PCR技术

PCR技术（精选十篇）

PCR技术 篇1

1 材料与试剂

1.1 维药种类

1.1.1 菊科

5种菊科维药的名称、来源、拉丁名见表1。

1.1.2 豆科

10种豆科维药的名称、来源、拉丁名见表2。

1.1.3 伞形科

9种伞形科维药的名称、来源、拉丁名见表3。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

低温高速离心机 (上海医用分析仪器厂) , 恒温水浴箱, 恒温摇床, 冰箱, 电子天平, DYCP-31B型电泳, PCR仪 (MJ Research PTC-100TM, Programmable Thermal, USA) , DYY-稳压电泳仪 (北京六一仪器厂) , 凝胶成像仪。

1.2.2 试剂

SDS (十二烷基硫酸钠) , EDTA (乙二胺四乙酸) , β-硫基乙醇, PVP (聚乙烯吡咯烷酮) , 氯仿, 醋酸钠, 醋酸钾, 异戊醇, 异丙醇, 琼脂糖, 1×TBE溶液, 溴乙锭, 二甲基苯青, 其它溶剂均为国产分析纯。

1.4 植物药前处理

1.4.1 高温低pH法

该法提取的药品DNA纯度较高, 主要原理为:利用低pH提取介质, 可有效防止组织被破坏、材料沉淀时的电离作用及酚化物氧化。所提取DNA纯度较高, 无需进一步纯化, 可直接用于随机扩增多态性DNA (RADP) 等分子水平标记。采用低pH介质高盐沉淀蛋白方法, 可从新鲜材料或干品植物材料中提取得到总DNA。

1.4.2 方法

市售干品药材粉碎, 过60目筛, 采用去离子水清洗, 紫外线照射30min, 取粉末0.3g, 置研钵中, 加1.0g玻璃沙研磨至极细粉末。加入预热 (50℃) 的缓冲液A (100mmol·L-1醋酸钠, 50mmol·L-1EDTA, 500mmol·L-1NaCl, 2.5%PVP, 3%SDS, 1%β-巯基乙醇, pH为5.5) 于研钵中混匀, 取10mL于离心管中, 置恒温床 (56℃) 温育30min, 于转速10 000r/min离心10min。取上清液至另一离心管中, 加2/3倍体积2.5M (pH为4.8) 醋酸钾洗液置于4℃冰箱保存30min, 于转速10 000r/min离心10min;转移上清液移至另一离心管中, 加等体积氯仿-异戊醇混匀, 4℃、10 000r/min离心15min重复1次;上清液加2/3体积冷异戊醇 (-20℃) 混匀置-20℃冰箱30min。于4℃、10 000r/min离心20min, 吸取上清液采用70%乙醇沉淀2次, 洗去乙醇, 倒置试管于吸水纸上, 于无菌台吹风机吹干, 加入ET洗液300~400μL, 4℃保存备用。

2 结果

2.1 DNA检测

检测已提取的植物总DNA, 采用琼脂糖电泳方法:置于1%的琼脂凝胶, 加示踪剂 (溴酚蓝和二甲基苯青) 电泳30min, 完毕, 凝胶成像仪中观察。

2.2 PCR扩增反应

反应总体积为30μL, 成分:2×TBE缓冲液15μL, 牛血清蛋白 (BSA) 1.5μL, 2个引物各2μL, ddH2O 9.5μL, 模板DNA (植物基因DNA) 2μL。程序:94℃变性, 36℃退火35s, 72℃延伸70s, 2个循环, 94℃变性, 36℃退火35s, 72℃延伸70s, 42个循环共44个循环[1];94℃预变性, 180s;94℃, 60s;39℃, 45s;72℃, 60s;35个循环最后72℃, 180s。

取上述反应液10μL检测, 置1.6%的琼脂糖凝胶上, 加示踪染料, 采用10×TBE的电极缓冲液30min, 完毕, 在凝胶成像仪中成像。

2.3 无产物出现原因

循环温度、解链温度不够确切, 或者PCR仪指示温度与实际温度不符;引物组成不合理;聚合酶活性发生异常;植物来源DNA较难去除多糖、多酶等物质, 可能抑制PCR反应。

3 讨论

本实验所用维药均为维吾尔医院所提供的干品药材, 大都能提取总DNA, 说明PCR技术具有应用广泛的特点;对提取出来的二十三味药进行PCR扩增反应, 无扩增谱带出现, 可看见引物聚合点。提示PCR技术在种类与质量方面的研究, 可为维药提供更快、更简捷、更有效的鉴定方法[6]。

本实验准备较为充分, 但是由于受实验条件的限制, 致使实验结果并不理想。药材总DNA提取较好, 但在DNA片段扩增时, 引物的选用尚处于初步摸索阶段, 同时由于时间有限, 致使最终的结果并不理想。多次实验仅能看到引物聚合点, 而无扩增片段出现。因此, 实验方法、引物的选用及扩增程序还需进一步摸索与改进。

参考文献

[1]王培训, 周联, 赖小平.分子生物学技术与中药鉴[M].广州:广东世界图书出版公司, 2002:92-112.

[2]刘勇民, 沙吾提·伊克木.维吾尔药志[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社, 1985.

[3]肖树雄, 林伟忠.中药现代检验新技术[M].广州:羊城晚报出版社, 2003:137-183.

[4]中药大辞典编写组.中药大辞典 (上、下册) [M].上海:上海科学技术出版社, 1975.

[5]吴平, 周亚平.用聚合酶链产物直接测序技术鉴定中药鳖甲[J].中国药科大学学报, 1982, 29 (1) :17-21.

PCR技术的法医学应用 篇2

PCR技术可以从一滴血、一个细胞中扩增出足量 DNA产物供分析检验。PCR技术的应用解决了许多以往血清学方法无能为力的问题，而且离体蛋白质在自然界中的稳定性远不如核酸。所以 DNA的PCR检验具有独到的优越性。目前，人们已建立了各种生物样品如血液、血斑、精液、性交混合物、肌肉、单根毛发、上皮细胞、牙齿、骨骼中制备 DNA的实验方法。目前PCR技术的法医学应用主要有： 1．VNTR多态性

该方法扩增位点靶基因多态性串联重复核心序列数目不同而形成。目前报道有十几种，比较成熟的有APOB、PMCT118、P33.6、P33.4、PYNZ22等位点。该方法简单，结

果易分析，缺点是在片段长度差异较大时，长片段可能被漏扩增，引起错误判断。2．性别鉴定

PCR性别鉴定目前应用于各种生物检材检验。通过扩增y染色体特异位点鉴定，用Alu序列作对照，也可以同时扩增x、y染色体特异性片段进行鉴定。3．STR分型检验

STR为短串联重复序列（Short Tandom Repeat）,形成多态性原理与VNTR相似，只是重复单位数3-6bp，片段长度100-400 bp。STR与VNTR分布也不同，VNTR主要分布在染色体端粒，而STR则存在于整个基因组，估计人类基因组有50万个STR位点，因此是巨大的遗传差异研究对象。

STR位点的突出特点是基因组内基因座多，多态片段短，在生物性检材个人识别鉴定中实用价值极高，高度腐败的检材只要保存了靶DNA，STR位点就可能扩增成功。STR的PCR扩增时间短，变性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一个半小时左右完成30个循环。检测方法灵敏度高，甚至<1ng模板DNA都可扩增出多态片段。STR的扩增产物经高分辨聚丙烯酰胺凝胶电泳，用等位基因梯阶分子量标准物，即可准确的判断等位基因长度。可获得不连续的基因频率分布，便于Hardy-Weinberg平衡检验和偶合概率计算。

