微生物菌种纯度检测技术规程

2024-04-26

微生物菌种纯度检测技术规程（精选7篇）

篇1：微生物菌种纯度检测技术规程

微生物菌种纯度检测技术规程范围

本规程规定了古菌、细菌、真菌、病毒（种）纯度检测的程序和方法。

本规程适用于从事微生物菌种资源保藏及研究的机构、大学、企业、个人等。术语、定义

下列术语和定义适用于本规程

2.1

纯度检测 purity check

指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。

2.2

纯培养pure culture

由单个细胞的后代组成的培养物，即单细胞培养物或无性繁殖系。通常是由挑取单个菌落或利用单胞分离技术，移种繁殖获得。菌种的纯度检测

3.1 古菌和细菌的纯度检测

3.1.1 菌落形态

在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

3.1.2 细胞形态

对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜等特征应相似

3.1.3 芽孢大小、位置、形状

宜检测样品是否形成芽孢，对形成芽孢的菌种，其芽孢大小、位置、形状应相似。

3.2 放线菌菌种纯度检测

3.2.1 菌落形态

在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线,挑取单菌落，适宜培养后，在同一平板上单菌落形状、大小、表面状况、质地、光泽、颜色等应相似。如怀疑为细菌污染，则30℃液体培养24小时，培养液不应浑浊，如浑浊则视为细菌污染。

3.2.2 培养特征

分别接种三种以上培养基，在三种以上培养基上的培养特征应想同，包括气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色等。

3.2.3 孢子丝及孢囊

在特定的培养基、培养温度及培养时间等条件下，孢子着生方式、孢子丝形态及其颜色或孢囊着生位置（气丝或基丝）、孢囊的形状，大小应呈现出一致性。

3.3 酵母菌种纯度检测

3.3.1 菌落形态

应对菌落形态相似性进行检测。在特定的培养基上，通过对待检测菌株进行稀释或划线涂布平板获取单菌落，一定的培养条件下，比较同一平板内，菌落的大小、形状、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽等应一致。

3.3.2 个体形态

应对检测样品的个体形态进行检测。在指定的培养基及培养条件下，细胞形状、大小及细胞的增殖方式应一致。

3.3.3 繁殖方式

酵母繁殖的方式应一致，如是芽殖，出芽的方位、数量应一致。

3.4 丝状真菌菌种纯度检测

3.4.1 菌落特征

菌落的形态等表观特征应一致。

3.4.2 菌丝特征

在特定的培养基和培养条件下，菌丝分隔、菌丝形态等应一致。

3.4.3 其他主要显微特征应一致

3.4.4 检测是否有细菌污染

3.4.5 对于外观上不能确定菌种纯度的，利用单胞分离技术获得纯培养物进行对比，其菌丝、孢子等特征应与原始菌株的描述一致。

3.5 病毒的纯度检测

3.5.1 纯粹检查

应将待检病毒液直接接种含硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪蛋白胨琼脂培养基（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤。通过一定温度时间培养后，检查结果应无细菌生长为纯粹。

3.5.2 支原体检查

检测由禽胚组织或其细胞所培养的病毒应用改良Frey氏培养基。检测其它培养方法所得病毒应用支原体培养基。任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判为阳性。阳性对照中至少有一个平板长菌落，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效。

3.5.3 外源病毒检查

病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因此，有可能造成外源因子（特别是外源病毒因子）的污染。为了保证制品质量，需要对毒种和细胞进行外源因子检测。

3.5.3.1 病毒种子批外源因子检查

对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行病毒外源因子检测。在试验前应用特异性抗体（血清）中和本病毒（或单克隆抗体），所用的抗体免疫源应采用与生产疫苗（或制品）不同种而且无外源因子污染的细胞（或动物）制品。如果病毒曾在禽类组织或细胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。以下方法可以选择一种或多种进行。

3.5.3.1.1 动物试验法

3.5.3.1.1.1 小鼠试验法

取15－20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5ml。至少观察21天。在观察期内至少有80％最初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所用在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接观察期病理改变，并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和颅腔接种另外至少5只15－20g小鼠，并观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。

3.5.3.1.1.2 乳鼠试验法

取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，脑内接种0.01ml，同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天。在观察内至少有80％最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只出生后24小时内乳鼠，并每天观察至接种第14天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。

3.5.3.1.2 细胞培养法

3.5.3.1.2.1 非血吸附检查

用经抗血清中和后的病毒悬液，接种于生产用的同种的细胞。细胞至少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25％。于36±1℃培养，观察14天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变（CPE）为阴性，符合要求。

3.5.3.1.2.2 血吸附病毒检查

上述接种病毒的各个细胞于第6－8天后和第14天，取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2％－0.5%鸡和豚鼠红细胞混合菌悬液覆盖于细胞表面，分别置于2－8℃，20－25℃，30分钟后显微镜下观察，未见血球吸附现象为阴性，符合要求。

3.5.3.1.3 鸡胚检查法

在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选用9－11日和5－7日龄两组SPF鸡胚，每组至少5只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经抗体血清中和后的病毒悬液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡血细胞混合悬液做血球凝集试验应为阴性。被接种的鸡胚至少80％存活7天，试验有效。

3.5.3.2 生产用细胞外源因子检查

3.5.3.2.1 细胞直接观察

每批生产用细胞应留取5％（或不少于500ml）,细胞悬液不接种病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置于与疫苗生产相同的条件下培养，观察14天，在显微镜下观察是否有细胞病变（CPE）出现，无细胞病变（CPE）出现者为阴性，符合要求。在观察期末至少有80％的对照细胞培养物存活，试验有效。

3.5.3.2.2 血清吸附病毒检查

对生产用细胞外源因子检查的（1）项细胞培养物在观察期末取至少25％的细胞培养瓶进行血吸附病毒检查。（方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒检查）

