猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展（通用7篇）

篇1：猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

摘要：猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，该病毒有2个血清型：PCV1和PCV2。PCV1广泛存在于猪体内，无致病性；PCV2能直接或间接导致一系列猪的综合性疾病。如猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)，断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和成年猪皮炎肾病综合征(PDNS)等，对养猪业危害严重。为了深入了解PCV2致病因素，建立快速鉴别诊断技术，综述了PCV2的猪圆环病毒病及其相关致病因素和目前应用诊断技术研究情况。为研究探讨PCV2的发生和诊断提供借鉴。关键词：猪圆环病Ⅱ型；诊断技术；致病基因

猪圆环病毒(PCV)是兽医学上已知动物病毒中最小的病毒，根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1和PCV2两个型，其中PCV1无致病性[1]，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系。PCV2则具有致病性，在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征。PCV对酸性环境(pH3)、氯仿或者高温(56℃和70℃)有抵抗作用。PCV在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上不生长，可在PK-15细胞中生长，但不引起细胞病变，且需将PCV盲传多代才能使病毒有效增殖。在接种PCV的PK-15细胞培养物中加入d-氨基葡萄糖，可促进PCV复制，使得感染PCV的细胞数量提高30％。感染PCV的细胞内含有许多胞浆内包涵体，少数感染细胞内含有核内包涵体。

PCV2属圆环病毒科(Circoviridae)，是最小的无囊膜单链环状DNA病毒，其单链环状DNA染色质由1759个碱基组成，有11个开放阅读框架，编码11种蛋白质，猪圆环病毒的抵抗力较强，不易被灭活，在外界环境中可长时间存活。由猪圆环病毒(PCV2)引起的猪圆环病，临床表现为体质下降、消瘦、皮肤发白、腹泻、呼吸困难和黄疸。

PCV2与大多数典型的猪病原传播不同，PCV2既可水平传播，也可垂直传播。Shibata等在近期研究中随机的发现，临床健康的猪体内含有PCV2[2]，说明PCV2可潜伏于健康猪群中，更出乎意料的是，科研工作者在怀孕母猪和哺乳期母猪的乳汁中检测出PCV2[3] 1 猪圆环病毒病及其相关性致病因素

1.1 相关的致病因子

PCV2的致病因子主要与免疫刺激、宿主的敏感性和PCV2分离株有关[4]。研究表明，免疫刺激可以激发PCV2从感染向疾病方向发展而出现PMWS的机能障碍特征，这可能是由PRRSV或猪细小病毒(PPV)激活了巨噬细胞，从而促进了PCV2的增殖。

在宿主敏感性研究中发现，长白猪较杜洛克和大白猪更容易出现与PCV2相关的疾病爆发，而皮特兰仔猪对与PCV2相关的疾病敏感性较低，且公猪的遗传品系对PCV2相关疾病发病情况有显著的影响。最新的证据则表明[5]，PCV2分离株在毒力上有一定的差异，但这种微小的分歧可能与病毒的地域来源有关，而与分离株的病毒毒力无关。

1.2 PCV2的协同感染疾病

PCV2的主要协同感染疾病在最初研究中倾向于猪肺炎支原体、PPV、PRRSV，可是随着研究的深入，发现了如猪皮炎与肾炎综合征、繁殖障碍、母猪流产和死亡综合征和PMWS等很多疾病可能都会协同PCV2感染。

充分的证据表明，由于PCV2和PPV在猪体内具有类似的靶细胞，而PPV提高免疫系统的功能导致了更严重的疾病，PCV2和PPV的双重感染会引发比单个感染PCV2更严重的临床症状和病变，在发生PCV2相关疾病PMWA的猪群中，PRRSV居最常见的协同感染因子名单之首，其检出率高达52％[6]。猪呼吸道综合征(PRDC)、增生和坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)是发生在断奶、育成猪及成年猪群中的疾病，被认为是由多种病因共同感染所致，由于PCV2在这些共同感染疾病中普遍存在，其在这些疾病的共同感染中扮演了何种角色已普遍引起了人们的关注[7-8]，但PCV2与PRRS和PMWS直接相关的证据[9-10]，愈来愈明显。致病基因

PCV的基因组为单股、负链、环状DNA，病毒基因组以滚环模式(rolling circle model)进行复制。PCV2的复制起始区位于一个324 bp的片段上，其包含1个茎-环结构、保守的九核苷酸基序(AAGTATTAC)、3个六核苷酸重复序列(CGGCAG)和2个五核苷酸重复序列，Rep和Rep’的共表达是起始PCV2的复制所必须的，对PCV2的保守九核苷酸基序进行突变，从而影响病毒的复制过程，Rep和Rep’蛋白协同定位于同一个细胞的细胞核内，二者既可以形成同源复合物，也可以形成异源复合物。

据研究报道认为，猪圆环病的致病基因可能与ORFl-6这6个编码框编码的蛋白有关，其中ORFl为Rep基因，编码2种蛋白，负责PCV2的复制；ORF2为Cap基因，编码Cap蛋白，是PCV2病毒的唯一结构蛋白，可诱导产生中和抗体；ORF3编码的一种蛋白可以诱导宿主细胞凋亡[11-12]。