1993年在英国Colin等报导用复合扩增对12个STR位点进行研究，总排除率达1x10-14，表明STR复合扩增可以认定同一。STR在法医学中应用优点在于：

(1)操作方便简便，通过多位点累计，可以同一认定；(2)灵敏度高，复合扩增可以节约检材；(3)片段较小，适宜部分降解DNA的扩增。

4．线粒体测序技术

线粒体是真核细胞中与 能量代谢有关的细胞器，一个细胞中线粒体数的范围约为1000~10000个，所以线粒体DNA分析比细胞核DNA分析要灵敏得多，线粒体测序分析另一特点是可以对无核细胞检材，如毛干、红细胞骨头、指甲等进行分析，而且细胞核DNA进行测序分析必须用克隆的方法纯化出单一的DNA分子才能进行测序分析，而线粒体DNA可直接经PCR扩增测序。进一步研究表明，线粒体是母系遗传方式遗传的，所以一母所生子女应有相同的线粒体DNA序列。线粒体多变区在D区。扩增D区多态片段测序，就可以进行个体识别。

PCR技术 篇3

【关键词】 EMA  PCR  微生物死活菌区分  微生物检测新技术

【课题项目】重庆三峡医药高等专科学校校级苗圃工程（2014mpxz4）。

【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）05-0233-01

分子生物学方法中基于PCR技术的检测方法被越来越多地应用于致病菌的检测，但是传统的PCR检测技术不仅能扩增活细胞DNA，同时自由状态的DNA或死细胞DNA也能被扩增，导致检测出现假阳性，因此一种能特异、快速、准确检测病原菌的方法极为迫切。

一、EMA-PCR检测技术原理

活菌和死菌的区别之一是细胞膜的完整性，EMA是一种DNA 结合染料，其光解后形成的氮宾化合物能够渗透进入细胞膜不完整的菌体内，与DNA分子发生不可逆的共价结合，从而抑制其PCR扩增，但不会影响活菌DNA的PCR扩增。EMA结合PCR的检测方法，仅以活菌的基因组DNA为检测靶标，能有效降低传统PCR检测的假阳性，同时能有效降低“活的但不可培养状态”（VBNC）菌在传统培养法带来的假阴性结果，使检测结果更加准确、可靠。

二、EMA-PCR检测技术应用

目前，EMA-PCR新型微生物活体检测技术已经广泛用于食品微生物、环境微生物和医学微生物的检测中。Guy等[1]用EMA结合常规PCR的方法检测屠宰场中有活性的沙门氏菌，这种EMA-qPCR方法成功地避免了检测过程中的假阳性，对食品安全评估更为准确。Pilar等[2]用v-PCR方法检测军团杆菌，结果发现，v-PCR方法与平板培养法结果比较相近或略高，但是相对于常规PCR的检测结果而言偏低或相近，表明此法能避免常规PCR检测带来的假阳性和平板培养计数法可能带来的假阴性结果，该法用于检测水体中的军团杆菌。新建立的v-PCR方法在缩短检测时间的同时保证了检测结果的准确性。Trivedi等[3]用较高的EMA浓度实时定量监测柑橘中脉中不可培养的柑橘黄龙病菌的含量，发现在感染的长春花中检测到的病原菌含量比感染的柑橘中高，对病害的流行规律研究有重要的意义。

金黄色葡萄球菌（SA）是一种常见的高致病性革兰氏阳性菌，对SA的准确检测十分重要，而检测的关键是食品中活菌是否存在和如何准确定量的问题。余以刚等[4]建立金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件模型，成功建立了DNA结合EMA与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法。

EMA-PCR检测技术有效避免了传统PCR检测方法的假阳性结果和传统培养方法带来的假阴性结果，这种新型、方便、快捷、准确的微生物活体检测技术将取代传统的检测技术成为微生物检测的新思路。

参考文献：

[1]Guy RA， Kappor A， Holicka J， Shepherd D， Horgen PA. Arapidmolecular-based Assay for direct quantification of viable bacteriain slaughterhouses. Journal of Food Protection， 2006，69（6）：1265-1272.

[2]Pilar DV，Lydie S，Jean MD. Viability PCR，a Culture-Independent method for rapidand selective quantification of viable legionellapneumophilacellsin environmentalwatersamples.Applied and environmental microbiology，2009，75（11）：3502-3512

[3]Trivedi P， Sagaram US， Kim JS. et al. Quantification of viable Candidatus Liberibacter asiaticus in hosts using quantitative PCR with the aid of ethidium monoazide （EMA）.European Journal of Plant Pathology，2009，124： 553-563.

[4]余以刚，田聪，肖性龙等.金黄色葡萄球菌VBNc状态的诱导条件和EMA-qPCR检测.华南理工大学学报（自然科学版），2013，1（41）：127-129.

作者简介：

PCR技术的原理及其应用 篇4

基因工程操作的第一步是提取目的基因。主要有两条途径:一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。20世纪80年代以后,随着DNA核苷酸序列分析技术的发展,人们已经可以通过DNA序列自动测序仪对提取出来的目的基因进行核苷酸序列分析,并且通过PCR技术,使目的基因片段在短时间内成百万倍地扩增。上述新技术的出现大大简化了基因工程的操作技术。

1.PCR技术的基本原理。PCR技术的基本原理是以欲扩增的DNA为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。

1.1 PCR反应的步骤。通常情况下一个PCR循环反应由变性———退火———延伸三个基本反应步骤构成:(1)模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,双链DNA解离形成单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;(2)模板DNA与引物的退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至退火温度时,引物就与单链DNA模板的互补序列配对结合,这个过程又叫做复性。PCR反应中所用的引物是两条,它们分别互补与DNA双链的一条,在这个过程中,引物相当于半保留复制中的冈崎片段,引物与模板链的结合为下一步核苷酸序列的合成指引了方向;(3)引物的延伸:DNA模板———引物结合形成的二聚体在Taq DNA聚合酶的作用下,以d NTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA链互补的新链。这样经过一轮反应,一个DNA分子就变成完全相同的两个DNA分子。重复循环变性———退火———延伸三过程,就可复制出更多的DNA分子。

1.2 PCR反应的动力学特征。与活体内DNA的半保留复制一样,PCR反应中,引物不仅能以原始DNA为模板进行扩增,而且也能以新合成的复制链为模板进行扩增。随着反应的不断重复,原始模板DNA的数量保持不变而新合成的复制链则逐渐增加。理想的情况下,PCR反应中DNA分子是以指数增长的,即每一个PCR反应结束,DNA的数量将变成2n个,n代表循环次数。但在实际反应中,由于聚合酶的活性不同,模板的纯度,PCR反应仪器的差异等因素的影响,不同的PCR反映扩增效率不同,DNA的数量不是以2n增加,而可用(1+X)n计算,X表示平均每次反应的扩增效率。另外,在反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的,它取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的活性及非特异性产物的竞争等因素。通常情况下,每完成一个循环需2~10分钟,PCR反应到26-28个循环就基本达到平台期,此时就可以结束PCR反应。因此经过2~4小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。

1.3 PCR反应的成分。参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、d NTP、模板和Mg2+。

引物:引物是一段寡核苷酸序列,类似于半保留复制中的冈崎片段。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。在PCR反应中,引物一旦与模板链结合,在DNA聚合酶的作用下,引物就会从3'端开始延伸。随着反应的进行,反应体系中引物的量会不断减少。

酶:最初,Mullis使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I,但是由于该酶不耐高温,所以PCR产物特异性较差,而且每次循环都要重新加一次酶,试验步骤繁琐,这使得PCR技术不利于推广。1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,虽然解决了PCR产物特异性较差的缺点,提高了扩增产物的真实性,但是每循环一次,仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。由于此酶具有耐高温,不易被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,扩增特异性高等优点,提高了PCR反应的特异性和效率,大大简化了试验操作,因此被广泛应用于PCR反应。此酶被命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase),此酶的发现使PCR技术得到广泛的应用。

d NTP:即四种核苷酸,随着反应的进行,反应体系中d NTP的量会不断减少。

模板:典型的PCR反应是用DNA做为模板核酸(靶基因),它的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一。

