我校生物技术论文提纲

2022-11-15

论文题目：CKAP4在腹膜透析腹膜纤维化中的作用机制及临床应用

摘要：研究背景和目的腹膜透析（peritoneal dialysis PD）是终末期肾病（end stage renal disease ESRD）患者的主要替代治疗方式之一,PD患者呈逐年增加趋势。PD最大的挑战就是如何长期保持腹膜的完整性。然而,腹膜组织持续暴露于生物不相容的腹透液以及反复发作的腹膜炎或其它病变导致的腹腔急慢性炎症引起的腹膜损伤,会逐渐导致腹膜纤维化和血管生成增加,最终导致超滤失败。而目前参与腹膜功能损害的病理生理机制尚不清楚。在临床中也尚无对腹膜纤维化早期诊断的指标及相应的有效治疗措施.因此,深入研究腹膜纤维化的具体发生机制可为其后续治疗提供一个理论依据,从而提高患者腹膜透析的质量,延长腹膜透析的治疗时间。目前关于腹膜纤维化的发生机制研究提示腹膜纤维化包括互相协同的两个部分,即纤维化过程本身和由生物不相容的PD溶液或感染导致的腹膜炎。既往多项研究结果显示腹膜间皮细胞向间充质的转化（epithelial-to-mesenchymal transition EMT）在长期PD导致腹膜纤维化过程中较为关键,在EMT和腹膜纤维化过程中,关键的纤维化因子通过其细胞膜上的受体和特定的下游细胞内信号级联触发转录,作用于细胞基质基因启动子区域以激活其转录的因子。目前研究显示多条信号转导级联和腹膜纤维化的发生机制密切相关,包括经典的TGF-β/Smad信号通路和非Smad信号通路。但无论是何种信号通路,最终都是通过促进腹膜间皮细胞发生EMT导致腹膜纤维化。细胞骨架相关膜蛋白 4（Cytoskeleton-associated membrane protein 4 CKAP4）又称P63/CLIMP-63,分子量63KD,是一种可逆酰基化,非糖基化的Ⅱ型转膜蛋白。在多种细胞系中均可发现其表达。目前的研究多集中在CKAP4与肿瘤的关系,CKAP4和肿瘤的增殖、转移及预后有关。我们前期在肝癌中研究发现CKAP4/EGFR形成异二聚体共同调控EGFR/Gab1/Akt信号通路,抑制EMT的发生,从而抑制肝癌细胞的转移。另外,在二乙基亚硝胺诱导大鼠发生肝硬化及肝癌过程中,结果显示肝硬化的组织中CKAP4表达明显强于正常组织。提示CKAP4与肝脏纤维化的发生存在一定的关系。近期研究表明CKAP4的表达与已知的小鼠和人心肌成纤维细胞活化标志物成正相关,并可调节心脏成纤维细胞的活化,提示CKAP4可作为成纤维细胞活化的一种新的标志物。根据以往的研究结果我们可以看出CKAP4与组织纤维化的发生密切相关,其中最主要的调节机制可能和EMT相关,而既往的研究结果提示EMT是腹膜纤维化中比较关键的过程。据此,我们推测CKAP4可能和腹膜纤维化的发生有关,其调控机制可能和EMT有关。为验证以上推论,本课题首先观察了 CKAP4在长期腹膜透析患者中腹膜间皮细胞中的表达情况。在体内和体外实验,明确CKAP4高低表达对腹膜纤维化的调控作用及作用机制。最后通过测定规律腹膜透析患者血清及腹膜透析液中CKAP4的浓度,分析其浓度变化的相关影响因素,并评估其作为腹膜纤维化早期诊断的临床价值。研究方法1.选取符合纳入标准的我校第一附属医院肾内科腹膜透析中心规律腹膜透析患者的腹膜透析流出液。从入选病人的过夜腹膜透析流出液中分离腹膜间皮细胞并进行培养。2.体外培养人的间皮细胞Met-5A,给予高浓度葡萄糖（HG）（1.5%,2.5%,4.25%）和TGF-β刺激,诱导腹膜间皮细胞发生EMT,检测在此过程中CKAP4的表达。3.CKAP4干扰（KD）、过表达（OV）及空白（VT）质粒转染至Met-5A细胞中,观察CKAP4表达差异对腹膜间皮细胞表型表达的影响。4.构建小鼠腹膜纤维化模型:野生型雄性C57BL/6小鼠20只,8-10周龄。