研究表明，ORF3诱导TNF-α达到较高水平可能与并发PPV和PMWS直接相关，ORF5诱导的IL-6可能与PDNS有关(PDNS也是IL-6明显增强)[13]，OFFR2基因表达的IL-10可能是感染猪逐渐发展成更严重的PMWS，而ORFl表达的Thl(IFN-γ)和Th2(IL-13)PMWS和PDNS有某种联系[14]。鉴别诊断技术

3.1 PCR方法

复合PCR技术具有单联PCR技术同样的优点，又能一次反应同时方便快捷的检测鉴别多种不同病原体。夏平安教授[15]等针对可引起猪免疫抑制病的重要病原PRRSV和PCV2建立了一种复合PCR检测方法，根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株部分开放阅读框保守序列和PCV2基因保守序列，设计合成了2对特异引物，最终建立了可同时检测PRRSV和PCV2的复合PCR诊断方法。

冯志新等研究设计合成了一套引物和TaqMan探针，特异性扩增PCV2-ORF2基因，通过反应条件的优化，建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法。该方法具有较好的特异性和重复性，对PCV2 DNA检测的下限为1拷贝／uL，敏感性比常规PCR高106倍[16]。

Chae等报道了一种半槽式多重PCR，成功进行PCV1、PCV2和PPV的鉴别诊断，在98个精液样品中发现，有20个阳性的PCV和42个阳性PPV，与半槽式PCR诊断结果相同。当PCV或PPV在人为污染的精液样本中存在时，运用该技术分析发现：PCV和PPVDNA主要存在精

液和一小部分无精子中。实验数据表明，该方法具有较高的敏感性和特异性，可以很好地区别PCV或PPV在猪上的感染。

Kathleen运用实时PCR检测Rep基因(ORF1)在自然感染的猪群和实验室人工感染的猪群的肺、淋巴结等组织，可以检测到2.2×103～2．2×1010／mLPCV2拷贝数。同时，他们检测到在所有被PMWS感染的猪群中都存在Rep基因，即证明了存在PCV2的混合感染的可能性。

3.2 ELISA和ELISA试剂盒

林彦星等应用原核表达的PCV2衣壳(Cap)蛋白作为诊断抗原，初步建立了一种检测PCV2抗体的间接ELISA方法[17]。实验表明该方法具有较高的敏感性和特异性，适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。秦承学等将PCV2 ORF1和ORF2基因分别插入杆状病毒和大肠杆菌表达系统，用亲和层析方法提纯获得重组衣壳(Cap)与复制(Rep)蛋白，用细胞融合技术获得2株Cap和Rep蛋白单克隆抗体，以重组Cap和Rep蛋白作为抗原，通过反应重要条件的优化，建立了间接ELISA方法，有较好的特异性和重复性，可用于PCV2抗体检测和疫苗免疫抗体鉴别诊断[18]。

研究人员研究对3种抗免疫球蛋白G的ELISA试剂盒检测抗PCV2a和PCV2b抗体，同时也检测了抗PCV2和PCV1抗体，55头3周龄的小猪随机分成7组，其中7头为阴性对照，8头接种PCV2a，8头接种PCV2b，8头接种PCV1，其余的24头接种不同厂家的3种疫苗，收集1周的血液样本，分别用3种试剂盒进行检测，反应数值都大于0.94，检测发现PCV2a和b抗体没有根本区别，没有检测出PCV1抗体，但1种试剂盒可鉴别出经疫苗B接种的猪体内的PCV2a或PCV2b抗体[19]。

3.3 竞争性酶联免疫吸附试验(C-ELISA)

Walker以分离的PCV2细胞培养物作为抗原，以PCV2特异性单克隆抗体作为竞争性反应物，C-ELISA敏感性和特异性达到99.58％和97.14％。McNelilly等建立了PCV特异性抗原捕获ELISA，其与定量病毒分离，可以区别PCV的临床和亚临床感染。

3.4 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光技术常用于猪圆环病毒感染的血清学普查，其特点是快速、特异、敏感，是目前诊断PCV2常用的血清学方法。在用于抗体检测时，可将PCV2按种于96孔细胞培养板的PK-15细胞上，培养一段时间后，经丙酮固定干燥后即可。此方法不仅可以用于检测抗体，而且可以用已知PCV特异性抗体检测抗原，主要用于PCV的分离鉴定及猪源细胞PCV污染情况的普查，为疾病诊断和净化猪源细胞提供了有效手段。

3.5 免疫金标检测

浙江大学发明公开了一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体检测试纸条。检测试纸条既可以猪圆环病毒2型抗原也可以检测血清中的PCV抗体，检测试剂条操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

3.6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的具有明显优势的扩增技术，能够在63℃～65℃等温条件下扩增特异的DNA序列，在30～60min可以得到肉眼可见的结果，该技术在禽流感的快速诊断中已成功运用。据研究数据统计分析表明，此技术的敏感性高于PCR，同时，在检测PCV1，PPV，PRV时无交叉反应，特异性较高，能够完成对PCV2的快速检测和定性分析，为PCV2的诊断提供了一种快速敏感的检测方法。

3.7 基因芯片技术

基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的，工作原理是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片是在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析成千上万的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。基因芯片技术已经成功地应用于禽流感和口蹄疫等重大疾病的快速诊断及分型和定型，但在PCV2混合感染的相关疾病的快速诊断和鉴定上还没见报道。可以预见，在不久的未来可能会出现基因芯片技术在PCV2引起的相关疾病上的应用。