Mg2+浓度:由于DNA聚合酶活性需要一定的离子环境,所以Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,Mg2+浓度过高,反应特异性降低,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

1.4 PCR的种类。PCR技术自1985年建立以来,发展之迅速、应用之广泛,表明其具有强大的生命力。根据应用的模板,可分为DNA PCR:以生物体基因DNA为模板;RNA PCR:以RNA为模板;原位PCR:就是直接在组织细胞里进行PCR反应,PCR扩增结束后,用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交,再通过显微镜观察结果。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。根据参与反应的引物的多少可分为常规PCR,即一个反应体系里面只有两个引物通过PCR扩增产生一个核酸片段;多重PCR(multiplex PCR):是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同。根据PCR反应中引物扩增的方向可将PCR分为正向PCR,就是PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段;反向PCR(reverse PCR):是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,是扩增引物外未知序列常用的方法。另外根据扩增的目的有可将PCR分为定性PCR和定量PCR,前者的目的只是为了检测模板中是否有目的片段的存在,后者是为了检测模板中目的片段的含量。

2.PCR技术的主要应用。概括起来讲,PCR技术主要应用于以下几个方面:

2.1扩增目的基因。科研工作者为了研究某一个生物性状的成因及其变异原因,首先需要将控制这个性状的基因克隆出来,然后将其克隆到合适的载体上,通过诸如转基因等方法来研究这个基因的功能。在克隆基因时以及随后的转基因鉴定过程中,都需要应用PCR技术。

2.2基因组测序。为了了解一个基因或者一个DNA片段的碱基组成,需要通过测序才能知道,而核酸测序之前首先要对待测序的DNA片段进行PCR扩增,然后才能进行测序工作。

2.3生物主要性状的分子标记。对于控制同一个性状的基因,相同的物种具有相似的基因,不同的物种其基因是不同的。常见的分子标记如RAPD标记,SSR标记,SNP标记等,就是应用PCR的方法来鉴定不同生物体的基因是否相同的一种简便的基因检测技术。两个生物个体如果具有相同的基因,那么PCR扩增就会有相同的扩增产物,如果基因不同(如基因发生突变)其扩增产物就不相同。这项技术在物种分类,基因突变分析,人类遗传病鉴定,亲子鉴定等方面具有重要的价值。

PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展 篇5

PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足食品安全快速检测要求.PCR技术是近年来广泛应用于食品中致病微生物快速检测的现代方法之一,其目的基因多种多样,主要包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多种特异性鉴别基因.本文综述了PCR技术应用于金黄色葡萄球菌检测的.各种目的基因,并简要介绍了多重PCR及实时定量PCR等新技术的应用.

作 者：姜延龙 张宇 田波 霍贵成 JIANG Yan-long ZHANG Yu TIAN Bo HUO Gui-cheng 作者单位：东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150030刊 名：食品科学 ISTIC PKU英文刊名：FOOD SCIENCE年，卷(期)：27(5)分类号：Q939.11关键词：金黄色葡萄球菌 PCR 基因

PCR技术 篇6

[关键词]多重PCR；致病菌；病毒；真菌

[中图分类号]R372[文献标识码]A[文章编号]1009-6019一(2010)05-84-03

多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增。根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增。前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增，后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增。与传统的PCR相比，具有扩增效率高，产物特异性高和经济简便特点，特别适合食品中病原微生物的快速测定。

1多重PCR在食品中致病菌的检测

目前多重PCR的方法主要建立在食品中病原菌的检测，这方面的研究最多，建立的方法也最多。

1.1多重PCR检测同一致病菌

食品中的某些致病菌由于具有较多的血清型，很多DNA片段都是某些细菌所共有的，很难通过单一的PCR扩增某条片段进行确定。极易造成测定结果的假阳性，影响样品检测的有效性。采用多重PCR针对目的基因的多个DNA片段设计引物进行扩增，根据多条扩增结果来判断结果可以减少假阳性，提高测定结果的特异性。

产毒素大肠杆菌是引起腹泻的重要致病菌，通常分为三种类型：ETEC(产肠毒素大肠杆菌)、SLTEC(产志贺样毒素大肠杆菌)和NTEC(产坏死性大肠杆菌)。其中SLTEC可产生三种毒素类型(sLTl、SLT2和SLT2v)，主要血清型是0157：H7 L2J。杨小鹃等采用大肠杆菌0157：H7rfeE和fliC基因的保守序列设计两对引物，通过对包括猪肉鸡肉牛肉羊肉在内的65份样品进行检测，同时采用传统分离培养鉴定和测序验证进行方法对比，结果显示阳性样品与标准鉴定方法的一致性达到98％，显示出测定结果的特异性好。

副溶血性弧菌主要存在于近海的海水、鱼类、贝类等海产品中的一种病原菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病等。在我国副溶血性弧菌引起的食物中毒在人数和起数上都处于第一位。李晓虹等根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计3对引物，采用PCR多重扩增，并对扩增结果特异性和标准菌株进行验证，结果采用多重PCR能够特异性的扩增副溶血性弧菌的450、269、500bp片段，而对其他种类菌没有特异性扩增。可在增菌8h后快速、简单、准确的检测出食品中副溶血性弧菌。沙门氏菌(salmanella)是最常见食源性病原菌，所含细菌种类繁多。已发现超过2 500种以上的血清型。邵碧英等采用沙门氏菌属特异基因hut、hilA、invA、hns和hns 5个基因建立多重PCR检测方法，结果表明二重PCR检测灵敏度与单一PCR一致，三重PCR检测灵敏度有所下降。并未建立起同时检测4种基因的多重PCR方法。Soumet等根据沙门氏菌属随机克隆序列、伤寒沙门氏菌的fc基因和肠炎沙门氏菌的sefA基因设计了三对引物，应用多重PCR对1 078份家禽样品进行检测，敏感性可达95％，高于常规细菌学鉴定方法的92.5％。显示出方法建立的不稳定性和引物设计的重要性。

1.2多重PCR检测不同致病菌

针对不同病原菌高度保守基因、特异性基因和毒素基因，设计相应的引物从而在同一反应体系中实现对多种病原菌的检测。可以大大缩短检测时间和降低成本。相对于检测同一致病菌，检测多种菌更有实际意义。由于食品中病原菌的数量较少，一般在检测前进行10～24h的增菌过程，可以显著提高样品检出率。陈伟等对金黄葡萄球菌(sA)的ntlc、单增李斯特菌(LM)的hly和蜡样芽孢杆菌(BC)的hemolysin基因，设计合成三对引物，结果显示方法检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同，结果稳定。具有推广应用价值。整个检测过程在16h完成，监测灵敏度可达1cfu／mL。李博等以金黄色葡萄球菌，志贺氏菌和沙门氏菌建立多重PCR获得相同的稳定结果。体现出在监测多重致病菌方面的优越性。杨平等对食品中主要存在的4种致病微生物沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，根据其主要特异性基因产物设计引物，建立起4种致病菌的多重PCR检测体系，体系中4种病原菌随机混合扩增均可成功，具有很强特异性，包括增菌时间10h即可检测完毕，在食品卫生检验中具有较强使用价值。焦豫良等对6种食品致病菌建立起的多重PCR灵敏度与单独PCR相同，所需时间更短，整个过程只需3-4h。显示出快速监测的优势。