参考文献

[1] 刘志恒，姜成林主编.放线菌现代生物学与生物技术.北京：科学出版社,Pp1-353.2004

[2] 杨苏声主编.细菌分类学.北京：中国农业大学出版社,Pp1-145.1997

[3] 沈萍，彭珍荣主译.《微生物学》，第五版，中文版,高等教育出版社，2004

[4] 中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌.北京：科学出版社,P1-317，1978

[5] 中国科学院微生物研究所《菌种保藏手册》编著组.菌种保藏手册.北京：科学出版社,P1-839，1980

[6] David R.Boone et al.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Second Edition.Volume One.Springer.2001

[7] Kirk P.M., P.F.Cannon, J.C.David and J.A.Stalpers(ed).Dictionary of the Fungi.9th edition.CABI Publishing.2001

篇2：微生物菌种纯度检测技术规程

基本信息

【英文名称】Technical inspection of pure culture making of edible fungi 【标准状态】被代替【全文语种】中文简体【发布日期】2002/8/27 【实施日期】2002/12/1 【修订日期】2002/8/27 【中国标准分类号】暂无【国际标准分类号】暂无

关联标准

【代替标准】暂无【被代替标准】暂无

【引用标准】GB 4789.28-1994,GB 9687-1988,GB 9688-1988

适用范围&文摘

篇3：微生物菌种纯度检测技术规程

关键词：微生物,菌种保藏,管理,电子标签

微生物资源由于其具有的极大地开发潜质与经济价值, 已逐渐引起了越来越多的关注。掌握关键的微生物资源已成为企业, 甚至是国家的重要战略储备, 我国先后建立了中国普通微生物保藏管理中心 (CGMCC) 、工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC) 、医学微生物菌种保藏管理中心 (CMCC) 等保藏机构。而微生物资源中, 可用于药物研制及医学研究的微生物更有特殊价值与地位。随着现代生物技术如基因工程、蛋白质工程、组合生物合成在微生物研究中的深入, 及大量新的病原微生物的出现, 传统的菌种保藏技术和管理方法逐渐显现出其局限性, 这一形势迫切地要求我们提高工作效率。此外, 我们还要考虑到微生物菌种保藏的特殊要求及管理安全, 对操作人员有着极高的要求。而电子标签 (RFID) 技术的引入恰恰为解决当前困难提供了一条有效的途径。随着当今微电子技术的迅速发展, 使设备得到小型化, 可靠性大大提高。本文着重综述了RFID技术的工作原理, 及其在微生物菌种保藏中的作用和优势, 并进一步深入探讨该技术在这一领域的发展前景。

一、RFID技术

1. RFID技术介绍。

Radio Frequency Identification (RFID) [1], 即射频识别技术, 也就是电子标签技术的俗称, 是一种非接触式的自动识别技术, 它通过射频信号自动识别目标对象并能获取相关数据[2,3]。例如生产生活中使用到的IC卡 (Integrated Circuit Card) 就是这一技术的应用实例。其发展始于1937年U.S.Naval Research Laboratory (NRL) 开发的敌我识别系统。1999年美国麻省理工学院MIT成立AUTOID CENTER (现发展为Auto-ID实验室, 总部设于MIT, 其余5个会员单位为英国剑桥大学、澳大利亚阿德莱德大学、日本庆应大学、中国复旦大学和瑞士圣加仑大学) [4], 提出EPC (Electronic Product Code) 概念并以RFID电子标签为载体为每一物理实体提供唯一标识, 使RFID技术得到极大发展。现今RFID系统在货物跟踪管理, 医药管理, 交通系统以及门禁系统等方面发挥了越来越重要的作用, 为物流供应链管理提供了最便捷有效的实施方案。相较于以往解决方案, RFID技术具有可以识别单个具体的物体、可以透过外部材料读取数据、可以同时对多个物体进行识读、其识别工作无须人工干预, 可识别高速运动物体并可同时识别多个标签, 操作快捷方便等优势被公认为本世纪最有发展前途的10项技术之一。

2. RFID技术实现。

基本电子标签系统由三部分组成:标签 (Tag) , 阅读器 (Reader) 和天线 (Antenna) 。RFID基本工作原理:标签进入磁场后, 接收解读器发出的射频信号, 凭借感应电流所获得的能量通过天线结构发送出存储在芯片中的产品信息即信号, 或者是有源标签会主动发送某一频率的信号;解读器通过读取经过前级滤波器滤去噪音信息并解码后, 送至中央信息系统进行有关数据处理。再通过外设给予操作人员反馈[5]。

二、医药微生物菌种保藏管理

1. 医药微生物菌种保藏的特殊要求[6]。

药物开发和医学研究的微生物的菌种保藏有其特殊要求, 由于我们是利用其特殊的代谢产物对特定疾病产生治疗作用, 那么我们就会要求这些特殊的性状需要稳定的保存, 才能进行大规模生产, 或者供研究之用, 即预防菌种退化的发生。一些特殊情况下, 甚至需要一些极端条件去保存样品。并且实验人员因此还要经常性的关注菌种保藏中菌种的变化, 防止其失去药用的价值。此外, 处于公共安全的考虑, 防止可能的有害微生物在实验室外的传播, 实验室内外的物品也不应接触。

2. 传统保藏技术和管理的不足。

传统保藏中, 主要采取人工的方式对样本进行观察和监控, 而对于保存的大量样本, 则单靠人力的方式, 即使付出很多人员的代价也不易对所有样本的状态都有良好的把握。另外在实验室大量保存的样本中找到所需菌种就需要耗费大量时间。此外采取传统纸质, 或者手工输入电脑对样本进行管理的方式, 对样本信息的记录是有限的, 因此有可能产生人为的疏忽, 造成样品的损坏或者失效。和当今在其他行业广为使用的高效的信息化管理技术相比, 会有时间上的滞后。