3.8 原位杂交(ISH)技术

ISH具有高度敏感性，在国内外已经建立了多种方法。应用ISH既可以对PCV1和PCV2进行分型，又可以检测PCV与其他病毒的混合感染。刘方娜等根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列，在ORF2内设计l对特异性引物，利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段，回收并纯化PCR产物，用地高辛标记，建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV2的方法[20]。该探针与8个PCV2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交，而与对照组猪圆环病毒I型(PCVI)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性；对PCV2 DNA的最低检测量为lOpg。结论与讨论

PCV2与一系列猪的综合感染相关，这些疾病包括PMWS，PNP，PDNS，PRDC。很显然，这些疾病的发生与发展，至少与PCV2损毁猪的免疫系统有关，比如，PMWS发展是由于免疫系统异常和免疫抑制有关。显微镜观察发现，PCV2在淋巴组织的淋巴细胞、组织细胞和巨细胞广泛存在，导致体液免疫和细胞免疫失败。同时，由于PCV2分离株在毒力和地理分布上相差较大，这就意味着它的病原学意义有相当高的研究价值。

有文献报道，PCV2可以感染牛，接种PCV2完全可以致死8周龄的小鼠，这是否意味感染别的动物还需要进行很多的调查研究。目前，PCV2的研究倾向与动物解剖，然后进行分型和鉴定，这明显不利于动物安全生产、疾病的控制和人类自生安全。PCR技术有存在假阳性的问题，ELISA虽然特异性和敏感性较高，但它所用时间较长，在快速诊断方面显然不足，LAMP技术花费时间较少，敏感性和特异性也较高，但他是一个相对较新的技术，还需要更多的临床验证，基因芯片技术已经成功地应用于禽流感、口蹄疫和人类重大疾病的快速诊断及分型和定型，但在PCV2诊断和鉴定上还没见报道。如何与PCV2相关疾病的混合感染中进行快速的分型和定型鉴定，如何加强传统诊断技术的完善，以及加大对PCV2分子致病特性的研究力度，是科学工作者努力探索的问题；从而建立快速、敏感、准确的分子诊断技术和诊断方法，定期检测和预测即将流行的毒株，不断提高传统技术敏感度和特异性，同时不断推广和完善新方法、新技术，为早期、快速、特异、敏感地鉴别诊断此病毒，为有效地防控PCV2暴发与蔓延具有重大的理论意义和现实意义，控制PCV2对全世界养殖业及公共卫生构成的巨大威胁。

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篇2：猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

猪圆环病毒病的诊断与防治

本文阐述了猪圆环病毒病的.病原特性、流行特点、发病机制、临床症状及病理剖检变化、诊断方法和防制方法,并结合本省兽医临床诊疗实际提出了对本病的防治对策.

作 者：李卓 刘清河  作者单位：长春市动物疾病诊疗服务中心,吉林长春,130062 刊 名：吉林畜牧兽医 英文刊名：JILIN ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)： 30(4) 分类号：S852.65+9.2 关键词：猪   圆环病毒   诊断   防治  

篇3：猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

猪是PCV2的自然宿主, 不同性别、各个阶段的猪均可感染, 病猪和带毒猪 (隐性感染) 是主要的传染源。PCV-2对猪有较强的感染性, 病毒由口鼻分泌物、粪便、尿液排出体外, 可经消化道、呼吸道感染。胚胎期或出生后早期感染的猪, 常常在断奶后才发病, 在6~12周龄最常见。初产怀孕母猪感染PCV2后, 可导致母猪后期流产, 产死胎、木乃伊胎或弱仔及繁殖障碍。继1991年在加拿大西部首次报道发病以来, 猪圆环病毒病已经迅速传播至世界上所有主要养猪国家, 包括欧洲、美洲和亚洲国家, 但流行情况不尽相同。在美国, PCV2感染发病慢而缓和, 而英国PCV2的流行相当严重, PCV2感染引起的PMWS曾一度引起了人们的恐慌, 发病率为25% (最高可达40%) , 比猪瘟和口蹄疫造成的经济损失还要大。

2 临床症状

与圆环病毒Ⅱ型感染有关的猪病主要有以下4种疾病, 其临床表现如下。

2.1 仔猪断奶后多系统衰竭综合征

断乳后全身多系统衰竭综合征主要影响6~8周龄的猪, 很少影响吮乳的猪。临床上表现以多系统进行性功能衰弱为特征的症状, 生长发育不良, 渐进性消瘦, 皮肤与可视黏膜苍白或黄疸, 贫血, 肌肉萎缩、衰弱无力, 呼吸困难。由于细菌、病毒的二重感染, 常常使PMWS的症状复杂化、严重化。

2.2 猪皮炎和肾病综合征

特征性症状是会阴部、四肢、胸腹部及耳朵等处的皮肤上出现圆形或不规则形的红紫色病变斑点或斑块, 有时这些斑块相互融合成条带状, 不易消失。

2.3 母猪繁殖障碍

发病母猪主要表现为体温升高达41~42℃, 食欲减退, 出现流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎。病后母猪受胎率低或不孕, 断奶前仔猪死亡率上升达11%。

