黄芩苷生物技术论文

2022-04-20

[摘要]探索研究纳豆菌液体发酵黄芩药材制备黄芩素和汉黄芩素的工艺，利用纳豆菌所产生的活性酶对黄芩苷和汉黄芩苷进行生物转化，以提高黄芩中黄芩素和汉黄芩素的含量。今天小编为大家精心挑选了关于《黄芩苷生物技术论文(精选3篇)》的文章，希望能够很好的帮助到大家，谢谢大家对小编的支持和鼓励。

黄芩苷生物技术论文篇1：

蒲地蓝消炎口服液黄芩苷与菊苣酸含量测定方法的优化

【摘要】目的：建立可以同时检测蒲地蓝消炎口服液中黄芩苷与菊苣酸含量的分析方法，降低分析时间、提高检测效率。方法：采用Agilent Zorbax SB-Pheny1（75 mm×4.6 mm，3.5μm）色谱柱，流动相为水-乙腈-甲醇-磷酸（75∶15∶10∶0.2），柱温为40℃，检测波长为326nm，流速梯度洗脱。结果：黄芩苷与菊苣酸分离度良好，单次分析时间为23min，两组分分别在90.58～1449.3μg、5.475～54.75μg范围内线性关系良好（黄芩苷r=0.9999、菊苣酸r=0.9998）；黄芩苷与菊苣酸的平均回收率（n=6）分别为99.72%、99.38%。结论：该方法快速、准确，适用于蒲地蓝消炎口服液中黄芩苷与菊苣酸的检测。

【关键词】蒲地蓝消炎口服液；黄芩苷；菊苣酸

蒲地藍消炎口服液由蒲公英、苦地丁、板蓝根、黄芩等四味中药按相应比例配伍，经过现代提取工艺提取并配制而成的纯中药口服制剂，具有清热解毒，消肿利咽的功效，主要用于疖肿、腮腺炎、咽炎、扁桃体炎的治疗[1-2]。研究表明，蒲地蓝消炎口服液对小儿手足口病[3-4]、上呼吸道感染[5-6]也具有良好的临床治疗效果，有“天然抗生素”的美称。

黄芩苷为黄芩中的主要有效成分，具有抗菌、抗病毒、清除氧自由基、解热、镇静、调节免疫等作用[7-8]；菊苣酸为方中君药蒲公英中的一种酚酸类化合物，具有抗菌、抗病毒、提高免疫力、抗炎、抗氧化等作用[9-11]。2015年版《中国药典》中分别采用两种方法对产品中的黄芩苷、菊苣酸的含量进行了测定，该方法由于检测耗时较长，不利于生产过程中对产品进行质量控制，研究欲建立一种同时测定黄芩苷和菊苣酸含量的测定方法，以缩短中间体检测时间，提高检测效率。

1 仪器与材料

1.1 仪器 20AT型液相色谱仪（日本岛津）；XS205型电子分析天平（Mettler）。

1.2 材料黄芩苷对照品（批号：110715-201016，含量以94%计）、菊苣酸对照品（批号：111752-200902，含量以99.9%计）均购于中国食品药品检定研究院；蒲地蓝消炎口服液（济川药业集团有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品48.18mg，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为黄芩苷储配液；精密量取黄芩苷储配液8mL、4mL、2mL、1mL、0.5mL，分别置10mL量瓶中，用甲醇依次稀释成不同浓度的黄芩苷系列溶液，备用。精密称取菊苣酸对照品13.7mg，置100mL量瓶中，加乙腈-水（20∶80）至刻度，摇匀，作为菊苣酸储配液；精密量取菊苣酸储配液10mL、7.5mL、4mL、2mL、1mL，分别置25mL量瓶中，用乙腈-水（20∶80）依次稀释成不同浓度的菊苣酸系列溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备精密量取蒲地蓝消炎口服液5mL，置50mL量瓶中，加乙腈-水（20∶80）稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件色谱柱：Agilent SB-Pheny1（75mm×4.6mm，3.5μm）；流动相：水-乙腈-甲醇-磷酸（75∶15∶10∶0.2）；柱温：40℃；检测波长：326nm；进样量：10μL；流速为梯度洗脱见表1。