3. ID技术的引入。

对传统药用微生物保藏和管理方法中的种种不足, RFID技术的引入提供了一系列的解决方案。 (1) 便捷:用RFID技术将给实验室中的每一个样品附上唯一编码, 这种标签有独特的序列代码和足够的存储容量, 存储的内容可以读出、修改和保存, 配套上基于现代信息技术的硬件设备, 实验人员可以随时了解任何一个样本存放的位置, 是否需要进行定时的筛查等基本信息, 现对样本的频繁常规监视, 可以采集更多数据, 改善样本质量, 为样本的提取使用提供了极大地便利。设有防冲突逻辑的标签, 可以一次同时读取多个标签, 其读取率几乎达到100%。例如把托盘放在读取站附近, 一百个标签的读取时间不会超过3秒钟。找出目标样本的位置易如反掌, 为研究人员节省大量时间可想而知。使用RFID技术的方法直观易懂, 不会给操作人员带来其技术上的麻烦。 (2) 安全:疗医药行业是一个不允许出错的行业。对于菌种的保管安全, 有了RFID技术的帮助, 实验人员只需使用读取设备, 快速地对大量样品进行扫描即可确定, 各样品是否都按规定摆放在正确的区域, 保管条件是否妥当。同时若样品被人意图非法携带离开, 电子标签信号也会被门禁拦截, 以防意外的发生。此外, 由于电子标签可存载大量信息, 而纸质标签由于大小受限, 承载的信息也是有限的, 并且省去了人工书写读取的过程, 避免了人为误操作的发生。 (3) 稳定:代的RFID标签尺寸小, 可植入试管顶部, 并承受得住大范围急速的温度变化, 例如样本需要液氮保存的场合, 标签仍然可以工作正常。这种标签也可以承受快速升温的考验。 (4) 系统:标签作为信息化管理系统的硬件载体, 为实验室的全面信息化提供了良好的支持[7]。样品的数据完全可以摆脱纸张记载的束缚, 在实验室的各个终端上无缝流转, 实现无纸化, 为工作效率的提高起到了良好的作用。此外, 借助于信息的迅速传播, 不同实验室甚至可以通过网络直接利用对方的设施进行研究, 实现资源成果的共享, 不仅是经济成本上的大大降低, 也是生产效率上的极大提高。而这一理念也早已在世界范围内众多知名大学, 研究机构在其他领域的开放实验室中开始实践。

三、用发展

1. 内外的应用[8]。

近全球领先的RFID基础设施供应商TAGSYS, 宣布其RFID解决方案已经被四家法国著名医院的实验室 (La Timone、Marseille Medical Faculty、Hospital La Conception、以及Paoli Calmettes Institute) 所采用。专门为制药和医疗部门设计的RFID标签, 满足了该行业严格的安全准确及时的要求, 使用性能可靠高频RFID标签用于跟踪实验室生命攸关的样本。即使在样本日渐增多时, 仍然可以保证数据的正确性和可靠性[9]。Paoli-Calmettes细胞医学中心的主任Dr Christian Chabannon, 对RFID技术的引入表示了极大地肯定, 他认为良好保藏的病理样本是相关病人的生命所系, 也是医生和科学家的珍贵资源。相较于传统的管理方法, 采用RFID识别技术后, 生命科学领域可以说又一次取得突破性进展。与过去的条形码识别技术比较, RFID的优点非常明显。

2. 前景。

于RFID技术在医药微生物样本保存中的引入所取得的可喜成果, 其应用前景也是颇令人期待的。随着微电子技术的不断发展, RFID芯片有望向更小, 更强大, 更经济的方向发展, 使这一技术得到更大范围的普及。伴随自动化技术, 人工智能技术的发展, 我们更可以大大扩展其功能, 与应用的范围。我们可以设想生成全封闭的实验室保藏环境, 利用电子标签对特定样品定位, 来自动控制样本的适宜环境, 营养的补给。通过标签信息, 如同在ATM机上存取操作一样, 从而实现, 以较低的人力代价, 极高的安全系数下对实验样本进行便捷的管理监控。如今这一想法已不仅仅是停留在想象的阶段, RFID技术已经贯穿于整个医药产业链中, 并换发着勃勃的生机。生物医药研发生产作为涉及社会公共卫生安全的行业之一, 必将成为优先应用RFID技术的领域之一[10]。医药行业采用RFID带来的不仅仅是效率, 更是对宝贵生命的保护。

参考文献

[1]游战清, 刘克胜, 吴翔, 林汉宏.无线射频识别 (RFID) 与条码技术[M].北京:机械工业出版社, 2007.

[2]杜云明, 周杨.无线射频识别技术与应用研究[J].自动化技术与应用, 2010, (29) :52-55.

[3]付俊.无线射频识别技术研究[J].山西科技, 2009, (1) :22-23.

[4]王俊宇, 周锋, 王天扬, 闵昊.中国AUTO-ID应用情况调查报告[R].自动识别与应用技术, 2004, (2) :38-40.

[5]Behzad Razavi.RF Microelectronic (s2nd Edition) (Prentice Hall Communications Engineering and Emerging Technologies Series) .2011.

[6]王凤山.生物技术制药[M].北京:人民卫生出版社, 2011.

[7]朱铭.实验室信息系统的日常管理与维护[J].国际检验医学杂志, 2012, (2) :247-249.

[8]庄表微.法国生命科学实验室采用RFID系统[EB/OL].中国物品编码中心网站, 2005-07.

[9]唐慈鑫, 马爱霞.无线射频识别技术:实现药品安全监管的新宠儿[J].上海医药, 2007, (28) :344-345.