2.4 猪间质性肺炎

临床上主要表现为猪呼吸道病综合征, 多见于保育期和育肥期的猪, 咳嗽、流鼻汁、呼吸加快、精神沉郁、食欲不振、生长缓慢。

3 病理变化

3.1 仔猪断奶后多系统衰竭综合征

剖检可见间质性肺炎和黏液脓性支气管炎变化。肺脏肿胀, 间质增宽, 质度坚硬似橡皮样, 其上面散在有大小不等的褐色实变区 (间质性肺炎) 。肝变硬、发暗。肾脏水肿、呈灰白色, 皮质部有白色病灶。脾脏轻度肿胀, 胃的食管区黏膜水肿, 有大片溃疡形成。盲肠和结肠粘血、出血。

3.2 猪皮炎和肾病综合征

主要是出血性坏死性皮炎和动脉炎, 以及渗出性肾小球性肾炎和间质性肾炎。剖检可见肾肿大、苍白, 表面覆盖有出血小点。脾脏轻度肿大, 有出血点。肝脏呈桔黄色外观, 心脏肥大, 心包积液。

3.3 母猪繁殖障碍

剖检可见死胎与木乃伊胎, 新生仔猪胸腹部积水, 心脏扩大、松弛、苍白、有充血性心力衰竭。

3.4 猪间质性肺炎

剖检可见弥漫性间质性肺炎, 呈灰红色, 肺细胞增生, 肺泡腔内有透明蛋白。细支气管上皮坏死。

4 PCV2的实验室诊断

根据PMWS的流行病学、临床症状和病理变化, 可初步确诊为PCV2感染。但是要做到对PCV2感染的确切诊断还需要借助于实验室诊断技术。

4.1 间接免疫荧光试验 (IFA)

Allan等 (1998) 利用间接免疫荧光检测PCV2, 将病料接种于涂有PK15细胞玻片培养, 用兔抗PCV高免血清与细胞培养物中的PCV反应, 可对PCV进行检测和定型。

4.2 聚合酶链式反应 (PCR)

PCR技术以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断最常用的技术, 也是PCV2病原检测中最常用的技术。经过多年的研究, 国内外建立了多种形式的PCR方法, 包括常规PCR、多重PCR、竞争PCR、套式PCR及PCR-RFLP等, 可用于特异区分PCVl与PCV2。

4.3 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

目前国内外科研人员已建立了多种ELISA方法, 包括间接ELISA法、竞争ELISA法、抗原捕获ELISA等, 为进行PCV2感染的大规模血清学调查、流行病学调查及PCV2相关疾病的诊断奠定了基础。目前已有商品化的试剂盒用于大规模的抗体检测。

5 猪圆环病毒2型的防制

5.1 疫苗免疫接种是主要手段

疫苗免疫是控制该病的最有效的措施, 就目前的生猪养殖而言, 它能提高生产性能、降低发病率和死亡率。目前已有10多家猪圆环病毒2型灭活疫苗投入市场, 商品化圆环病毒疫苗分为三大类, 即全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗。相对而言, 全病毒灭活疫苗使用得较为广泛。

5.2 实行严格的生物安全措施。

尽量做到自繁自养。如必须引种时, 则引进的后备母猪必须进行严格的检疫, 所购买的种公猪、精液也必须确保无猪Ⅱ型圆环病毒感染。此外, 在猪场内禁养猫、犬, 定期驱蚊蝇、投饵灭鼠。

5.3 减少应激, 加强饲养管理。

避免过早或过多地对仔猪进行免疫, 减少各种应激因素。在猪Ⅱ型圆环病毒易感期最好不注射应激较大的疫苗, 如仔猪副伤寒疫苗、口蹄疫疫苗、气喘病疫苗等。同时, 注意通风与保暖, 保持猪舍干燥, 改善猪舍的空气质量, 降低氨气浓度。去势和注射也必须遵循良好的卫生和消毒习惯。

5.4 药物预防

PMWS发病一般集中于断奶后的保育猪和育肥前期猪, 因此, 仔猪饲料中添加抗菌药物提前预防, 可以添加氟苯尼考、强力霉素、泰妙菌素、泰乐菌素、替米考星、林可霉素等药物, 连用10~14 d, 以控制细菌性继发感染, 用药要轮换, 减少耐药性。对发病猪进行隔离治疗, 可肌注头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林等, 以治疗细菌继发感染。

摘要：猪Ⅱ型圆环病毒病 (PCV2) 是近年来新发现的一种主要感染仔猪或青年猪的传染病, 是世界各国公认的制约养猪业发展的重要疫病之一, 给养猪业造成了严重经济损。猪圆环病毒病在临床上以断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS) 为主要特征, 并能引发多种猪病, 给养猪业造成经济损失。针对该病的流行病学、临床症状、病理变化、实验室诊断等研究进展进行总结, 并结合我国实际提出了对该病的防制对策。