2.3 分离度试验精密量取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。菊苣酸、黄芩苷出峰时间及菊苣酸峰、黄芩苷峰与附近峰的分离度，典型色谱图如图1所示。菊苣酸出峰时间为4.468min，与附近峰分离度为2.23；黄芩苷出峰时间为8.241min，与附近峰分离度为1.94。

2.4 线性关系考察分别精密吸取“2.1.1”项下黄芩苷、菊苣酸不同浓度的系列溶液各10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。以浓度对峰面积作图，黄芩苷、菊苣酸回归方程分别为：Y黄芩苷=17463X+22877（r=0.9999），Y菊苣酸=39724X+15518（r=0.9998），黄芩苷在90.58～1449.3μg范围内，菊苣酸在5.475～54.75μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验取同一批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果黄芩苷、菊苣酸峰面积的RSD分别为0.15%、0.14%，表明仪器精密度良好。

2.6 溶液稳定性试验取同一批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1.5、3、6、9、12、18、24h按“2.2”项色谱条件测定，记录峰面积。结果黄芩苷、菊苣酸峰面积的RSD分别为0.94%、0.84%。表明供试品溶液在24h内较稳定。

2.7 重复性试验取同一批样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别按“2.2”项色谱条件进行测定。结果黄芩苷、菊苣酸的平均含量分别为10.68mg·mL-1、0.269mg·mL-1，以含量结果计算RSD（n=6）分别为0.96%和1.1%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密量取已知含量的蒲地蓝消炎口服液2.5mL，共6份，置50mL量瓶中，分别加入黄芩苷对照品约26.7mg、菊苣酸对照品储备液（0.137mg/mL）5mL，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，计算回收率。结果黄芩苷、菊苣酸的平均回收率分别为99.72%、99.38%，RSD（n=6）分别为0.92%、0.99%。

2.9 方法对比分别按照2015版《中国药典》蒲地蓝消炎口服液中蒲公英（菊苣酸）、黄芩（黄芩苷）检测方法、以及“2.1、2.2”项下分析方法对6批蒲地蓝消炎口服液中蒲公英（菊苣酸）、黄芩（黄芩苷）含量进行检测，结果见表2。

3 讨论

分别采用紫外-可见分光光度计及二极管阵列检测器在210～400nm分析對照品和供试品溶液，发现在326nm处菊苣酸有最大吸收，而黄芩苷的两个最大吸收峰分别为278nm和315nm，由于黄芩苷在样品中含量较高，而菊苣酸在样品中含量偏低，参考相关文献[12-13]，为提高菊苣酸的检测灵敏度，选择了326nm波长处同时测定两种成分的含量。实验结果表明，在326nm处测定黄芩苷与原方法选定的280nm测定结果基本一致。

2015版《中国药典》对于蒲地蓝消炎口服液除了维持原有黄芩（黄芩苷）含量检测指标不变的基础上，增加了蒲地蓝消炎口服液中蒲公英（菊苣酸）含量测定，但菊苣酸药典方法的单针进样分析时间长达65min。在蒲地蓝消炎口服液尤其是中间体（配制液）检测过程中，不计对照品，单批次4针检测时间为260min，耗时较长，在一定程度上增加了产品的产出周期，而文中研究方法不仅将检测时间大大缩短，也实现了一种方法同时分析黄芩苷、菊苣酸含量的效果。运用本方法检测蒲地蓝消炎口服液中间体，不仅利于生产安排、消除生产瓶颈、降低分析成本、减少排污，同时也降低了配制液在等待检测过程中的污染风险，提高了产品过程中的控制力度。

综上，研究建立的HPLC法同时测定黄芩苷及菊苣酸的含量，方法可行，适用于蒲地蓝消炎口服液生产过程中的质量控制。

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（收稿日期：2018-02-22 编辑：程鹏飞）

作者：苏万福杨学芳王琨

黄芩苷生物技术论文篇2：

纳豆菌液体发酵转化黄芩苷和汉黄芩苷的工艺研究

[摘要] 探索研究纳豆菌液体发酵黄芩药材制备黄芩素和汉黄芩素的工艺，利用纳豆菌所产生的活性酶对黄芩苷和汉黄芩苷进行生物转化，以提高黄芩中黄芩素和汉黄芩素的含量。通过考察不同碳源、氮源及无机盐的种类和浓度、培养基pH、药材粉碎度、装液量、摇床转速、液料比、发酵时间等因素对发酵工艺的影响，以黄芩素和汉黄芩素的含量为评价指标，优选得到黄芩生物转化生成黄芩素和汉黄芩素的液体发酵最佳工艺为蛋白胨质量分数为1.0%，氯化钠0.05%，pH 6.0，黄芩药材粉碎过40目，装样量33%，摇床转速200 r·min^-1，液料比5∶1，温度37 ℃，发酵6 d，黄芩药材中黄芩苷的转化率为97.6%，汉黄芩苷转化率97.0%。验证试验表明该工艺稳定可行，为黄芩素和汉黄芩素的工业化生产提供数据参考。