实验组采用两种方式构建小鼠腹膜纤维化模型:1)腹腔内注射4.25%腹膜透析液,1次/天 x 6w;2)腹腔内注射醋酸氯已定（Chlorhexidine Acetate Solution CG）,1次/天x2w。对照组给予腹腔内注射同等体积的生理盐水。5.制备CKAP4-eCKO1基因敲除小鼠模型:利用Crispr/Cas9技术制备CKAP4基因敲除小鼠模型。在繁殖过程中检测CKAP4和Cre的表达。取CKAP4/Cre均为阳性的纯合小鼠实验,取4周龄小鼠的腹膜组织用Western Blotting和Real-time PCR方法检验CKAP4敲除效率。6.小鼠腹膜平衡实验:用4.25%高浓度葡萄糖腹膜透析液诱导小鼠腹膜纤维化,6周后行腹膜平衡实验,每只小鼠取眼球血100ul（P）,每只小鼠腹腔注射4.25%的腹膜透析液5ml,注射后立即回抽腹透液500ul（D0）,10分钟抽取剩下的腹透液（D）（V1）。然后处死小鼠,解剖腹腔并用棉球蘸取腹腔内残留的液体,前后称取棉球的重量（V2）。计算总的超滤量,D/P Cr,D/PBUN,D/D0 Glu。7.测定腹膜透析流出液及血清中CKAP4浓度:收集了符合入选标准的腹膜透析患者的血清及过夜的腹膜透析流出液,应用CKAP4 ELISA试剂盒测定其浓度并分析其浓度与相关临床指标的相关性。实验结果第一部分 CKAP4在规律腹膜透析患者的腹膜间皮细胞中的表达1.随着PD治疗时间的增加,腹膜间皮细胞由鹅软石形转变为梭形的纤维样细胞。2.随着PD治疗时间的延长,腹膜间皮细胞的表型发生了变化,CKAP4的表达增强。第二部分 CKAP4在腹膜纤维化中的调控作用和机制研究1.在HG和TGF-β刺激腹膜间皮细胞诱导其发生EMT过程中,CKAP4表达升高。2.在诱导小鼠腹膜纤维化过程中,CKAP4在腹膜组织中表达升高。3.CKAP4表达下调可抑制TGF-β和HG诱导的腹膜间皮细胞表型的改变,提示CKAP4干扰后可抑制EMT过程。4.CKAP4敲除后通过抑制EMT改善小鼠腹膜纤维化。5.CKAP4敲除后改善小鼠的腹膜功能,增加超滤量。6.干扰CKAP4表达后可抑制TGF-β导致的p-smad2活化。第三部分:CKAP4作为评估腹膜功能的生物标志物的临床价值1.血清CKAP4浓度在高龄、腹透龄长、透析充分性差、低转运及低平均转运患者的较高。腹膜透析流出液中CKAP4的浓度较血清中的浓度明显降低。腹膜透析流出液中CKAP4浓度与腹透龄和腹膜转运特性有关。2.腹膜透析流出液中CKAP4浓度与腹膜溶质转运速率呈正性线性相关,提示腹膜透析流出液中CKAP4浓度升高,腹膜溶质转运速率增加,超滤量下降。CKAP4有望作为评估腹膜功能的生物学标志物。结论随着腹膜透析时间延长CKAP4在腹膜间皮细胞中表达增加。在体内和体外实验中证实,在腹膜纤维化发生过程中,CKAP4表达上调。在体外实验中,CKAP4干扰后可抑制高糖或TGF-β刺激导致的腹膜间皮细胞表型的转化。在体内实验中,CKAP4敲除后通过抑制EMT可明显减轻小鼠腹膜纤维化程度。其调控机制可能与TGF-β/smad通路有关。另外,CKAP4敲除后还可改善小鼠的腹膜功能。为下一步临床应用奠定了基础。进一步分析通过监测CKAP4浓度来评估腹膜功能的临床应用中显示,血清及腹膜透析流出液中CKAP4的浓度和腹透龄及腹膜转运特性相关,进一步分析显示:血清中CKAP4浓度和D/P Cr之间无明显线性关系,腹透液中CKAP4浓度变化和D/P Cr呈正性线性关系。CKAP4有望成为评估腹膜功能的生物学标志物。

关键词：腹膜透析;腹膜纤维化;CKAP4;EMT

学科专业：内科学（肾病）（专业学位）

摘要

英文摘要

英文缩略词表

前言

实验材料与方法

实验结果

第一部分 CKAP4 在规律腹膜透析患者腹膜间皮细胞中的表达

一、引言

二、实验结果

三、讨论