篇4：猪圆环病毒病的实验室诊断

1 圆环病毒概述

猪圆环病毒（porcine circovirus， PCV）属于单股DNA圆环病毒科圆环病毒属成员，二十面体结构、无囊膜、由衣壳蛋白和DNA组成，为已知的最小动物病毒之一，分为I型（PCVl）和II型（PCV2）两个型。PCV1基因大小为1759hp，PCV2分为两个基因型、大小分别为1767-1768hp，PCV1和PCV2两种基因型在核苷酸序列上相似度低于80%、但抗原之间仍存在交叉反应。PCV1最早在1974年发现、被证明没有致病性；PCV2于1997年被分离出来，可引起了淋巴细胞凋亡、APC递呈抗原能力的减弱、同时降低了B细胞和CD4+T细胞的机能。PCV2具有免疫抑制性，感染PCV2的猪一般都发生免疫缺陷，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症、新生仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合症、呼吸系统综合症、母猪繁殖障碍等。

2 病原学诊断

2.1 病毒的分离与鉴定

圆环病毒传播主要以粪口途径为主，病毒先定居于扁桃体、之后随血液遍布全身淋巴结及各个器官组织，可取病死猪的脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结等作为病原的分离材料。将取材进行研磨离心、氯仿抽提，接种于PK15细胞。PK15为猪肾细胞，圆环病毒可在PK15细胞上良好生长而不产生细胞病变，培养过程中可加入D-氨基葡萄糖能够促进病毒的增殖，细胞培养进行传代1～3次后应进行PCV2抗原或核酸的检测加以鉴定。

2.2 问接免疫荧光法

间接免疫荧光实验是检测病毒的常用方法之一，通常以薄片作为载体、固定组织或细胞、再加入待检标本和荧光标记物、在荧光显微镜下观察结果。Allan等利用间接免疫荧光法来检测圆环病毒II型，取病死猪的肺脏、淋巴结、肾脏等组织病料研磨离心处理后以盖玻片为载体在PK15细胞上培养，丙酮固定，用荧光素标记的兔抗高免血清与细胞培养物中的PCV2抗原反应，荧光显微镜下观察结果，可对PCV2进行检测和分型。该方法对实验室设备及操作人员技术要求较高，专业实验室可操作、基层较难开展。

2.3 PCR

目前应用于PCV检测的PCR实验方法主要包括常规PCR方法、多重PCR方法、巢式PCR方法等。在PCR仪中热稳定的DNA聚合酶可使短链的双股靶DNA很快地复制成千上万倍，可以使DNA数量急剧增长而达到检测极限。理论上，可在2h内将一个DNA分子扩增到106～109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。吕艳丽等根据PCV的基因序列设计一对特异的PCR引物进行PCV检测，建立了特异的PCV诊断方法，该方法可以检测细胞和组织中的病毒核酸。王忠田等利用PCR技术对发病的规模化猪场进行了PCV感染的调查，同时利用该方法研究了PCV病毒在自然感染猪体内的分布情况。多重PCR是一种特殊的PCR检测方法，可同时检测多种病毒DNA，即在同一反应体系中加入不同病毒引物、扩增不同的目标片段，例如圆环病毒一伪狂犬病毒一细小病毒三联检。

3 血清学诊断

人工感染试验证明，由PCV2引起的血清转换发生于感染后14～28d，所以抗体检测有一段时间的窗口期。另外，PCV1和PCV2之间存在抗原交叉反应，所以制备针对PCV2的单克隆抗体是血清学鉴定的前提条件。

3.1 间接免疫荧光

将PCV2抗原与荧光素（异硫氰酸）进行结合，制备出荧光素标记抗原，在反应板上加入待检标本，如存在PCV2抗体则产生抗原抗体复合物，在荧光显微镜下可观察。如有待见卢银华等用猪肾传代细胞系PK-15增殖猪圆环病毒2型（PCV2）毒株制备抗原，建立了检测PCV抗体的间接免疫荧光试验（IFA）。应用该方法对64份临床送检血清样品进行了检测。结果38份血清呈现PCV抗体阳性（59%）。但间接免疫荧光实验方法对操作技术要求高、需要专门的荧光显微镜、需要有有经验的检测人員、缺乏标准化的商业试剂盒，因此该方法的大范围临床应用受到了限制。

3.2 乳胶凝集实验（LAT）

将PCV病毒致敏乳胶颗粒，制备成诊断抗原，取血清或全血标本，可在现场圈舍旁边检测抗体，主要是检测IgM，使用于感染早期诊断。该实验方法操作容易、实验条件简单、3～5min出现结果、肉眼判断、不需要专门培训、价格低廉、适于现场检测，在临床检验中被广泛应用。

3.3 ELISA

将病毒、纯化的蛋白质等抗原包被在酶联板上，通过间接法、竞争法等程序检测抗体。检测方法具有诊断速度快，敏感性高，特异性强等优点，适合大规模检测的要求。有人用PCV2抗原包被96孔酶标板，PCV2单克隆抗体作为酶结合物，采用竞争法检测PCV2抗体。该实验与传统的间接免疫荧光发相比较检测同样标本，ELISA法敏感性达到99.6%，而间接免疫荧光法只有97%。张志慧等对市场上5种ELISA试剂盒性能做了苹果，发现差异较大。分析为各试剂盒原料、工艺有较大差异，方法学有竞争法有夹心法、原料上有基因合成的PCV2-cap、有重组的PCV2-cap，酶标抗体有单克隆抗体有多克隆抗体。