[关键词] 纳豆菌；黄芩；液体发酵；黄芩素；汉黄芩素；工艺优化

黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，其中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类成分是其主要活性成分，具有抗炎，抗菌，抗肿瘤，抗氧化，调节免疫，抗抑郁等广泛药理作用[17]。据相关文献报道[89]，黄芩苷和汉黄芩苷不易被人体直接吸收，需经肠道菌群作用水解成苷元黄芩素和汉黄芩素后，发挥其药效作用。而黄芩药材中黄芩素和汉黄芩素的含量相对较低[10]，因此黄芩素和汉黄芩素还远不能满足市场需求和临床应用，目前，黄芩素和汉黄芩素的提取大多是从药材中直接提取，近年来虽有一些文献报道利用侧耳菌、黑曲霉[11]、米曲霉[12] 对黄芩进行生物转化，但其所用菌种也多属真菌类，难免会产生安全性问题，并且转化率相对较低。

本实验选取的纳豆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，该菌是从纳豆食品中提取而得，在其发酵过程中还会生成例如纳豆激酶、超氧化物歧化酶等多种活性酶，且属于益生菌[13]。黄芩苷和汉黄芩苷中的葡萄糖醛酸键，不易被水解，而通常采用的是酸、碱水解等化学方法进行水解。用纳豆菌发酵黄芩，其代谢产生的活性酶能较好地水解苷元中的葡萄糖醛酸键，将黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷转化成黄芩素和汉黄芩素，本研究采用单因素试验考察获得纳豆菌液态发酵黄芩的最佳发酵培养基和最优发酵条件，从而提高黄芩的利用率。

1材料

Agilent1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），SG8200H 型超声仪（上海冠特超声仪器有限公司），TB215D 型1/10万分析天平（德国赛多利斯股份公司），THZ92B汽浴恒温振荡器（上海浦东物理光学仪器厂），大型恒温摇床（江苏天竟实验仪器厂），GZX9246 MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），甲醇与乙腈均为色谱级，娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

黄芩苷，黄芩素对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110715201318，111595200905），汉黄芩苷，汉黄芩素对照品（购自四川维克奇生物科技有限公司，批号分别为130603，130612，纯度均≥98%），试验用黄芩药材（购自贵阳同济堂药店）经贵州医科大学药学院药用植物与生药学教研室龙庆德副教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。纳豆菌Bacillus natto购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC10023），购入后在本实验室进行传代保存。

2方法与结果

2.1培养基的制备及发酵培养

斜面培养基：营养琼脂3.3 g，加去离子水100 mL。种子培养基：NaCl 6 g，牛肉膏6 g，蛋白胨12 g，加双蒸水1 000 mL，1.0 mol·L^-1 NaOH调节pH至7.0。以上2种培养基均在121 ℃条件下高压灭菌30 min。

将纳豆菌菌种接种于斜面培养基上，于37 ℃培养 12 h，将活化的纳豆菌转接于种子培养基中，在37 ℃，180 r·min^-1条件下培养，即可用于接种发酵。称取粉碎后的黄芩10 g，接种液体种子培养基，进行发酵。

2.2供试品溶液的制备

同批液体发酵后的黄芩药材于50 ℃干燥12 h 至恒重，精密称取6份干燥样品，每份0.5 g，各加入甲醇25 mL，超声提取30 min，过滤，滤渣加甲醇 25 mL 超声提取 30 min 后过滤，合并滤液，吸取滤液1 mL 用甲醇定容至10 mL，过 0.45 μm微孔滤膜滤过，4 ℃冰箱储存备用。