篇4：菌种生化反应检查标准操作规程

依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。

目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。

原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。

吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。

甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。

V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。

内容：

1材料、设备

1．1 材料：

1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。

1．1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。

1．1．3 试剂

蛋白胨

氯化钠NaCl分析纯

葡萄糖C6H12O6分析纯

溴麝香草酚兰C27H28Br2O5S分析纯

对二甲基氨基苯甲醛C9H11NO分析纯

戊醇C5H15O分析纯

浓盐酸HCl分析纯

甲基红C15H15N3O2分析纯

无水乙醇CH3CH2OH分析纯

氢氧化钠NaOH分析纯

氢氧化钾KOH分析纯

α-萘酚C10H7OH分析纯

硫酸镁MgSO4•7H2O分析纯

磷酸氢二钾K2HPO4分析纯

磷酸二氢铵NH4H2PO4分析纯

枸椽酸钠C6H5Na3O7·2H2O分析纯

琼脂粉分析纯

1．2 器皿

盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。

1．3 仪器、设备

PH计PHC-3C型上海大中分析仪器厂

电子秤ES-200A型沈阳腾龙电子仪器公司

电子天平ACS太原

恒温培养箱HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂

水浴箱6 LiterLKB

生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂

1．4 其它材料

硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球（1ml及10ml）玻棒、接种环、透气栓。2方法

2．1 准备工作

2．1．1 工作环境：在十万级洁净室内进行，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。

2．1．2 器皿清洁要求

经本室洗刷间处理烤干后用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，经121.3℃，60分钟高压蒸汽灭菌备用。

2．1．3调试仪器设备

2．1．3．1 确认PH计运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．2 确认电子秤运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．3 确认电子天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。

2．1．3．4 确认培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。

2．1．3．4 确认水浴箱运行状态良好。已挂有“备用”标志牌。

2．1．4溶液及培养基的配制：

2．1．4．11N NaOH 100ml

摘下电子秤“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。

用电子秤称取NaOH 4克，加注射用水80ml溶解，用量筒定容至100ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．21%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml

摘下电子天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。用电子天瓶称取1克溴麝香草酚兰，加1N NaOH 1.6ml，加注射用水定容至100ml。置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．30.4%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml

用电子天平称取溴麝香草酚兰0.4克加1N NaOH 0.64ml，加注射用水至100ml装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．4 95%乙醇500ml

量取475ml无水乙醇，加注射用水定容500ml，装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．5 甲基红试剂 500ml

用电子天平称取甲基红0.1克，溶于95%乙醇300ml，然后加注射用水定容至

500ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．6 枸氏试剂 100ml

摘下水浴箱“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，设定56℃，预热。用电子天平称取对二甲基氨基苯甲醛5克，加入到75ml戊醇内，置于56℃水浴中，不断摇动使其溶解，取出冷却后徐徐滴入浓盐酸25ml，滴加时随滴随摇，以免骤热。放置一夜，即成淡褐色透明液体，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，保存于冷暗处或冰箱内。

2．1．4．7 40%氢氧化钾溶液100ml

用电子秤称取40克KOH，充分溶于80ml注射用水，补足体积至100ml，摇匀，盛于250ml试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期、放室温待用。

2．1．4．8 6% α-萘酚酒精溶液100ml

用吸管吸取6mlα-萘酚，用无水乙醇定容至100ml，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。

2．1．4．9 75%乙醇的配制

取无水乙醇75ml，用注射用水定容至100ml，混匀，装入250ml试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、体积、批号、日期。室温备用。

2．1．4．10 培养基的配制

2．1．4．10．1 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）1000ml：

摘下pH计“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用电子秤称取蛋白胨10克，NaCl 5克，加入800ml注射用水，混匀，调PH值7.4-7.6，定容1000ml，115.6℃，30分钟高压灭菌。

2．1．4．10．2 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和U-P试验用）1000ml

用电子秤分别称取蛋白胨5克，葡萄糖5克，磷酸氢二钾5克，加800ml注射用水，混匀，调PH7.2-7.4，定容1000ml，115.6℃，30分钟高压灭菌。

2．1．4．10．3 枸椽酸盐培养基1000ml

用电子天平分别称取NaCl5克，MgSO4·7H2O 0.2克，磷酸氢二钾1克，磷酸二氢铵1克，枸椽酸钠2克，琼脂20克，溶于注射用水1000ml，调PH6.8-7.2，加入1% BTB指示剂10ml，摇匀，115.6℃，30分钟高压灭菌。

2．2操作步骤

2．2．1 吲哚试验

2．2．1．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，吹30分钟。在生物安全台内，将蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管，每管2ml。用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌接种于蛋白胨水培养基中，盖上透气栓。

2．2．1．2 于37℃恒温培养箱中培养48小时后取出，每管加2-3滴枸氏试剂，轻轻振摇，使戊醇分散于液体中，将培养物静置，待戊醇升至培养液面后，如有吲哚存在，就可以被提取在戊醇层中，反应呈玫瑰红色者为阳性，以“+”表示，仍呈黄色者为阴性以“-”表示。

2．2．2 甲基红试验

2．2．2．1 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基分装于灭菌中试管中，每管2ml。用接种环（火焰灭菌，冷却后）接种细菌于葡萄糖蛋白胨水培养基中，用透气栓盖好。

2．2．2．2 37℃恒温培养箱培养2-3天后，取出滴加甲基红试剂2-3滴，可立即观察，显现红色为阳性，用“+”表示，否则为阴性，用“-”表示。

2．2．3 V-P试验

2．2．3．1 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管中，每管2ml。用接种环（火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该培养基中，用透气栓盖好。

2．2．3．2 37℃恒温培养箱培养2-3天取出后，在每管中加入0.4ml 4%的KOH和1ml 6% α-萘酚酒精溶液，混匀，室温下静置5-15分钟，如出现红色为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。

2．2．4 枸椽酸盐利用试验

2．2．4．1 将灭菌后的枸椽酸盐培养基冷却至50℃左右，在生物安全台中用吸管分装于试管中，每管5ml，倾斜放置。斜面培养基冷却后，用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该斜面培养基中，用透气栓盖好。

2．2．4．2 37℃恒温培养箱中培养24小时，观察，有菌生长，培养颜色由绿

变为深兰者为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。

工作场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。结果判定

3．1判定标准

吲哚、甲基红、U-P及枸椽酸盐利用四项试验，合称为IMVIC试验，鉴别大肠杆菌的结果应为“++--”。

3．2判定结果

判定结果经二人复核，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。

4清场

4．1配液清场

4．1．1称取药品之后将药品瓶盖好，放回药品柜中。

4．1．2将电子秤、电子天平和PH计切断电源后，清洁干净，放回原处，填写使用记录，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。生物安全台，用75%酒精棉擦拭台内，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。