篇5：猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展

目前,我们对PCV的诊断主要是先通过临床症状结合病理变化进行初步判定,但确诊还须经实验室检验,实验室检验主要有血清学和分子生物学方法。

1 血清学检测技术

血清学检测技术主要应用血清学方法检测组织病料或培养物中的PCV,主要包括ELISA、C-ELISA及间接免疫荧光试验等方法。

1.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

2000年,朗洪武等用加拿大的PCV2克隆化特异性表达抗原、阳性血清、阴性血清,按常规ELISA法进行PMWS抗体的检测,被检血清1:400稀释,阳性和阴性对照血清1:100稀释,当被检样品的OD值3倍于阳性对照OD值时判为阳性,否则为阴性,证明ELISA的灵敏度较高。

1.2 竞争性酶联免疫吸附试验(C-ELISA)

2000年,Walker等首次利用PCV1和PCV2特异性单克隆抗体建立了竞争ELISA(C-ELISA)方法来检测PCV2抗体。他用细胞培养的PCV2作为抗原,用PCV2特异性单克隆抗体作为竞争试剂成功地建立了C-ELISA方法,并将该方法和间接免疫荧光方法相比较。检测结果表明,C-ELISA方法的检出率为99.58%,而间接免疫荧光的检出率仅为97.14%,说明该方法比免疫荧光方法更敏感,可用于PCV抗体的大规模监测。

1.3 间接免疫荧光试验(IFA)

IFA是一种比较特异的血清学方法,主要用于病毒分离效果的鉴定及检测病变组织或猪源细胞PCV的感染情况,既可检测群特异性抗原又可检测型特异性抗原。

按Allan等报道的方法进行。将病料接种PK-15细胞或病变组织冰冻切片,丙酮固定,用兔抗高免血清与细胞培养物反应,同时设非感染PCV的正常PK-15细胞或正常组织切片的对照,可对PCV进行检测和定型。如镜检出现特异荧光则证明细胞中有PCV病毒存在,即为PCV阳性。IFA快速简单,花费较少,应用非常广泛。

2 分子生物学检测技术

分子生物学检测技术主要应用分子生物学方法检测组织病料或培养物中的病毒核酸,主要包括PCR、PCR-RFLP及ISH等方法。

2.1 聚合酶链式反应技术(PCR)

2.1.1 常规PCR方法

设计一对PCV特异引物,直接从病料或细胞中扩增PCV特异的基因组片段,以达到特异检测PCV感染的目的。

吕艳丽等根据PCV2的基因序列设计一对特异的PCR引物进行PCR检测,建立了特异的PCR诊断方法。该方法可以检测细胞和组织中的PCV2病毒核酸。

2.1.2 多重PCR (Multiplex PCR)

多重PCR是一种特殊的PCR技术,它可以简单、方便地同时检测2种或2种以上的病毒DNA,即在同一反应中加入多对引物,扩增多个目的基因片段。该方法方便、快捷,已广泛用于医学临床,给疾病的快速诊断带来了方便。

2001年,芦银华等根据发表的PCV基因序列,合成3条引物,建立了复合PCR法。在试验中,他们在同一体系中用三条引物扩增出了PCV1和PCV2的DNA片段,从而达到了PCV扩增一次就可检测鉴别PCV1和PCV2的目的。

2.2 PCR-限制性长度多态性(RFLP)分析方法

该法分两步,首先进行PCR扩增,引物为PCV1与PCV2的共同引物;然后是用一定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切,电泳观察片段差异,从而确定PCV的类型(PCV1或PCV2)。

Fenaux等根据已有的PCV株的基因序列,建立了通用的PCR-RFLP分析方法,该法不但可以用PCV2的致病性研究,而且可以用来检测不同地域的PCV2的感染情况。Hamel等借助于RFLP建立了可以分型的PCR诊断方法,很容易检测PCV1和PCV2。他根据已发表的所有PCV基因组的保守序列设计引物,对PCV1和PCV2毒株的基因均扩增出了438bp的基因片段,这些片段经RFLP分析很容易鉴定和区分PCV2毒株的基因型。

2.3 原位杂交实验(ISH)

根据所用探针的特异性不同,可将ISH方法分为3类,包括同时检测PCV但不能进行分型的ISH;可对PCV1和PCV2进行分型的ISH及检测PCV2与PPV或PRRSV混合感染的ISH。

2000年,Nawagitgul根据PCV2的ORF1和ORF2的有义链和反义链合成了能区分PCV1和PCV2的核酸探针。在58℃下,ORF1反义链探针与感染细胞中PCV1和PCV2都杂交,而ORF2反义链探针与感染细胞中PCV2杂交,不与PCV1核酸杂交;ORF1和ORF2有义链只与PCV2核酸杂交。反义链探针产生的信号比有义链强,研究表明ORF1反义链探针适合检测PCV1和PCV2;ORF2反义链探针可区分PCV1和PCV2。

3 讨论

(1)生产中根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断,因猪群中普遍存在PCV2的抗体,单一的抗体阳性不能确诊为阳性,确诊必须依靠实验室方法检测出病毒的抗原或核酸。但检测方法多种多样,各有优缺点,结果也不完全一致,实践中可根据实际情况选用上述方法中的一种或两种方法进行确诊。