2.3含量测定

2.3.1色谱条件[14] 迪马Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇（A）乙腈（B）0.2%磷酸水（C）（20∶20∶60），梯度洗脱（0～28 min， 20%～35% A， 20%～35% B；28～32 min， 35%～20% A， 35%～20% B），柱温35 ℃，流速1.0 mL·min^-1，检测波长278 nm，进样量10 μL。色谱图见图1。

2.3.2标准曲线的绘制精密称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品适量，用甲醇超声溶解，配制成质量浓度分别为145.6，129.8，98.6，106.3 g·L^-1的对照品溶液，将对照品溶液分别稀释成6个不同浓度。按2.3.1项下色谱条件测定，以各对照品进样量（μg）为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程分别为Y=1.99×103X-60.70（r=0.999 8），Y=5.29×103X-59.70（r=0.999 8），Y=3.41×103X-0.800 6（r= 0.999 9），Y = 5.16×103X-6.866 8 （r= 0.999 9），线性范围分别为27～1 456，35～1 298，4.9～246.5，42.5～318.9 ng。

2.3.3精密度试验精密吸取黄芩素、汉黄芩素对照品溶液各10 μL，重复进样6次，计算RSD分别为0.14%，0.10%，试验结果表明仪器精密度良好。

2.3.4重复性试验精密称取同一批黄芩发酵样品6份，按2.2项下样品的制备方法处理后，按2.3.1项下色谱条件测定，结果显示所测RSD分别为0.11%，0.10%，表明该方法重复性良好。

2.3.5稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件，于室温下分别在0，2，4，8，12，24 h进行测定，黄芩素和汉黄芩素的RSD分别为0.32%，0.21%，表明该样品在24 h内稳定性良好。

2.3.6回收率试验取同一批发酵样品9份，分别按80%， 100%， 120% 加入黄芩素和汉黄芩素对照品，按照2.2项下样品制备方法，计算平均回收率分别为99.90%， 100.3%， RSD分别为0.87%， 1.1%。

2.4发酵培养基单因素试验考察

2.4.1碳源的筛选分别选取米粉、蔗糖、葡萄糖、豆油、淀粉、甘油等6种物质为发酵液的碳源，其质量分数均为1.0%，取适量黄芩，加蒸馏水灭菌30 min，按10%接种量接入纳豆菌种，37 ℃在摇床中200 r·min^-1培养6 d，结果见图2，不同碳源对转化产物黄芩素和汉黄芩素含量影响差异无统计学意义，故本实验不需另添加碳源。

2.4.2氮源的筛选本实验选取蛋白胨、酵母粉、氯化铵、硫酸铵、玉米粉、牛肉膏为氮源，质量分数均为1.0%，发酵结果见图3，当氮源为蛋白胨时，转化后的黄芩素和汉黄芩素的量最大，质量分数分别达到8.16%，2.58%，所以选择蛋白胨作为发酵液培养基的氮源。

2.4.3无机盐的筛选分别考察氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、氯化锌对转化的影响，均配制成质量分数为0.05%的溶液。结果见图4，氯化钠对转化产物黄芩素、汉黄芩素的产量增加最多，黄芩素和汉黄芩素质量分数分别为 8.17%，2.46%，所以选用氯化钠作为最佳无机盐。

2.4.4蛋白胨浓度的筛选为了获得黄芩液体发酵培养基的蛋白胨最佳浓度，将质量分数分别调至0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.5%，转化结果见图5，当蛋白胨的质量分数达到1.0%时，转化产物的量的最大，黄芩素和汉黄芩素的质量分数分布为8.25%，2.38%，因此选取蛋白胨质量分数为1.0%。

2.4.5NaCl浓度的筛选本实验将培养基中氯化钠质量分数分别调至0.01%，0.03%，0.05%，0.08%，0.10%，发酵结果见图6，当NaCl质量分数为0.05%时转化产物的量最高，黄芩素和汉黄芩素的质量分数分别达到8.17%，2.21%，因此选取氯化钠的质量分数为0.05%。

2.4.6培养基pH筛选将培养基的初始pH分别调至5.0， 6.0， 7.0， 8.0进行发酵，结果见图7，当液体培养基发酵起始pH为6.0时，转化产物的量最大，黄芩素和汉黄芩素的质量分数分别为8.39%，2.26%，因此选择培养基初始pH 6.0对黄芩药材进行发酵。