2多重PCR在食品中病毒的检测

病毒只能在活的宿主细胞内才可以生存，一般在食品中并不能繁殖和复制，但很多资料证明，多种病毒性疾病确实由食品传播的。如甲肝病毒，脊髓病毒，轮状病毒和诺沃克病毒等。由于能够引起食品中毒的病毒种类较少，而且血清型亦不是很多，所以采用多重PCR测定多种病毒意义不大，但在确定食品中是否存在某种病毒方面具有一定的优势，即用多重PCR检测某一病毒，2003年SARS期间，我国出口的食品和动植物产品被迫要求进行SARS病原检测要求。单一PCR必须进行两次PCR才能确定是否为SARS。陈文炳等采用人工合成的特异的SARS病毒DNA片段作为可以病毒添加到牛肉等食品中，然后采用公开发表合成的引物进行二重PCR扩增，并采用单重PCR对照分析，得到相同的灵敏度，获得和单重PCR相同的扩增片段。给食品中病毒的多重PCR检测提供了一个研究方向。

3多重PCR在食品中真菌污染的监测

真菌在谷物和其他食品中生长繁殖时会产生真菌毒素，真菌毒素会引起人畜严重的食物中毒，如何能够快速检测食品中真菌及其毒素对于食品卫生具有重大意义。对于真菌的检测，目前多采用化学色谱法、现代免疫学和毒理学试验等，大部分是针对其产生的毒素进行鉴定，而对于未开始产毒或产毒量小的真菌检测可能出现假阴性。多重PCR通过检测真菌的基因序列判断食品被真菌污染的程度，具有更高的检出率，检测食品更加安全。秦文彦等t13J根据黄曲霉毒素生化途径中的关键调控基因an、Romt—1和ver－1的序列以及真菌共有的5.8SrDNA的ITS序列分别设计ApaF／ApaR、OmtF／OmtR、VerF／VerR及ITSl／ITS4 4对引物，研究建立起产黄曲霉毒索真菌及在食品中的快速灵敏监测体系，扩增出的对应基因序列与基因库中对应的DNA序列同源性达99％以上，监测特异性较好，提示多重PCR可作为真菌及其毒素检测的潜在方法进行研究。

4存在的问题与展望

多重PCR作为一种快速、准确、灵敏的检测方法，但高灵敏往往伴随着稳定性低重复性差的问题，PCR技术本身对操作者和试剂要求较高，多重PCR的要求则更加苛刻。微量的外源DNA即可对结果产生巨大的影响，甚至产生假阳性，导致测定结果错误。同时多重PCR对引物的浓度，Mg2’离子的浓度、dNTPS浓度和扩增退火温度的要求更加严格，任何一种条件控制不当，都很容易造成非特异性扩增，甚至扩增失败。在建立方法时必须进行优化各个反应条件，使得测定结果更加稳定和清晰。

荧光定量PCR技术应用综述 篇7

1 FQ-PCR在兽医学上的应用

猪链球菌是一种重要的人兽共患病的病原菌。用传统的微生物学病原分离技术结合血清学试验, 能够对猪链球菌进行诊断和血清学分型, 但该方法费时费力且敏感性不高, 易产生非特异性结果。拜廷阳等[4]建立了SS9水解探针 (Taq Man) 模式的荧光实时定量PCR检测方法, 与常规PCR方法相比, 该方法诊断更加迅速, 整个反应可在1~2 h内完成, 且不需要电泳, 大大降低了对环境的污染, 其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍, 并能实现对样品的实时定量检测。孙洋等[5]以链球菌2型的荚膜多糖抗原编码基因cps2J为靶基因设计引物, 利用SYBR Green I能特异性地与双链DNA结合发出荧光的特性, 以ABI7000为平台, 建立了猪链球菌2型的SYBR Green I荧光实时定量PCR检测方法。该方法检测猪链球菌2型参考株和猪链球菌2型国内分离株都呈阳性, 证明了其具有良好的特异性, 能够快速、准确、特异性地对猪链球菌2型进行定量检测。

炭疽杆菌作为人兽共患病的病原, 尤其炭疽杆菌的芽孢可作为生物武器的病原。王梁燕等[6]在100L纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢, 进行FQ-PCR检测, 1 h内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。空肠弯曲菌是人类主要的食源性病原之一, 常规细菌培养鉴定结果不可靠。阳成波等[7、8]以Light Cycler为平台, 先后建立一种基于Taq Man探针的FQ-PCR和SYBR Green I, 能与双链DNA结合而发出荧光的特性来定量检测空肠弯曲菌, 检测限度为5 cfu, 整个检测过程在60 min内完成。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的突变株可引起高致病性猪蓝耳病, 给养猪业造成了巨大的经济损失。刘圆圆等[9]根据该类病毒在Nsp2基因1594-1680处缺失87个碱基的特点, 设计了一对特异性引物和一个Taq Man探针, 建立了荧光定量PCR检测方法。该方法不仅特异性强, 灵敏度高, 能很好地区分高致病性猪繁殖呼吸综合征病毒和其它病毒, 而且没有发现假阳性和假阴性现象, 检测病毒滴度达到1TCID50, 克服了常规检测方法特异性差、灵敏度低、耗时长、操作繁琐等特点。

常用Taq Man探针, 如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量, 其检测极限相当于套式PCR, 但准确率大大提高。德国的Von等根据毛圆线虫某属ITS2基因序列建立了快速、有效定量的Taq ManPCR方法, 并能区分很多重要牛、羊消化道寄生虫;应用Taq Man探针从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫cp11基因和16S r RNA;Tanriverdi等用FQ-PCR对2个基因型的小隐孢子虫进行分型, 结果优于PCR-RFLP[16]。刘世国等[10]采用FQ-PCR动态观察感染弓形虫的家兔血液中的虫体。

2 FQ-PCR在畜牧业中的应用

王群等[11]采用Taq Man探针检测鸡γ干扰素。朱燕等[12]采用RT-FQ-PCR证明中国黄牛背最长肌中capnl m R-NA表达量与宰后3 d的牛肉嫩度高度相关。韩彩霞等[13]建立了绵阳Pr P基因RT-FQ-PCR检测方法。朱海等[14]所建立的FQ-PCR对生果蔬菜中的大肠埃希菌O157:H7的检测, 比传统分离培养法更灵敏, 可缩短试验时间。还发现脱脂奶粉和BSA可用于改善生果蔬菜中大肠埃希氏菌O157:H7的FQ-PCR检测体系, 提高检测率和检测灵敏度。张明辉等[15]采用Taq Man和SYBR Green I作探针, 对大豆深加工产品中RR大豆的含量和5种未知大豆深加工样品检测, 结果表明, 两种方法均可用于转基因深加工产品的检测。

3 FQ-PCR在动检领域的应用

近年来, 牛海绵状脑病、绵羊痒疫已被证实与人的克雅氏并有直接的关系。FQ-PCR可对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量检测。国际上严格禁用肉骨粉作所有牲畜的饲料用途, 动物源性食品、某些日用消费品的安全性也受到关注, 其中以检测DNA为基础的方法在应用中最为广泛, FQ-PCR可使检测变得更加简便和精确。徐淑菲[16]等人利用SYBR Green I实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病 (ISAV) 。根据鲑鱼传染性贫血病毒Y10404的序列合成部分基因片段, 将其插入到T载体中, 构建阳性质控品, 并设计合成一对特异性引物, 对反应体系进行优化, 进行特异性和敏感性分析, 并制作标准曲线, 其Tm值为82.5℃, r2>0.99。所建立的SYBR Green I实时荧光PCR方法能够简单、快速和特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5×10-8μg/μL, 其灵敏度比传统PCR高1 000倍, 能够从阳性样品中检出ISAV, 从而给我国的水产品检疫工作带来极大的便利。