(2) 2000年以来,我国PCV2感染一直呈上升趋势,已经给我国的养猪业造成相当大的经济损失。目前,对PCV2的发病机制和免疫机理目前还不清楚,而且未发现一种有效的消毒剂能彻底消灭PCV2病毒,没有有效的疫苗可用于预防和治疗PCV2造成的感染。因此,研究敏感、特异、适于大规模检测的诊断方法和开展有效疫苗的研制是预防和控制该病的一个亟待解决的课题。

摘要：鉴于我国猪圆环病毒感染一直呈上升趋势,已经给我国的养猪业造成相当大的经济损失,为了加强对猪圆环病发病的监测和控制,本文综述了国内外运用血清学和分子生物学方法检测猪圆环病毒的成果,包括ELISA、C-ELISA、间接免疫荧光试验、PCR、PCR-RFLP及ISH等,便于全面了解猪圆环病毒的诊断技术研究进展。

篇6：猪圆环病毒病的诊断与防治

一明张海兰谢鹏贵 (新疆伊犁职业技术学院

8350) 00

2010年2月25日, 新疆农四师某猪场的仔猪 (5~14周龄, 体重15~40kg) 开始陆续发病。其主要特征为:猪只弓腰趴背, 被毛粗乱, 毛色无光泽且略带发青, 体质下降, 消瘦, 体温升高, 全身有出血点, 呼吸困难, 咳嗽, 腹泻, 黄疸, 个别猪皮肤出现圆形或不规则的隆起, 呈现周边为红色或紫色中央为黑色病灶等特征。临床用药效果甚微。依据流行病学、临床表现、病理变化, 综合诊断为猪圆环病毒。

1 发病情况

新疆农四师某猪场自繁自养商品猪1500头, 存栏母猪200头。2010年2月25日, 该猪场保育舍35日龄仔猪 (18头) 有2头弓腰趴背, 被毛粗乱, 精神沉郁, 在以后的几天里, 部分仔猪也出现了类似的症状, 病情较严重的猪表现为精神沉郁, 消瘦, 体温升高 (41℃左右) , 腹泻等症状, 技术人员曾连续交替使用青霉素、链霉素、磺胺类等药物进行治疗, 只能延长寿命, 不能治愈, 至3月2日共发病12头, 死亡8头, 发病率为67%, 病死率高达75%。

2 临床表现

主要危害5~12周龄的仔猪, 但最常见于5~9周龄的仔猪, 一般断奶后3~5天发生, 哺乳猪很少发生。临床表现为弓腰趴背, 被毛粗乱, 毛色无光泽且略带发青, 体质下降, 消瘦, 体温升高, 全身有出血点, 呼吸困难, 咳嗽, 腹泻, 黄疸, 个别猪皮肤出现, 圆形或不规则的隆起, 呈现周边为红色或紫色中央为黑色的病灶。病灶直径一般为2cm, 个别病灶常融合成条带和斑块 (一般最早常在后躯, 后肢

耳等部位) 等特征。体质弱的仔猪最易发病, 发病率在70%左右, 多数猪病程较长, 也有的体质弱的猪在几天内死完, 死亡率在80%左右。

3 病理变化

病猪死后剖检, 一般病尸消瘦, 皮肤轻度到中度苍白, 淋巴结肿大, 切面发白, 腹股沟, 肠系膜, 支气管等器官或从组织的淋巴结病变尤为突出。肺质地坚实呈橡皮样, 表面呈花斑状, 灰棕色肺叶与正常的分红色肺叶相间, 肝表面呈花斑状, 并有不同程度的萎缩, 切面肉状, 无充血, 胆汁浓缩。肾肿大, 苍白, 皮质和髓质散在大小不一的白色坏死点, 肾被膜下呈现可见的白色病灶, 有时充血和水肿, 盲肠和结肠粘膜充血或淤血, 小肠壁明显增厚, 小肠变细, 脾脏肿大, 质地呈肉样变化。个别猪只出现, 腹腔被白色胶东样物覆盖, 各脏器粘连, 心包积液, 心肌变软, 粘膜, 浆膜出血, 有时皮下水肿。

4 实验室诊断

2010年3月4日美国康地公司中国分公司技术售后服务部经理亲临该猪场进行血清诊断 (采样30份血清, 4头病猪脏器) , 经荧光抗体法检测, 2型圆环病毒均为阳性, 其中17份继发猪繁殖与呼吸综合症, 8份继发附红细胞体病。

5 诊断结果

根据流行病学, 临床症状, 病理剖检, 实验室诊断, 诊断此次发病为圆环病毒病。

6 治疗

全群用瘟毒特号进行拌料, 按治疗量连用7天, 同时应用附红速康、庆增安粉拌料连用7天, 7天后病情得到缓解, 发病率明显降低, 又用药7天后病情基本稳定。

对于35日龄左右的病猪, 肌肉注射热毒肌腺泰, 再采取对症治疗。用药一个疗程后, 90%的病猪可以康复。

对于70日龄左右的病猪, 可肌肉注射圆环病毒瘟 (黄芪多糖) 注射液, 再采取对症治疗, 用药一个疗程后, 50%的病猪病情可基本稳定。

肌肉注射猪白细胞干扰素 (育肥猪1头/瓶·天;仔猪2头/瓶·天;乳猪4头/瓶·天) , 每日一次, 连用3~5天, 哺乳仔猪分别在3、7、21日龄按0.5ml/kg各注射一次;成年猪增倍。