4．1．3清洁操作台面，用专用抹布擦净。

4．1．4地面用专用拖布拖净。

4．2操作清场

4．2．1试验完毕，含细菌的中试管121.3℃，60分钟高压灭菌。

4．3 清场结束后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，挂上“清场合格”标志牌，并填写清场记录。注意事项

5．1 各种培养基的标识一定要醒目，以免判定时失误。

5．2 清场时，必须将带菌的器皿先送高压灭菌处理后，再送洗刷组处理。

篇5：沼气生物脱硫工艺及菌种鉴定

1 试验部分

1.1 试验装置

1.2 分析方法

H2S浓度:硫化氢气体检测管;S2-浓度:电位滴定法;p H值:p Hs-25型p H计;气体流量:玻璃转子流量计LZB-4;液体流量:玻璃转子流量计LZB-10;SO42-:铬酸钡光度法, DO:碘量法。

1.3 菌种的筛选培养与挂膜

将污泥上清液接种于液体培养基进行增殖培养, 菌斑生成后, 挑入新鲜培养液继续纯化, 液固交替分离几次, 最后将纯化菌种斜面划线培养并保存, 以备分子鉴定和反应器使用。将纯化的功能微生物扩大培养后投入到反应器滤料中浸泡接种, 运行反应器直到滤料孔隙上生物膜形成后, 启动试验。

1.4 菌株的形态特征观察及生理生化特性测定

用革兰染色法对菌落进行染色后使用显微镜对菌体形态和特征进行观察。

1.5 温度、p H和H2S进口浓度对菌株脱硫的影响

分别考察当H2S进口浓度为1500~3500 mg·m-3, 温度为10、20、35、40、50℃, p H为2、3、4、5、6、7条件下的生物脱硫效果。

1.6 16S r DNA序列鉴定

16S r RNA扩增引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

2 结果与讨论

2.1 最适循环液p H值

由图2可知, p H 6.5时, H2S可完全去除, 随着反应的进行, 滴滤塔循环液p H逐渐降低, 这可能是因为微生物消化H2S产生的硫酸盐与水生成了H2SO4, 以及H2S微溶于水生成的HS-造成溶液环境p H的下降, H2S的去除率随着p H的降低而下降, 然而当p H下降到3时, H2S去除率上升。p H 2时, H2S去除率达到98%。在p H 4时, H2S去除率处于最低点, 原因可能是因为此处属于嗜中性和嗜酸性细菌最适p H范围外, 两类细菌均不处于最佳活性, 所以造成H2S去除率有所降低。

2.2 最适水浴温度

由图3中可知滴滤塔中的微生物在35℃下对H2S的去除率最高, 原因是此温度下微生物体内酶活性最高, 单位酶所需的底物量H2S最多, 故对H2S去除效果最好。10℃时微生物的酶活性由于温度较低未完全活化, 故对H2S的吸收摄取率较低, 而在40℃和50℃时已经超过了滴滤塔中微生物的最适酶活性, 造成一部分酶活性下降或失活, 也就降低了对H2S的去除率。

2.3 循环液喷淋量对H2S去除率的影响

由图4可知, 当H2S气体入口浓度C2=2500 mg/m3, C3=3500 mg/m3时, H2S达到完全去除时的液体循环喷淋量分别为40L/h和50L/h。由此可见, 随着气体入口浓度的增加, 所需循环液的流量也在增加。但液体循环量也不能过大, 因为水流过大会冲击滤料表面, 造成菌体的流失, 需要的能耗和费用也随之加大, 并且过多的液体也会减少H2S和微生物的有效接触, 单位体积液体所覆盖的H2S含量降低, 减少了微生物对H2S的有效利用, 也就造成了微生物对H2S去除率的下降。

2.4 气体流量对H2S去除率的影响

使液体循环喷淋量稳定在40L/h, 调整气体流量在35 L/h~85L/h, 由图5可知, 当H2S入口浓度为C1=1000 mg/m3, 气体流量在35L/h~55L/h时, 微生物对H2S的去除率可以保持在100%, 当气体流量调整为55L/h以上时, H2S去除率有所降低。虽然气体流量加大有利于气相进入液相的传质过程, 但是随着气体流量的逐步加大, 每立方米体积的微生物所承受的H2S负荷量也随之增大, 当超过微生物所能承受的负荷时, 就导致了去除率的降低。当H2S入口浓度C2=2000 mg/m3、C3=3000 mg/m3时, 所对应的最适气体流量分别为45L/h和35L/h。

2.5 菌株CTD843-T-3的分子发育树构建

分离筛选到1株革兰阴性菌, 暂命名为CTD843-T-3, 采用16S r RNA构建分子发育树, 对其菌属进行分析。通过对构建的16S r DNA发育树 (图5) 分析, 发现CTD843-T-3与假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) 同源性为99%, 可初步认为分离的菌株归于假单胞菌属。

3 结论

(1) 当循环液p H在2.0~7.0之间时, H2S都有较高的去除率, 考虑到溶液在强酸条件下会对仪器设备产生腐蚀作用, 造成一定损失, 溶液最适p H为4~6.5。

(2) 滴滤塔中环境温度为30℃时, 微生物处于最佳活性状态, H2S的去除率最高。

(3) 当H2S气体入口浓度C1=1500 mg/m3、C2=2500 mg/m3、C3=3500mg/m3时, 所对应的H2S达到完全去除时所需液体循环喷淋量分别为20L/h、40 L/h、50 L/h, 所需气体流量分别为35~55L/h、45L/h、55L/h, 最高负荷率为7.1 g/ (m3·h) 。

(4) 从污水处理活性污泥中分离到1株革兰阴性细菌CTD843-T-3, 通过16S r DNA序列分子发育树构建分析得出其属于假单胞菌属。

参考文献

[1]池勇志, 李亚新.硫化物的危害与治理进展[J].天津城市建设学院学报, 2001, 7 (2) :105-108.