4 FQ-PCR在食品安全中的检测应用

人们在日常生活中食品是否安全, 进出口食品和粮食是否含有危险或潜在危险的成分, 都可以用荧光定量PCR技术进行快速检测, 例如食源性微生物、食品过敏源、转基因食品、乳品等检测。在食品发酵过程中, 利用荧光定量PCR技术可不经过培养活菌, 可以直接分析发酵产物中的微生物种群[17]。转基因作物生产加工的食品全世界有近万种。荧光定量PCR方法是国内外进行转基因成分含量检测的常用方法。例如, 利用FQ-PCR技术定量检测谷物基因来控制缺乏麦麸的婴儿食物[18]。利用Taq Man-FQPCR法共对15份未知食物样品 (包括9份大豆类样品) 进行了转基因成分cp4epsps、cry1Ab的筛选检测, 其中大豆类样品5份检查含有转基因成分cp4epsps, 玉米类样品3份检出含有转基因成分cry1Ab, 其余7份样品均为阴性。试验证实Taq Man-FQPCR法同样具有荧光阈值较低 (Ct<300) 、重复性较好、灵敏度和准确度较高的特点[19]。

5 FQ-PCR在水产动物研究中的应用

陈信忠等[20]应用Taq Man探针技术设计探针和引物, 对影响PCR反应的主要因素Mg2+浓度和退火温度进行了优化, 还应用紫石斑鱼NNV主衣壳蛋白基因组片段构建的噬菌体加病毒作为阳性质控品, 具有很好的稳定性, 从而建立了检测紫石斑鱼神经坏死病毒的实时荧光定量PCR方法。宋艳等[21]等运用逆转录实时荧光定量酶链反应 (RT-FQ-PCR) 技术, 研究Gn RH-A及其配伍对鱼卵成熟、受精相关基因ZP3的调控, 建立了一套有效的鱼类促繁殖药物筛选的分子生物学方法。

李惠芳等[22]根据Gen Bbank登录的斑点叉尾鱼回病毒株ORF8基因序列, 设计引物和Taq Man荧光探针, 建立了用于检测斑点叉尾鱼回病毒的实时荧光定量PCR方法, 结果表明采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鱼回病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时少的特点, 并且能对病毒进行准确的定量分析, 不仅适合口岸进出口检验检疫的需求, 而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。

6 FQ-PCR在医学及药物开发中的检测应用

荧光定量PCR的出现克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题, 使得PCR技术更广泛的应用于临床及其药物方面, 目前已经在肿瘤研究, 乙肝诊断, 病毒检测, 动物疾病检测与防御, 药物疗效的评价与考核等方面, 为临床理论研究、治疗疾病和药物开发提供了客观的物质基础。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就会出现, 荧光定量PCR技术不但能有效地检测基因的突变, 而且能准确测定表达量, 所以可以进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断[23]。通过检测肿瘤标记, 荧光定量PCR及时适合于高通量检测癌症[24]。荧光定量PCR技术在新药的开发、畜用药物, 经济动植物的药物研究过程中, 可以快速了解药物对疾病进程的影响, 为新药开发节约大量的人力、时间和资金。

微滴PCR技术的研究进展 篇8

关键词：微滴PCR,发展,应用

1983年美国PE_Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等人发明了聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,简称PCR)技术,PCR技术自从被发明以后,就受到了非常高的重视,该技术作为分子生物学技术的一项重要里程碑,其特异性很强,灵敏度也很高,操作简单,重复性也非常好。该技术已经在很多领域(比如分子生物学研究,法医鉴定,还有临床诊断等)有着非常普遍的应用。但是,传统的PCR技术也存在以下的一些缺点:非特异性产物扩增的出现、引物二聚体的形成等,同时操作过程时间较长,容易受到污染从而出现假阳性或假阴性进而影响实验结果。为克服这些缺点,传统的PCR技术一直在被不断的改良和完善,已经发展起来的技术有荧光定量PCR(FQ-PCR)、巢式PCR、多重PCR、PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)等。最近一种微滴PCR(microdroplet PCR)技术成为研究的热点,以此为基础的新一代PCR系统,其结果的精确度、准确度和灵敏度比传统PCR以及定量PCR更好,因此很适于用来检测微拷贝数和基因突变率等。相信微滴PCR技术一定会在基础研究领域和临床诊断方面有着光明的应用前景。

1 微滴PCR技术的基本原理及其发展

1.1 微滴PCR技术的基本原理

微滴PCR是利用油包水乳液体系中的微液滴作为反应器进行PCR扩增。微滴PCR与其他PCR技术相比最大的一个区别就是该技术可以形成很多的独立的微滴作为微反应器来进行PCR反应。该技术的关键在于,在PCR反应前,将包含PCR反应的水溶液在一定时间内缓缓注入到恒定转速旋转的矿物油表面,水溶液瞬间被矿物油包裹,最后形成数以万计油包水的微液滴。在理想状态下,一个微液滴内只分布一个DNA模板,每个微液滴就是一个PCR反应空间。这些反应可以在相同的条件下平行地进行扩增,同时进行多重PCR。提高了目标扩增的通量,同时减少了宝贵的试剂和样品的消耗,避免了普通多重PCR不同引物和模板间的相互干扰,产生扩增效率的不一致和非特异性产物的出现。

1.2 微滴PCR技术的建立与发展

1998年,Tawfik等提出了油包水乳化液颗粒的概念,各种生化反应都可以在这个液体颗粒中完成。2001年Ghadessy等用乳化液颗粒进行DNA聚合酶的高效筛选,选出的DNA聚合酶耐热性高、对蛋白质抑制剂肝素具有高抵抗力。2003年,Nakano等在乳化液颗粒中进行PCR反应,结果发现每个DNA分子都可以进行有效扩增,由此产生了微滴PCR技术。微滴PCR是在将PCR反应中的水相与油相按一定比例、转速条件下混合,从而形成无数个大小相对均匀稳定且由乳化液分隔开的小水滴,每一个小水滴都是一个单独的PCR反应空间,从而使得各个PCR反应能够独立而互不干扰地进行。

微滴PCR技术的优点:(1)由于微滴PCR技术能够把不同DNA模板分隔在不同的油包水小水滴中,因此消除了反应过程中引物与引物之间、不同产物之间的相互杂交和不同产物之间的竞争抑制;(2)微滴PCR反应能同时扩增109个不同的DNA模板,实现了高通量;(3)灵敏度高。

和常规PCR相比,微滴PCR技术的缺点是增加了一步制备微滴颗粒的过程。微滴PCR实验的成功和制成相对均匀、稳定、大小合适的微滴颗粒息息相关,不同水油比、BSA和乙醚、搅拌子的大小、搅拌速度和时间等都会对微滴的形成造成很大的影响。因此,要摸索出这些影响因素的最佳量度是该技术的不足之处。

2 微滴PCR技术的应用

2.1 多重微滴PCR技术结合基因芯片方法在早孕期鉴别胎儿性别

在孕妇产前诊断中,通过性别鉴定可以对性别畸形以及性连锁遗传病的早期判断等起到积极的作用。性别鉴定主要方法有分子生物学方法、细胞学方法和超声波检查等。分子生物学方法和细胞学方法需要采集样品才能检测,而在采集样品过程中(例如羊水穿刺)具有一定的危险性和创伤性。超声波检查确诊时间较晚,因此上述方法在临床不能被广泛的应用。