7 预防

7.1 认真对待引种工作

引种不慎往往是爆发疫情的主要原因, 引种的后备母猪应进行严格的检疫, 所购买的种公猪精液必需无Ⅱ型圆环病毒感染。

7.2 建立健全规模化猪场的生物安全体系

将消毒卫生工作贯穿于养猪生产的各个环节, 最大限度地降低猪场内污染的病原微生物, 减少或杜绝猪群细菌性和病毒性继发感染的机率。由于PCV2对一般的消毒剂抵抗力强, 因此在消毒剂的选择上应考虑使用广谱的消毒药。

7.3 加强猪群的饲养管理, 降低猪群的应激因素

在PCV2感染猪场, 很多应激因素都可诱发、促进PMWS、呼吸道疾病的发生和加重发病猪群的病情, 导致死亡率上升, 因此应尽可能地减少猪群的应激因素, 避免饲喂发霉变质或含有真菌毒素的饲料, 作好猪舍的通风、换气, 改善猪舍的空气质量, 降低氨气浓度, 保持猪舍干燥, 降低猪群的饲养密度。

7.4 建立完善的药物预防方案

适当使用药物控制猪群的细菌性继发感染。PCV2感染的危害更多的是体现在感染猪群的继发感染或合并感, PCV2感染猪群由于免疫功能的损害, 易引起一些细菌性的继发感染, 因此建议在妊娠母猪产前和产后阶段、哺乳仔猪断奶前和断奶后、转群等阶段按预防量适当在饲料中添加一些抗菌药物 (如支原净、土霉素、氟苯尼考、利高霉素、头孢菌素、金霉素、阿莫西林等) , 以防治猪群的细菌 (如肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、链球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、附红细胞体等) 性继发感染, 各猪场应根据所在场继发感染性疾病的种类来选择药物。

8 结论与讨论

猪圆环病毒是一种新的传染病, 目前在尚无特效药物的情况下, 应采取综合的防治措施, 坚持自繁自养, 分购种猪要严格检疫, 隔离观察, 确认无病后方可入群。严格实行“全进全出”, 制定合理的免疫程序, 做好驱虫工作, 搞好定期的消毒工作。

由于该病损害免疫器官, 使机体的免疫能力下降。所以易继发猪附红细胞体病、蓝耳病、猪支原体肺炎、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病等, 在预防和治疗上应适宜用药。

抗菌、抗病毒中药适口性差, 要根据实际情况用药, 避免大量用药造成猪食欲下降。

摘要：猪圆环病毒是近年来新发现的一种主要感染仔猪或青年猪的传染病, 主要表现为渐进性消瘦, 生长发育受阻, 体重减轻, 皮肤苍白或有黄疸, 有呼吸道症状, 时有腹泻, 有的表现为肾型皮炎。本文就该病在本地区的发病情况、临床表现和病理变化等方面进行探讨, 为有效防治该病提供参考。

篇7：猪圆环病毒病的诊断与防制

1 流行病学

猪对圆环病毒有较强的易感性，不同月龄的猪由呼吸道和消化道感染发病。主要常发于5～16周龄的猪，耐过猪后期发育明显受阻，抵抗力下降，有时并发其它细菌病和病毒病，使死亡率大大增加，猪场饲养管理不良、密度过大等常能诱发此病。

2 临床症状

本病最常见的临床表现为猪只渐进性消瘦或生长迟缓，还表现为厌食、精神沉郁、行动迟缓、被毛蓬乱无光泽、呼吸困难、腹泻特征。体表淋巴结肿大，肿胀的淋巴结有时可触摸到，在同一头猪上表现为多种症状，用药效果不明显。

3 剖检病变

病死猪被毛蓬乱，皮肤苍白，个别表现为黄疸，淋巴结肿大，切面苍白，肺脏有出血斑，与正常的肺叶相间，呈花斑状，有的肺脏触摸坚实，有的萎缩。脾脏肿大，肾脏肿大苍白，被膜下有白色的坏死灶，肝脏边缘肿胀，有的有纤维素膜包被，有的肝细胞坏死。剖检中最主要的症状是胃黏膜有的溃疡，有的穿孔，严重的整个胃像“筛子”。

4 病理学检验

对感染猪进行病毒分离和对组织器官冰冻切片，利用免疫染色能确定病毒的存在。

5 诊断

结合流行病学、临床症状、剖检变化及实验室诊断相结合才能够确诊此病。

6 治疗

该病无特效治疗措施，临床上只能针对病猪的症状加以缓解，降低死亡率。注射黄芪多糖0.2ml/kg/d，连用5～7d，头孢噻肟钠3～5g/头·d，连用3～5 d。病毒灵、头孢拌料，按照说明书适当加量，控制继发感染。

7 防制

(1)首先对猪场严格消毒，进猪前对猪舍彻底消毒，饲养过程中的消毒，以及有关人员出入猪舍的消毒等都要严格把关。

(2)建立完善的免疫体系，按时注射疫苗，“防重于治”要贯穿始终，增强猪群的免疫力。

(3)药物预防：饮料中定期投放一些抗病毒和抗细菌类药，同时添加多种维生素，增强猪群的抗病力。