2.5发酵培养基优化正交试验

在单因素确定碳源、氮源、无机盐及初始pH基础上，选择蛋白胨、 NaCl、培养基pH为考察因素，按3因素3水平对各因素进行正交试验，结果见表1，2。各因素对黄芩素和汉黄芩素的转化率影响顺序为C>A>B。由方差分析表可知，蛋白胨和培养基pH具有显著性差异，氯化钠虽不具有显著性差异，但结合单因素试验结果，确定最佳发酵培养基条件为A2B2C2 ，即蛋白胨质量分数为1.0%，NaCl 0.05%， pH 6.0。

2.6发酵条件的优选试验

在确定最佳发酵培养基的配比条件下，对发酵条件逐一进行优化，分别对药材粉碎度、发酵时间、装液量、摇床转速、液料比进行单因素考察。

2.6.1粉碎度对发酵的影响分别选取原药材饮片及过20，40，60 目药材进行发酵，随着药材粉碎度的增大，黄芩素和汉黄芩素的量也逐渐增加，过40目与60目样品中黄芩素和汉黄芩素的量相当，见图8，从成本和时间角度考虑，选取过40目的黄芩样品进行发酵。

2.6.2发酵时间的选择取黄芩粉末（过40 目筛），加适量蒸馏水，于37 ℃在摇床中培养，每24 h取样一次，到第6天转化产物的量达到最大值，黄芩素和汉黄芩素的质量分数分别达到8.68%，2.51%，从第7天转化产物的量开始降低，因此选择发酵条件在第6天截止，结果见图9。

2.6.3不同装液量对发酵的影响本实验选取等量黄芩粉末（过40 目筛）于300 mL三角瓶中，分别添加30， 50， 80， 100， 150， 200 mL的蒸馏水并灭菌30 min。结果见图10，在此条件下当装液量为100 mL时转化产物的量最高，黄芩素和汉黄芩素的质量分数分别达到8.25%，2.20%。

2.6.4不同转速对发酵的影响分别选取3种不同转速180， 200， 220 r·min^-1 对黄芩药材进行发酵，黄芩素质量分数分别为8.01%，8.30%，7.57%，汉黄芩素分别为2.05%，2.22%，1.91%，因此选择200 r·min^-1 对黄芩进行液体发酵。

2.6.5不同液料比对发酵的影响分别选取液料比在5∶1，10∶1，15∶1，20∶1条件下进行考察，结果见图11，当液料比5∶1时黄芩素和汉黄芩素的含量相对较高，黄芩素和汉黄芩素的质量分数分别达到8.29%，2.29%，因此选择液料比5∶1作为发酵条件。

2.7液体发酵工艺验证试验

通过优选工艺，得到最佳发酵条件，即蛋白胨质量分数1.0%，NaCl 0.05%， pH 6.0，黄芩药材粉碎后过40目，液料比5∶1，装样量33%，摇床转速200 r·min^-1，温度37 ℃，发酵6 d。采用优化后的发酵条件进行验证试验，经过3次重复试验，黄芩素质量分数分别为8.66%，8.89%，8.76%，汉黄芩素分别为2.52%，2.60%，2.53%，证明该工艺稳定可行。

3讨论

本实验通过对黄芩液体发酵所需各种添加成分的优选研究，发现碳源的添加对转化产物黄芩素和汉黄芩素的含量无明显影响，这可能与黄芩药材含有大量的淀粉和纤维等物质有关，这些物质在黄芩发酵过程中被分解，并为纳豆菌繁殖提供丰富的碳源，故发酵培养基中不需另加碳源。纳豆菌作为一种益生菌，发酵过程中不会产生对机体有害的代谢产物[15]。纳豆菌发酵黄芩有利于中药黄芩的再次开发利用，对于传统中药的现代化发展具有一定的意义，所以本实验选取纳豆菌作为中药黄芩的发酵转化菌种。近年来，虽有相关文献报道利用侧耳菌、黑曲霉[11]、米曲霉[12] 、蓝藻[16]对黄芩和黄芩苷进行生物转化，但转化率相对较低。本实验所用黄芩原药材中黄芩苷质量分数为10.67%，汉黄芩苷2.7%，黄芩素0.61%，汉黄芩素0.03%，在经纳豆菌发酵后黄芩苷和汉黄芩苷分别只有原来的0.26%，0.08%，而发酵后黄芩中黄芩素为8.74%，汉黄芩素2.55%，发酵后黄芩中的黄芩苷转化率为97.6%，汉黄芩苷转化率97.0%。本研究通过优选工艺得到纳豆菌液体发酵黄芩最佳培养基条件和最优发酵工艺参数，即蛋白胨质量分数1.0%，氯化钠0.05%，pH 6.0，黄芩药材粉碎过40目筛，液料比5∶1，装样量33%，摇床转速200 r·min^-1，发酵温度37 ℃，发酵6 d。