进一步研究发现,孕妇外周血液存在的胎儿DNA可以用来对胎儿进行性别鉴定,该方法可减少创伤性诊断带来的危险。利用胎儿DNA进行性别鉴定的方法有很多,使用率较高有常规PCR法和巢式PCR法。由于常规PCR很容易受到DNA模板的污染以及孕妇外周血中DNA提取方法的不同,因此会导致检测的灵敏度和特异性受到影响。而微滴多重PCR技术中,微乳液系统含有上百万个油包水小液滴,每一个小液滴都是一个微型PCR反应器,从而可以避免引物间、模板DNA之间的相互影响。因此,多重PCR的微乳液体系提高了胎儿性别检测的灵敏度和特异性。基因芯片技术可以对胎儿DNA进行高通量检测,在提高检测的灵敏度以及特异性方面至关重要。

因此,微滴多重PCR偶联基因芯片技术以其高灵敏度和高特异性的优势,在早期鉴定胎儿性别以及对性连锁遗传病的筛选方面奠定了重要的基础。

2.2 定性、定量、高通量检测

传统生物基因定性、定量PCR检测技术每次只能对单一一种的基因进行检测,而对于基因成分不明确的样品,需要通过多种检测方法、进行多次实验才能确定,周期长、工作量大,且成本高。因此,在未来的生物基因检测中,这种检测技术已越来越不能胜任一次处理含有几种、十几种、几十种生物基因的样品检测的特殊需要,尤其是大数量的生物样品,需要更有效的、快速的高通量检测方法。

虽然多重常规PCR、定量PCR能一次实验可同时检测几种基因,但在同一反应管中进行多重PCR效果常常很差,产生非特异扩增,短的片段经常会被优先扩增,在同源区的重组常会产生人工片段。其关键是引物的设计,引物和引物之间,引物本身,产物和产物之间不能有错配,复杂的多重PCR引物设计必须依赖于较为大型的数据库和计算机模拟PCR结果,以及后期的验证,这个不是一般小型实验室可以完成的事情。

目前国内外一些机构及公司开展了高通量检测方法的研究,如Bio-Rad公司、SGS检测机构开发了一些转基因检测试剂盒等以及已经广泛应用于临床研究的基因芯片技术。然而这些检测方法成本非常高,技术复杂、人员要求高并且需要昂贵的仪器来完成。目前国内外的生物基因产品检测方法仍以单一的定性、定量PCR的检测方法为主。

我们实验室将微滴PCR和引物荧光标记技术结合起来建立了一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法。这种方法可以极大地提高核酸DNA分子分析的通量。这种复合检测方法,通常是将几对引物中的上游引物或者下游引物进行荧光标记后,进行多重微滴PCR,其PCR产物通过荧光分光度法进行定性、定量和高通量检测。

2.3 高通量测序中的应用

测序技术最早出现于1954年,早期测序技术主要是用化学降解法测定核酸序列。

在2005年Nature报道中,454 life science公司提出了一种基于微滴PCR的高通量测序技术,高通量测序技术的相关研究工作也由此展开。新一代高通量测序技术的代表者有ABI公司的SOLID测序平台、罗氏的454测序序技术平台和Illumina公司的Solexa测序平台。

2008年,454 life science公司及随后的Roche公司推出了全新的GS FLX System系列。GS FLX系统可以用“一个片段=一个磁珠=一条读长(one fragment=one bead=one read)”来概括。“一个片段=一个磁珠”是指一个DNA片段只与一个磁珠通过接头相连,所有的磁珠-DNA集合在一起构成了样品文库,然后把磁珠与扩增试剂进行微滴PCR。“一个磁珠=一条读长”指的是在每一个磁珠上进行一个焦磷酸测序反应,产生一条读长。而读长分析则是通过GS FLX系统来进行。

在文库构建和PCR扩增方面,与罗氏的454公司的GS FLX System系列类似,ABI公司的SOLID测序平台的微珠也是通过接头与DNA连接,然后进行微滴PCR。SOLID也有它的的独特之处,即只进行连接反应而不进行聚合酶延伸反应。

2.4 其他应用

我们可以用微滴PCR技术来建立一种高通量检测和筛选活性启动子和转录因子DNA结合位点的方法,也可以用微滴PCR技术来扩增复合基因文库。与此同时,该技术可以避免普通PCR发生偏移扩增和产生非特异性产物的现象。

3 展望

在微滴PCR技术的发展过程中,随着该技术的不断改进以及该技术与其他PCR技术的有效结合,代表微滴PCR技术已经发展到了一个新的阶段,微滴PCR已经在不断在向生命科学的各个领域进行渗透,相信在不久的将来,微滴PCR技术会以其独有的优势得到更加广泛而深入的应用和发展。

参考文献

[1]章爱娣,徐敏轩,韦婷,等.乳液PCR扩增复杂基因序列的方法建立及普通PCR的比较[J].南京晓庄学院学报,2012(6).

[2]Tawfik DS,Griffiths AD.Man-made cell-like compartments for molecular evolution[J].Nat Biotechnol,1998,16(7):652-656.

[3]Nakano M,Komatsu J,Matsuura S,et al.Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion[J].Biotechnol,2003,102(2):117-124.

[4]晏菱,葛芹玉,蒋小青等.微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用[J].现代医学,2007(2).

热启动PCR技术的研究进展 篇9

1 热启动PCR的产生背景及原理

在传统的PCR反应中, 反应体系各成分均是一次加入并进入循环, 在反应温度由室温 (25℃) 上升至高温 (94~95℃) 过程中, 可能发生引物错配和二聚体的形成。引物与模板中一些非靶位点的错配和引物之间形成的二聚体, 在Taq酶的作用下均可延伸。这些非特异性产物又可在以后的PCR循环中继续扩增, 使非特异性产物不断积累, 同时, 也消耗反应体系的各成分, 最终PCR扩增的特异性产物将大大减少。

热启动是一种在PCR反应中优化目标扩增产物的方法, 同时也抑制非特异扩增。这是利用各种物理化学方法控制PCR反应的必须组分, 如DNA聚合酶, 直到反应混合物被加热到可以阻止非特异引导和引物聚合的温度后, 再启动PCR来实现的, 达到有效扩增特异性PCR产物的目的。

2 扩增反应体系和影响因素

2.1 Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶主要用于合成DNA, 其最适反应温度为74℃左右, 在高温下 (95℃) 无明显不可逆变性。PCR反应所用的酶量可根据DNA、引物及其他因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加, 过少则使产量降低。

2.2 引物

PCR反应产物的特异性是由一对上下游引物所决定, 引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物长度约为15~30bp, 太短会降低退火温度, 影响引物与模板配对, 从而使非特异性增高;过长, PCR最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度, 降低产物的特异性。

2.3 四种三磷酸脱氧核苷酸

三磷酸脱氧核苷酸 (d NTP) 是生物体内与体外合成核酸的原料。一般在PCR反应中每种d NTP的浓度为20~200μmol/L。四种d NTP各20μmol/L, 足以在100μ反应中合成2.5μg的DNA。当d NTP终浓度大于

*通讯作者50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。

2.4 模板PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA

可以是单链、双链、线状或环状分子。模板DNA用量依DNA的性质而定。对于质粒DNA, 一般用ng量;对于染色体DNA一般用μg级。一般反应中的模板数量为102~105个拷贝。

2.5 缓冲液

反应缓冲液一般包含10~50mmol/L Tris.HCl (p H8.3~8.8) 、50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。Tris·HCl在20℃时p H值为8.3~8.8, 但在实际PCR反应中, p H值为6.8~7.8, 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外, 反应液可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇 (DDT) 可稳定酶活性。2.6 Mg2+Taq DNA聚合酶是依赖Mg2+的一种酶。Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大, 它可影响酶的活性和真实性, 影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。Mg2+过低时, 会降低Taq DNA聚合酶的活性;而过高的Mg2+浓度会使PCR扩增的特异性降低。