[2]王钢, 王欣, 刘伟, 等.沼气脱硫技术研究[J].化学工程师, 2008, 148 (1) :32-33.

[3]DavidA.Kost, JerryM, Bigham.Chemical and Physical Properties of Dry Flue Gas Desulfurization Products[J].Environ.Qual, 2005, 34 (2) :676-686.

篇6：微生物菌种纯度检测技术规程

1 生物活性垫料清洁养猪技术的基本原理

生物活性垫料清洁养殖技术是以锯木、谷壳等有机物作为垫料, 在垫料中加入生物活性菌, 内含有高活性的有益菌群和微量元素及有益中草药, 诱导猪在圈舍内拱料觅食的天性, 由于猪的运动、翻拱和嚼食, 使猪粪尿与垫料进行及时混合, 在垫料中有益菌群的作用下, 对猪粪尿进行及时发酵、分解, 可长期保持栏舍内干爽清洁, 不需冲洗。可增加猪群的运动量和营养物质的吸收, 有利于免疫力的提高和肉质的改善。垫料可使用1年半上, 猪出栏后, 垫料可制成优质的有机肥, 真正实现生猪养殖无粪尿臭味排放, 免冲洗舍内清洁。

2 栏舍建造要求

2.1 新建猪舍

2.1.1

新建猪舍背风向阳, 地势干燥, 空气流通, 平坦宽阔, 土质坚实, 最好离居民区1公里以上。

2.1.2 猪舍式样, 分为单列式猪舍和双列式猪舍两种。

肥猪舍最好采用单列式猪舍, 母猪舍采用双列式猪舍。建成开敞卷帘通风式猪舍, 用卷帘和卷帘器控制。靠北面采用窗户结构。

2.1.3 猪舍基本结构主要由基础墙柱、屋顶、卷帘和垫料栏、取食台、饮水器、隔栏等部分构成。

基础墙柱:要求坚固、耐用, 一般为砖砌墙, 水泥勾缝, 高为3.5~3.8m以上。

屋顶:可采用钢结构或木屋架, 可盖彩钢板或机瓦, 应设隔热层。

垫料栏:分垫料池、取食台、饮水台三部分, 垫料池靠外侧, 用砖砌墙, 要求水泥勾缝, 高为1.2米, 靠外面设活动挡板, 宽度为2~3m, 便于出料和进料;栏舍为正方形, 大小一般为:肥猪舍以50~60m2为宜、保育舍以20~30m2为宜、后备母猪舍以20m2为宜, 产房为6~8m2为宜。取食台高为70cm, 宽1~1.2m, 用水泥固化, 水泥厚10cm。饮水台高为70cm, 宽30~40cm, 向外倾斜, 在饮水台上打一个孔, 将饮水流到墙外沟内, 防止猪饮水时溅出来回流到垫料中。饮水器安装在饮水台上方, 根据不同种类的栏舍分别安装在离饮水台15cm、25cm、35cm处, 按每15猪安装饮水器一个。

卷帘:由卷帘器和帘布组成, 长度为整栋猪舍长, 高度能遮盖严实, 并有适当余地, 便于冬季挡风保温。

围栏:用钢管焊成, 在垫料池活动挡板一面, 应设计为活动的, 可取出, 便于出料。

通风设备:猪舍应安装换气扇, 每100平方米安装两台直径1.2m的换气扇, 便于冬季空气对流和夏季降温。母猪舍夏季亦可采用湿帘降温。

2.2 旧猪舍改造

旧猪舍改造成零排放样猪舍:要求旧猪舍高度在2.8米以上, 每个栏舍的垫料池不得少于30平方米, 以正方形为宜。

3 垫料的配制及使用年限

3.1 垫料组成

垫料主要由锯末、谷壳、生物菌等部分组成,

3.2 配制方法

锯末50%+谷壳50%+生物菌 (1kg/m2) 充分混合均匀, 然后加水至40%~50%, 堆积并盖薄膜发酵7天左右, 发酵中心温度可达到50~60℃。再摊开至70~80cm厚度进猪。养猪后, 垫料要求长期保持70~80cm左右厚度。见图1。

3.3 发酵过程中正常情况

(1) 发酵2~3天后, 温度可达到40~50℃左右, 垫料在使用过程中要按制作流程充分混合均匀, 在发酵5~7后可温度可达到60℃以上。

(2) 发酵7~10天后, 将表层垫料翻到下面, 即可进猪。

(3) 垫料在高温季节发酵可达70℃, 发酵时间较短, 发酵7天左右即可进猪, 在低温季节温度为60℃左右属正常发酵温度, 发酵7~10天可进猪。

3.4 垫料正常使用的判断

(1) 中部温度在40~45℃之间

(2) 气味有酒香味;

(3) 在集中排泄区底部无积尿及氨味。

3.5 垫料的使用年限

垫料使用时间为1年半, 可正常饲养3~4批猪出栏。

4 垫料管理

4.1 生物活性垫料清洁养殖技术养猪入前时首先要打好疫苗, 进行一次全面驱虫工作。

4.2 生物活性垫料清洁养殖技术养猪后, 保持适当的饲养密度, 实行分阶段饲养7~30kg的小猪为2头/m2, 30~70kg的猪为1头/m2, 70kg以上的猪饲养密度为0.5头/m2。

4.3 猪关进后观察猪粪尿区分布情况, 每天将粪尿集中区域的垫料掩埋至干燥区30cm以下, 每天换个地方掩埋, 以此类推, 保证垫料池内各个地方养分均匀, 才能正常发酵分解。在湿度特别大的地方应及时与干地方的垫料混合均匀或适当加入新的锯末、谷壳各50%。整个垫料池隔3~4天将垫料全部深翻1次。