利用微生物转化法制备黄芩素和汉黄芩素，具有反应条件温和、副产物少、后处理简单等优势。微生物转化为中药的发展开辟了新的研究方向，具有广阔的发展前景，是现代生物技术和中药研究的完美结合，传统中药经过生物转化，可提高中药有效成分的含量，并能达到减毒增效的目的，深入研究中药发酵的原理及其规律，对提高我国中药行业的国际竞争力具有积极促进作用。

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[责任编辑孔晶晶]

作者：龙厚宁张硕 姚磊张敏王鹏娇孟小夏高秀丽张荣平

黄芩苷生物技术论文篇3：

高糖环境下不同浓度黄芩苷对人肾小管上皮细胞凋亡的影响

【摘要】目的：研究在高糖环境下不同浓度黄芩苷干预对人肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法：本研究通过体外实验，分别检测在高糖环境下不同浓度黄芩苷干预24h、48h、72h 上皮细胞增殖及凋亡情况，并同时设立阴性对照组（低糖组）、阳性对照组（高糖组）和阳性药物对照组（RGZ）。结果：24h、48h时间点，黄芩苷干预下的上皮细胞以促进增殖、抑制凋亡为主要表现；72h时间点，低剂量黄芩苷（50、100μmol/L）干预下的上皮细胞仍以促进增殖、抑制凋亡为主要表现，但高剂量黄芩苷组别（200μmol/L）干预下的上皮细胞以抑制增殖、促进凋亡为主要表现。在高糖环境下黄芩苷可抑制上皮细胞凋亡，与阳性药物对照（RGZ）的趋势一致。结论：黄芩苷可能通过抑制细胞凋亡的药理作用，发挥对肾脏的保护作用。

【关键词】黄芩苷；人肾小管上皮细胞（HK-2）；细胞凋亡；糖尿病

Effect of Baicalin Bai on HK-2 cells Apoptosis in High GLucose Medium

SUN Tao1，2HUANG Zhujuan1SU Ning1*

1.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China；2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Co.， Ltd ， Guangzhou 510730， China

糖尿病肾病[1] （diabetic nephropathy，DN）是以肾脏微血管病变作为最主要表现的糖尿病并发症，也是造成慢性肾衰的主要病因，发病机制尚不完全清楚。近年来，随着研究的深入，证实细胞凋亡参与DN发生机制。细胞凋亡是机体内细胞死亡的重要途径[2]，细胞的死亡和更新是多细胞生物整个生命过程中不可缺少的环节，可及时清除机体内的多余细胞和受损伤细胞，对各组织器官的发育及免疫系统的建立发挥重要作用。通常情况下，细胞凋亡过程受机体内严格调控，以维持整个生命过程中各组织器官的稳定性。但当细胞凋亡调控失衡时，可引起细胞过度增殖或过度凋亡，都是导致糖尿病肾病患者肾功能进一步恶化的重要因素之一。

传统药物黄芩（scutellaria baicalensis georgi）为唇形科植物黄芩的干燥根，迄今己有2000多年的药用历史，该药在《神农本草经》中列为中品，用于“诸热黄胆，肠泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡”。黄芩苷（baicalin bai，BB）是从黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化、治疗或预防糖尿病及其并发症等药理作用[3]。在前期研究中发现黄芩苷对糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用[4-8]。在此基础上，本文通过体外实验，观察在高糖环境下不同浓度的黄芩苷对人肾小管上皮细胞（HK-2）细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1主要实验材料HK-2细胞株购自于中山大学实验动物中心，盐酸罗格列酮标准品、黄芩苷标准品（广东省食品药品检验所，批号20141201），DMEM 低糖和高糖培养基、胰蛋白酶（上海立菲生物技术有限公司），胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司），噻唑蓝（MTT，美国sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，美国sigma公司）。