3 热启动PCR的方法

3.1 经典的热启动PCR方法

早在1989年, Sally等人在测定免疫球蛋白的重链可变区时, 为最大限度减少两引物3’端间的退火, 将PCR反应体系中的Taq DNA酶扣除, 直至循环仪温度上升至70℃后再加入, 这是最早的热启动PCR。1991年, D’Aqualia等人正式提出热启动PCR的概念, 并与传统PCR技术进行了对比实验, 证实热启动方法可显著增加特异产物的扩增量, 减少非特异性产物和背景, 使低拷贝的HIV病毒更易扩增。然而, 上述方法操作繁琐, 需反复开关PCR管盖, 加大了工作量, 同时也增加了样品交叉污染的机会。

后来人们在这种方法上进行了改良, 将PCR反应体系混匀后, 置于冰浴中。其他步骤不变。该方法取得了极好的扩增效果, 同时也减少了样品间交叉污染的几率和工作量。

3.2 发展的热启动PCR方法

3.2.1 作用于Taq DNA酶的方法

3.2.1. 1 单克隆抗体

1999年Hiroshi Mizuguchi等人根据Taq聚合酶特异抗原决定簇的单克隆抗体在常温下与DNA Taq聚合酶结合使其失去聚合作用的特性, 研制出了单克隆抗体, 它均由Taq DNA聚合酶制备。常温下这两个抗体分别与Taq DNA聚合酶结合, 无聚合酶延伸作用不能进行。当温度大于70℃时, 抗体失活, 同时释放出Taq DNA聚合酶。研究表明, 加入这两个抗体的目的基因的特异性扩增产物量比不加抗体的高得多, 这种方法也适于17.5kbp以上长片段的PCR反应。

3.2.1. 2 琼脂糖包埋

低熔点琼脂糖凝胶的熔点为65~70℃, 凝固点为37~40℃, 在室温下它是凝固状态的, 当加热到复性温度以上时 (一般品种的复性温度是55℃) 才开始融化、释放Taq酶发挥作用, 所以不会有更低温度时的非特异性扩增发生。低熔点琼脂糖的存在不影响PCR反应的进行。因此, 人们想出了一种简便方法。配制1.4%的低熔点琼脂糖凝胶水溶液, 于70℃水浴中均匀融化;再取与该水溶液等体积的Taq酶 (2U/μ) , 趁热将两液混合, 即得0.7%凝胶、1U/μTaq酶混合溶液;迅速将此混合溶液分装与PCR扩增管底部, 室温下令其凝固使酶得以包埋。进行PCR扩增时, 直接将其余试剂加于包埋管中即可。该方法包埋的Taq酶可于4℃存放3~4个月不失活。

3.2.1. 3 变异Taq DNA聚合酶

2003年Milko B.Kermekchiev等发现一种嗜热菌, 其DNA聚合酶在20~37℃时有显著活性。研究人员将这种酶的N端删除后获得了一种N-末端缺失的变异Klentaq DNA聚合酶。该酶会诱发部分错配, 当错配产物达到一定浓度时就会停止。即在前12~20个循环出现一种错配产物;25~30个循环出现另一种产物。所产生的产物均可用PEG沉淀消除。而该酶主要在24个循环时作用效果最佳。因此可以达到热启动的目的。

3.2.2 作用于引物的方法

3.2.2. 1 类发卡结构引物

一种带有茎环结构的寡核甘酸引物被研发并应用到实践中。这种引物不需要在末端添加任何染色物就可起到分子信标的作用。它的3’末端序列足够能与模板配对, 另外3’末端还有多余的5或6个核苷被加到5’末端形成类发卡的茎环结构。在PCR反应的初始阶段, 有茎环结构引物在DNA聚合酶的作用下不能发挥引物作用。当达到退火温度的时候, 引物的茎环结构自动打开并迅速结合到模板上, 启动扩增。

3.2.2. 2 双链引物

2004年研究人员提出了一种用双链引物取代单链引物的PCR热启动新方法。双链引物由两条长度相等的寡核甘酸组成, 其中一条寡核甘酸在PCR扩增过程中相当于普通的与模板结合或分离的单链引物, 被称为“引物链”。另一条引物作为引物带的互补, 它带有一个或数个错配的寡核甘酸, 在PCR反应过程中不能扩增, 即为“竞争链”。在低温时, 引物带与竞争带以双链的形式结合在一起, 尽管存在错配的现象, 但在有模板的情况下, 竞争链为来自模板的双链取代, 扩增只在特定条件下发生。

3.2.2. 3 热活性引物

热活性引物是指在3’末端和3’次末端核苷之间的连接处加入一个或两个不耐热的四氧化戊烷磷酸二脂基团, 在低温的情况下, 一个或多个四氧化戊烷磷酸二脂基团修饰过的引物能减少DNA聚合酶作用下的延伸。而这种四氧化戊烷引物在升温的过程中能产生相应的未被修饰的磷酸二脂引物, 该引物是DNA聚合酶的合适底物。当四氧化戊烷引物作为未被修饰的磷酸二脂引物替代物在PCR中使用时, 扩增目的片段的特异性和有效性将被提高。3.2.3作用于三磷酸脱氧核苷酸 (d NTP) 的方法2008年Inna Koukhareva等人制备了一些2’-脱氧核糖核苷和3’三磷酸基团被醚和酯取代的三磷酸脱氧核苷酸 (d NTP) , 这些d NTP不会在DNA聚合酶作用下发生反应。当PCR反应95℃短暂预热过程中这些3’修饰过的d NTP会转化为相应的未被修饰过的天然d NTP, 并有效的参与PCR扩增。经PCR产物分析表明, 有3’修饰过的d NTP参与的反应其扩增产物量增多, 非特异性产物减少, PCR反应显示出了良好的效果。

3.2.4 其他方法

2002年研究人员提出了一种提高PCR反应特异性的方法。该方法是通过改变Mg2+的浓度来控制DNA聚合酶的活性从而达到热启动的目的。Mg2+的浓度依赖于反应的温度, 在PCR反应中Mg2+在低温下受到束缚而在高温下得到释放。在低温的情况下改变Mg2+的浓度使反应受到束缚而在高温下改变Mg2+的浓度使其促进反应, 以达到减少非特异性扩增的目的。

另外, 人们发现短双链DNA片段有抑制DNA聚合酶活性的作用。这种抑制作用没有特异的顺序, 而是专一的依赖于片段的解链温度, 这个温度是根据片段之间的相互作用而制定出的熔解曲线来确定的。在PCR混合物中加入合适长度的短双链DNA片段, 能抑制退火温度以下非特异性扩增。

热启动PCR技术作为已成为PCR领域的研究热点之一, 并获得迅速发展。它在较难扩增的PCR反应如基因组DNA单拷贝序列的扩增、多重PCR和超长片段的扩增中的应用尤为突出。它能有效降低或消除非特异性产物以及引物二聚体的形成, 提高引物与模板结合的效率。进一步提高目的基因的扩增产物量, 是PCR反应更趋于完美。

参考文献

[1]D’Aquila T, et al.Maximizing sensitivity and specificity of PCR by preamplification heating.[J].Nucleic Acid Res..1991, 19 (13) :3749

[2]Hakes J, et al.DNA binding properties of the nuclear matrix and individual nuclear maxtrix proteins.[J].J Biol Chem.1991, 266 (17) :111131-11140

[3]Sally E, et al.Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.Nature.[J]1989, 341 (6242) :544-546

[4]Hiroshi M, et al.Characterization and Application to Hot Start PCR of Neutralizing Monoclonal Antibodies against KOD DNA Polymerase.[J].Synthetic Chemistry and Biological Chemistry.1999, 126 (4) :762

[5]Bruce A.PCR cloning protocols.[M].New Jersey:Humsns Press.1997

[6]Milko B., et al.Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR.[J].Nucleic Acids Res.2003, 31 (21) :6139-6147

[7]Kaboev O.K., et al.PCR hot strat using primers with the structure of molecular beacons (hairpin-like structure) [J].Nucleic Acids Res.2000, 28 (21) :94

[8]Deming K, et al.PCR hot-start using duplex primers.[J].Biotechnology Letters, 2004, 26:277-280.

