞、牛皮纸封口, 然后置高压灭菌器中控温121℃下灭菌, 灭菌时间25 min, 趁热取出试管在工作台上倾斜排放, 摆成斜面备用。

1.2.1.2种菇消毒

按无菌操作要求, 将种菇放入75%酒精溶液中, 浸泡40 s左右, 不断翻动以充分杀死种菇表面的杂菌。用火焰烧除种菇表面附着的酒精, 待火焰自然熄灭。

1.2.1.3组织挑取

将种菇放在培养皿中的灭菌脱脂棉上, 用消过毒的解剖刀在芝盖与芝柄中部纵切一刀, 撕开后在芝盖与芝柄交接处的菌肉上用解剖刀横竖划些口子, 挑取0.2~0.5 cm见方的小块组织进行培养。

1.2.1.4菌丝培养与纯化

将小块组织接在平板培养基上, 置于培养箱中在恒温26℃、避光下培养菌丝, 经过2 d的培养, 可以看到组织块上萌发白色、绒毛状的气生菌丝, 挑取生长快、整齐、浓而健壮的菌落前端的菌丝, 转接至新的马铃薯综合培养基平板上纯化2次, 最后挑取菌丝接种至斜面培养基, 培养至菌丝长满试管斜面, 获得观赏灵芝母种。

1.2.2 菌丝显微观察

用三角瓶按蒸馏水150 m L+琼脂粉2.7 g, 摇匀封口, 在恒温121℃下灭菌20 min, 制作蒸馏水培养基。将分离到的母种接至平板蒸馏水培养基上, 置培养箱中在恒温26℃、避光下培养菌丝, 培养4 d, 在接种点周围可以看到稀疏的菌丝体, 用接种针挑取菌落边缘的基内菌丝, 制作水镜片, 然后在光学显微镜下观察菌丝的形态。

1.2.3 菌丝生长长度测量

将母种菌丝转接至平板培养基上, 置培养箱中培养菌丝, 培养条件是避光、温度26℃, 每日测量菌落的直径, 计算菌丝每日生长长度。

1.2.4 出菇试验

将分离获得的母种扩大繁殖, 移接培养成原种, 做出菇试验。采用20 cm×45 cm折角袋, 培养料配方为棉籽壳40%、木屑40%、玉米粉6%、麸皮6%、米糠6%、蔗糖1%、石膏粉1%, 培养料含水量60%, 出菇试验菌袋数量30袋, 在适宜的条件下发菌, 观察子实体的特征与主要性状。

2 结果与分析

2.1 菌落形态观察

菌种质量鉴定一般从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、均匀度、显微镜下菌丝形态观察、出菇试验等方面进行鉴定。按“1.2.1菌种分离”获得观赏灵芝菌种, 在马铃薯综合培养基上, 菌丝长势旺盛, 气生菌丝洁白纤细、致密均匀, 菌落生长整齐。

2.2 菌丝形态观察

光学显微镜下观察菌丝的形态 (图1) 可以看到, 分离到的菌丝透明、纤细、粗细较均匀, 菌丝向不同的方向发出分枝, 在单条菌丝上有多处喙状突起, 具有明显的锁状联合结构, 说明为双核有生殖能力的菌种。

2.3 菌丝生长速度观察

从图2菌丝每日生长长度可以看出, 第1天、第2天菌丝生长非常缓慢, 生长速度分别为1 mm/d和2mm/d, 第3天起菌丝的生长速度逐渐加快, 到第8 d和第9天, 菌丝生长速度最快达15 mm/d, 此时菌丝生长旺盛, 活力最强。之后菌丝的生长速度明显减缓, 第10天、第11天生长速度分别为12 mm/d、9 mm/d, 肉眼观察菌丝更加浓密, 菌苔变得更厚。

2.4 出菇试验

从接种至菌丝长满培养袋需要22~24 d, 菌种成活率达到100%, 菌丝浓白健壮, 生长整齐。从图3可以看到子实体具有灵芝特有的观赏形态与色泽, 菌盖半圆形或近圆形, 横径2~16 cm, 菌盖厚1~2 cm, 盖面颜色出菇初期为乳白色, 后渐变呈乳黄、淡黄, 成熟子实体为黄色褐, 有明显的同心环带和环沟, 表面有油漆状光泽。菌柄侧生, 近圆柱形, 粗2~4 cm, 长5~14 cm, 表面有与菌盖一样的油漆状光泽。出菇试验是最实际的菌种质量鉴定方法, 试验表明分离到的菌种种性纯、活力强, 可以作为栽培菌种使用。

3 讨论

子实体组织分离法是生产中常用的菌种分离方法, 能否获得优良的原生母种与培养基的营养、水分、酸碱度等有关, 也与培养时间、温度、光线等是否适宜有着十分密切的关系[1]。观赏灵芝是木腐性菌类, 适宜菌丝生长的栽培基质p H值4.5~5.2, 主要营养物质是碳水化合物和含氮化合物, 同时也需要少量的无机盐、维生素等。从试验结果来看, 马铃薯综合培养基C/N比、p H值等能够满足观赏灵芝组织块萌发菌丝及菌丝生长需要的培养条件。母种培养基有很多种配方, 试验中还采用PDA培养基、木屑煮汁培养基、子实体煮汁培养基作母种培养基分离到观赏灵芝菌种, 通过长势观察, 马铃薯综合培养基更适合作观赏灵芝组织分离的母种培养基。

从培养的环境条件来看, 种菇组织块在培养箱中培养, 培养条件为避光、温度可控制在25~28℃, 培养时间约2 d, 组织小块上萌发出稀疏的菌丝;挑取生长快、整齐、浓而健壮的菌落前端的菌丝, 转接至新的马铃薯综合培养基平板上纯化2次, 最后挑取菌丝接种至斜面培养基进行培养。接种后第3天菌丝开始快速生长, 长势良好, 整齐浓密;经过8~9 d培养, 生长速度最快达15 mm/d, 此时菌丝生长旺盛、活力最强, 宜作栽培用种。

摘要：试验采用子实体组织分离法获得观赏灵芝菌种, 验证了马铃薯综合培养基适合作观赏灵芝菌丝生长的母种培养基, 培养条件是避光培养、温度2528℃, 镜检和出菇试验表明, 菌丝长势良好, 整齐浓密, 生长速度较快, 最快达15 mm/d, 经过89 d培养后的菌丝活力最强, 宜做母种使用。

关键词：观赏灵芝,菌种,子实体,组织分离,马铃薯综合培养基