1.2细胞培养及分组HK-2细胞株置于体积分数为5%CO2的37℃恒温培养箱中用含10%FBS的DMEM低糖培养基传代培养，胰蛋白酶消化细胞后，用计数板计数，按以4000/孔的密度接种于96孔板，每孔加入100μL 含10%FBS的低糖培养液培养24h，使细胞同步于G0期。弃去培养液，将HK-2细胞随机分为7组（每组设5个复孔）：A组（NG）：DMEM 低糖培养液（D-葡萄糖浓度为5.5mmol/L）；B组（HG）：DMEM 高糖培养液（D-葡萄糖浓度为25mmol/L）；C组（HG+R5）：DMEM 高糖培养液和RGZ（终浓度为5μmol/L）；D组（HG+R10）：DMEM 高糖培养液和RGZ（终浓度为10μmol/L）；E组（HG+BB50）：DMEM 高糖培养液和BB（终浓度为50μmol/L）；F组（HG+BB100）：DMEM 高糖培养液和BB（终浓度为100μmol/L）；G组（HG+BB200）：DMEM 高糖培养液和BB（终浓度为200μmol/L）。分别干预24、48、72h，共设3个实验观察点。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖当实验点结束（24、48、72h）时，使用浓度为5mg/mL的MTT溶液加入待测孔，孵育4h，弃去废液，重新加入DMSO 150μL /孔，振荡10min后，放入iMark 吸收光酶标仪（选择490nm波长，Bio-Rad 公司）进行检测并记录结果（OD值）。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率采用AnnexinV-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）双标记染色法检测细胞凋亡情况。按上述分组方法，以4000/孔的密度将细胞培养于96孔板中，当实验点结束（24、48、72 h）时，用流式细胞仪检测各组肾小管上皮细胞的凋亡率（Q2+Q4）。

1.5统计学处理使用SPSS17软件进行统计并orgin pro 8.0绘图，数据以均数加减标准差（x±s）表示，数据采用Bartlett球形检验方差齐性，方差齐性时多组间两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），Post-hoc 检测采用 Tukey方法；方差不齐时采用Kruskal-Wallis H进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2实验结果

2.1高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK-2细胞增殖的影响在24h的实验点中，B组、C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。F组与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其余组别与B组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在48h的实验点中，B组、C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。B组、C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在72h的实验点中，B组、C组、D组、E组和F组与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组别与A组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。C组、D组和F组与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其余组别与B组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结果详见表1和图1。

2.2高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK-2细胞凋亡率的影响在24h的实验点中，C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。在48h的实验点中， C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。在72h的实验点中，B组、C组、E组和与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；D组、F组与A组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果详见表2。

3讨论

MTT比色法是目前检测细胞增殖的常用手段之一，其主要原理[9]是利用四甲基偶氮唑盐在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。在研究中观察到，在高糖环境下，HK-2细胞增殖快速（B组与A组比较），低、中浓度黄芩苷影响下的HK-2细胞增殖快速，高浓度黄芩苷影响下的HK-2细胞增殖受抑制，72h观察时间点最为显著。提示高糖对HK-2细胞产生双重效应，既能诱导细胞增殖，在高浓度药物环境下，又可抑制细胞增殖。本实验使用的阳性对照组（RGZ）的HK-2细胞增殖情况与既往研究的报道[10]基本一致。

流式Annexin V/PI 双染法是目前比较常用、灵敏较高的细胞凋亡测定方法，其主要原理是通过Annexin V-FITC和PI双重荧光标记以区分正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。在研究中观察到，在高糖环境下，HK-2细胞凋亡显著增多（B组与A组比较），结合MTT检测结果提示在高糖环境下HK-2呈高增殖伴高凋亡率。在药物（包括BB、RGZ）影响下，可显著降低凋亡率。但是高浓度黄芩苷（G组）在72h观察时间点的凋亡率较其他用药组别显著升高，结合MTT检测中低增殖的表现，考虑高浓度黄芩苷促进HK-2细胞凋亡，抑制HK-2细胞增殖，而低、中浓度黄芩苷抑制HK-2细胞凋亡、促进HK-2细胞增殖。

本研究结果与前期研究结果[4-8]提示黄芩苷可能通过抑制细胞凋亡的药理作用，发挥对肾脏的保护作用。

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