4.4 夏季猪舍卷帘和窗户通常敞开, 便于通风, 盛夏时节, 开启强制通风机, 垫料太干和盛夏季节 (12∶00~16∶00) 温度高时, 开启喷头间隙喷雾 (喷雾时间:中午12∶00喷雾2~3分钟, 下午16∶00~17∶00喷雾2~3分钟, 具体根据垫料湿度调整喷雾时间) , 达到防暑降温目的。冬季注意保温和适时通风, 在猪舍内空气不流通或有氨气味时适时开启通风机换气, 促进空气对流。

5 注意事项

5.1 严格控制饲养密度;

5.2 厚度:

垫料必须长期保持70~80cm厚度。垫料厚度不够时加入锯末、谷壳各50%。不需另外添加核心料。

5.3 通风:

保持良好通风, 夏季要求强制通风。

5.4 湿度:

严禁有生水流入垫料中, 长期保持冬季40%左右的湿度;夏季50%左右的湿度。

5.5 维护:

加强垫料管理, 每天应将集中排放区粪尿掩埋至干燥区。

5.6

坚持自繁自养, 严格猪群健康管理。

6 总结

生物活性垫料清洁养殖技术是一个新型养殖环保产业, 在实践应用中存在着很多不同的操作方法, 有很多养殖人员认为该技术养猪是一种“懒汉养猪法”。其实不然, 每一个新生事物的发展都需要具备一些必要条件, 只有在符合生物活性垫料清洁养殖栏舍的要求前提下, 保证垫料中的微生物营养源均匀、养殖密度适当、湿度合适, 然后再加强垫料管理和栏舍通风的条件, 才能养好猪。总之, 只有真正养好垫料才能养好生猪。

摘要：本文介绍了生物活性垫料清洁养殖技术的基本原理、栏舍建造要求、垫料配制、垫料管理、注意事项等问题, 并进行了相应的探讨。

关键词：生猪养殖,生物活性垫料,清洁,饲养管理

参考文献

[1]赵大伟, 李巧云.发酵床养猪技术的研究与应用[J].广东饲料, 2009, (4) :38～39.

[2]史经化.生物发酵床养猪应注意的问题[J].中国牧业通讯, 2008, (20) :35.

[3]张汉宝.如何科学利用发酵床养猪[J].农村养殖技术, 2008, (18) :7.

[4]王诚.发酵床养猪法的几个关键环节[J].农业知识:科学养殖, 2008, (9) :36～37.

[5]盛清凯, 武英, 王成立, 等.发酵床养猪建筑设计中存在的一些问题与解决方案[J].猪业科学, 2008, 25 (9) :451.

篇7：微生物菌种纯度检测技术规程

罗汉果(Grosvenor Momordica Fruit)为葫芦科多年生草质藤本植物罗汉果的果实,其干燥果实为圆形或长圆形。罗汉果主要分布于广西,此外,广东、江西等省也有分布。广西永福、临桂两县为罗汉果的栽培起源中心[1]。

成熟罗汉果富含罗汉果甜苷,它是一种高甜度、低热量甜味剂。因此,罗汉果广泛应用于医药、饮料、调味剂[2]。

罗汉果果实中主要化学成分是罗汉果皂苷(Mogroside),该类物质除少数为无甜味或苦味(罗汉果二糖甙和三糖甙)外,大多为强甜味物质和微甜味物质,其中罗汉果苷V为果实中含量和甜度(为蔗糖甜度的256～344倍)均较高的成分,是主要的甜味成分[3]。

近年来西方发达国家肥胖症、糖尿病患者日益增多,罗汉果中的甜味剂——罗汉果甜苷作为一种低卡路里的甜味剂,以其味道新颖、口味纯正及独特的保健功能深受消费者的喜爱。20世纪90年代以后,罗汉果及其中成药产品逐渐打开了欧美市场,出口量有强劲增长势头[4]。

2 工艺原理及主要技术指标

2.1 工艺原理

罗汉果苷V的生产工艺路线是:鲜罗汉果→水提→浓缩→酶解→过滤→大孔树脂层析→离子交换树脂脱色→浓缩→喷雾干燥。

(1)取适量鲜罗汉果,破碎后投入提取罐中,用纯化水于微沸状态下提取3次,按生产工艺控制好提取次数、时间,加入纯化水量;第3次提取液采用套提法,进ty第2批物料。

(2)合并1、2次水提取液,浓缩至适当体积。

(3)控制浓缩液的温度,达到酶促反应最佳温度;采用低浓度有机酸控制浓缩液pH,以达到酶促反应最佳pH;严格按照工艺要求控制加入酶的种类、数量、酶解时间、酶解顺序。

(4)将酶解液过滤,滤液用大孔吸附树脂精制;先用纯化水洗至流出液无色透明,然后用适当浓度的乙醇解吸。

(5)将大孔吸附树脂解吸液通过碱性阴离子交换树脂柱,控制进柱液中低固形物含量和流速,进完料液后,再用适当溶剂洗脱,控制到工艺参数要求的体积。

(6)将洗脱液浓缩至14～17波美度。

(7)喷雾干燥得成品。

2.2 主要技术指标

(1)外观:白色至类白色粉末。

(2)气味:特殊,无果味,无异味。

(3)溶解性:制作30 W/V%水溶液,加热至50℃应完全溶解,不得有不溶物存在,冷却后也不得有不溶物存在,溶液澄清透亮。

(4)罗汉果苷V (Mogroside V)含量:≥40%(HPLC法)。

(5)甜度:≥蔗糖的300倍(5%蔗糖水溶液对照)。

3 技术创新点

提取生物活性物质高纯度罗汉果苷V的新工艺的技术创新点。

3.1 采用溶剂套用提取技术减少溶剂使用量

比常规工艺减少溶剂消耗30%以上,提取时间缩短了1h。将罗汉果苷提取收率提高了5%以上。将第3次提取液套入第2批物料中生产,有效减少了加水量,缩短浓缩时间。

3.2 用适当比例浓缩的方法除去部分多糖、蛋白质等杂质

将水提取液浓缩至适当比例,使多糖、蛋白质等杂质部分沉淀出来,而不是用沉淀剂除去这2类杂质,降低了生产成本。同时减少后期上柱的进料量,缩短生产周期,也延长了大孔吸附树脂的使用寿命。