[9]Alexandre V, et al.Hot Start PCR with heat-activatable primers:a novel approach for improved performance.[J].Nucleic Acids Res.2008, 36 (20) :131.

[10]Inna Koukhareva, et al.Heat Activatable3’-modified dNTPs:Synthesis and Application for Hot Start PCR.[J].Nucleic Acids Symposium Series.2008 (52) :259-260

[11]Ignatov K.B, et al.A New Approach to Enhanced PCRSpecificity.[J].Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2003, 29 (4) :368-371

实时荧光定量PCR技术的实验研究 篇10

关键词：荧光定量PCR技术,原理,主要类型,定量方法,优化

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。

1 荧光定量PCR技术的原理

荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规PCR无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个PCR循环反应,定量PCR仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,Ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与Ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。

2 荧光定量PCR技术的主要类型

荧光定量PCR所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR GreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括Taq Man、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。

2.1 SYBR GreenⅠ

SYBR GreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBR GreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。

2.2 Taq Man探针

Taq Man探针技术是有美国Perkin Elmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[8]。Taq Man探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[9]。

2.3 分子信标

分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶DNA序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶DNA无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[10]。

3 荧光定量PCR技术的定量方法

实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该技术,可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量方法包括绝对定量和相对定量。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的2个样本中的基因表达水平进行比较。

3.1 标准曲线法的绝对定量法

用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行PCR反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的Ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒ds DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ss DNA、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量转换成其拷贝数来确定。

3.2 双标准曲线法的相对定量法

在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得Ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和r RNA。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。

3.3 比较Ct法的相对定量法

如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因Ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较Ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出:

目的基因的量=2-ΔΔCt

在该公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。因此,2-ΔΔC t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线[11]。

4 荧光定量PCR技术实验条件的优化

定量PCR技术已经在生物学研究中得到了广泛的应用,技术也日臻完善,并且敏感度极高,特异性强;正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,必须根据不同的反应类型优化实验条件,如特异性探针及引物的设计、选择合适的Mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等,规范操作步骤,并仔细配制PCR反应体系。

4.1 引物及探针

一是设计要求。引物设计是实时定量PCR中最重要的一步,扩增片段长度根据技术的不同有所区别:SYBR green I技术要求扩增片段不大于500 bp,Taq Man探针技术要求扩增片段长度在50~150 bp。引物序列选取应在基因的保守区段并具有特异性,长度一般为18~24 bp,避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,引物自身不能形成环状发卡结构,熔解温度Tm值在55~65℃,GC含量在40%~60%,上、下游引物之间的Tm值相差不要超过4℃。在Taqman探针的设计上要求绝对保守,长度为30~45 bp,Tm值在68~70℃,探针的5’端不能为G和避免多个碱基同时出现,探针应尽可能靠近上游引物。二是浓度。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,引物浓度太低会致使反应不完全,引物浓度太高会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1~0.6μmo L/L,探针的浓度在0.05~0.30μmo L/L,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。三是稳定性。一般从生物技术公司定制引物是以干粉形式运输的,使用时最好用TE溶液溶解,使其最终浓度为100μmo L/L,-20℃保存。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以长达1年以上。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2μmo L/L(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。四是退火温度。退火温度一般设定比引物的Tm值低5℃。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度一般为55~70℃。

4.2 模板质量与浓度

模板的质量会影响PCR扩增的效率。模板应在-20℃保存,避免反复冻融。用TE溶液溶解和稀释模板,这能大大延长保质期。模板浓度应根据Ct值选择,使Ct值位于15~30个循环比较合适,若Ct值大于30,则应提高的模板浓度;如果小于15,则应降低的模板浓度。

4.3 镁离子浓度

Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素。Mg2+的浓度过高,会增加非特异性扩增,降低忠实性;Mg2+的浓度过低影响Taq酶发挥最佳活性。一般来说,对以DNA或c DNA为模板的PCR反应,应选择2~5 mmo L/L浓度的Mg2+。

4.4 循环数

一般的实时定量PCR反应只需25~30个循环便可获得满意的结果,但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,建议循环数为40个,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高。实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。

4.5 重复实验和阴性、阳性对照

定量实验,误差是不可避免的,设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小,因此定量实验的每个样本至少要重复3次以上。为了增加PCR扩增反应的可信度,在扩增的同时,需进行阴性、阳性对照反应。阴性反应中不加模板DNA,而以水或缓冲液代替,用于检验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操作上可能出现的问题。相对来说,仪器、PCR试剂、SYBR GreenⅠ染料是很稳定的,而操作和模板是薄弱环节,模板的加入量一定要准确,为确保实验数据的有效性,每个样品至少平行做3次重复。使用微量移液器时,如果不仔细,就会产生较大的用量误差甚至错误。在实验过程中应当避免室温下混合各种试剂,应在冰上进行,避免所配体系产生气泡,并且在一经混合后立即开始进行扩增。

5 结语

通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和控制反应条件,可以成功地建立快速、灵敏、特异的荧光定量PCR检测方法,实现大样本同时检测,节省大量的时间和反应成本。随着基因科学技术的发展,荧光定量PCR技术将会深入和拓展,在现代农业中得到更广泛的应用。

参考文献

[1]MIKAEL K A,JOSE M A,MARTIN B,et al.The real-time polymerasechain reaction[J].MoLecular Aspects of Medicine,2006(27):95-125.

[2]LERAT S,VINCENT M L.Real-time polymerase chain reaction quan-tification of the transgenes for roundup ready corn and roundup readysoybean in soil samples[J].Journal of Agricultural and Food Chemi-stry,2005,53(5):1337-1342.

[3]AGINDOTAN B O,SHIEL P J,BERGER P H.Simultaneous detection ofpotato viruses,PLRV,PVA,PVX and PVY from dormant potato tubers byTaqMan real-time RT-PCR[J].J Virol Methods,2007(142):1-9.

[4]SCHUBERT J,FOMITCHEVA V,SZTANGRET-WISNIEWSKA J.Diff-erenti-ation of Potato virus Y strains using improved sets of diagnosticPCR-primers[J].J Virol Methods,2007(140):66-74.

[5]SINGH R P,NIE X,SINGH M.Duplex RT-PCR reagent concentrations atreverse transcription stage affect the PCR performance[J].J Virol Methods,2000(86):121-129.

[6]KE L D,CHEN Z,YUNG WK.A reliability test of standard-based quan-titative PCR:exogenous vs endogenous standands[J].MoL Cell Probes,2000,14(2):127-135.

[7]BECKER K,PAN D,WHITELY C B.Real-time quantutative polymerasechain reaction to assess gene trnsfer[J].Hum Gene Ther,1999(10):2559-2566.

[8]HIGGIS J A,EZZELL J,HINNEBUSCH BJ,et al.Nuclease PCR assay todetect Yersinia pesits[J].J Clin Microbiol,1998(36):2284-2288.

[9]YIN J L,SHACKEL N A,ZEKRY A,et al.Real-time reverse transcri-ptase polymerase chain reaction(RT-PCR)for measurement of cytokineand growth factor mRNA Expression with fluorescent Probes or SYBRGreen I[J].Immunol Cell Biol,2001,79(3):213-221.

[10]朱捷,杨成君,王军.荧光定量PCR技术及其在科研中的应用[J].生物技术通报,2009(2):73-76.