3.3 采用生物酶解技术将澄清与纯化精制工艺结合

酶解去除了果胶、蛋白质等物质,或者将这些物质酶解成小分子物质,解决了以往的浓缩液极难过滤的问题,并有效减少浓缩时产生的泡沫。酶解纯化了不明大分子物质对大孔吸附树脂的影响,保持了大孔吸附树脂良好的吸附性能,减少了酸碱再生处理的次数,降低了生产成本。

3.4 用大孔树脂层析经过酶解后的上柱液

经酶解的料液提高了罗汉果苷V的含量,比常规工艺提高10%以上,可以在此步工艺就制成含量32%以上罗汉果苷V的半成品,解决大孔吸附树脂精制罗汉果苷V含量难以超过32%的难题。

3.5 采用适合于罗汉果苷V脱色的阴离子交换树脂

在解吸液脱色过程中,酚酸性色素等小分子物质被离子交换树脂交换吸附,而分子状态的罗汉果苷未被吸附,从而改善了产品的色泽,罗汉果苷V的含量提高了10%以上,同时罗汉果提取物由淡黄色至棕黄色变成白色的产品。采用2种脱色树脂时,大孔树脂解吸液不需要经过浓缩回收乙醇,可以直接上柱,再用乙醇洗脱或者纯化水洗脱,这样就明显缩短了生产周期和生产步骤。

采用生物技术将脱色与提高产品纯度结合,在提高产品纯度的同时也改善了产品色泽,做到生产中一步到位出成品,减少生产环节。

4 关键技术与工艺

本项目关键技术与工艺技术设计是以天然罗汉果苷的理化性质为基本依据,为此我们在工艺中采用了以下关键技术。

(1)罗汉果苷类化合物易溶于水、乙醇等强极性溶剂,难溶于丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂,为一类白色结晶性粉末;鲜果中的多糖、单糖、低聚糖、蛋白质、氨基酸、小分子酚酸性色素等均易溶于水中,故鲜果用纯化水提取。

(2)提取液经过浓缩到一定浓度后,可析出部分果胶等多糖而使提取滤液稍变澄清,同时减少上柱体积,缩短后续层析进料时间。

(3)鲜果中含有的多糖、蛋白质等大分子化学成分随同罗汉果苷等有效成分一同被水提取出来,经过酶解,可以使果胶沉淀,以及被酶解成果糖、葡萄糖等小分子的物质;同时蛋白质也被水解成氨基酸等小分子物质。这种酶解处理使得浓缩液变得澄清透明,极易过滤;也使得这些酶解后的小分子物质在层析时被水洗除去,从而提高产品纯度。

(4)合适的大孔吸附树脂对罗汉果苷这类皂苷类成分具有很好的吸附作用,对酚酸性色素类成分也有较好的吸附作用,而对被酶解后所生成的葡萄糖、果糖、氨基酸等小分子物质以及被水提取出来的其他杂质类成分吸附性能较差。在层析过程中,这些吸附性能差的小分子物质及大部分杂质被适当溶剂洗脱,而罗汉果苷及色素类被吸附保留下来,依吸附性能差异及分子大小差异分离,从而进一步提高了罗汉果苷V纯度。

(5)碱性阴离子交换树脂可以通过离子交换作用,与经过大孔吸附树脂层析所未能除去的酚酸性色素产生离子交换吸附。对罗汉果苷的分子类化合物而言,其分子中不含有活性官能团而不被阴离子交换树脂交换吸附,从而将罗汉果苷V及其他少量分子状态物质与具有活性基团的酚酸性色素分开,进一步提高产品的纯度,改善产品色泽,使产品由淡黄色变成白色。

5 结论

本工艺与国内现有的工艺相比,具有以下特点。

(1)采用溶剂套用提取技术减少溶剂使用量,比常规工艺减少溶剂消耗30%以上,缩短提取时间1h。将罗汉果苷提取收率提高了5%以上。

(2)用适当比例浓缩的方法除去部分多糖、蛋白质等杂质,而不是用沉淀剂除去这2类杂质,降低了生产成本。同时减少后期上柱的进料量,延长了大孔吸附树脂的使用寿命。

(3)采用生物酶解技术将澄清与纯化精制工艺结合,解决了以往的浓缩液极难过滤的问题,并有效减少浓缩时产生的泡沫。酶解纯化了不明大分子物质对大孔吸附树脂的影响,保持了大孔吸附树脂良好的吸附性能,减少了酸碱再生处理的次数,降低了生产成本。

(4)用大孔树脂层析经过酶解后的上柱液,罗汉果苷V的含量比常规工艺提高10%以上,可以在此步工艺就制成含量32%以上罗汉果苷V的半成品。

(5)采用适合于罗汉果苷V脱色的阴离子交换树脂。罗汉果苷V由原来的淡黄色至棕黄色变成白色的产品。采用2种脱色树脂时,大孔树脂解吸液不需要经过浓缩回收乙醇,可以直接上柱,缩短了生产周期和生产步骤。

“提取生物活性物质高纯度罗汉果苷V的新工艺”列入国家科技部科技型中小企业创新基金支持的项目,于2010年项目验收合格,验收证书编号10-0317。

该工艺经过几年的实际生产和应用,证实其工艺路线简单,生产成本低,产品收率高,生产设备要求低,生产过程容易控制,现已实现规模化生产。

产品大量出口到国外,进入美国、日本和欧洲市场。用户反映该产品的罗汉果苷V含量高、色泽白、热量低、甜度高,非常适合作为肥胖症、糖尿病患者及不宜食糖人群的理想甜味剂。

参考文献

[1]钟仕强.罗汉果的研究现状[J].广西农业科学,1992(4): 164-165.