中药引发的生殖毒性研究论文

〔摘要〕卵巢早衰是导致女性不孕的主要原因，研究证实氧化应激与卵巢早衰密切相关。氧化应激可以通过不同途径介导细胞自噬和凋亡的发生，在卵巢当中，正常浓度的活性氧的有助于卵巢的发育和排卵，而过多的活性氧则会导致卵巢颗粒细胞和卵母细胞的过度凋亡，从而引发卵巢早衰。因此，减少卵巢的氧化应激，防止颗粒细胞过度凋亡，可为临床防治卵巢早衰提供重要的研究方向。下面小编整理了一些《中药引发的生殖毒性研究论文(精选3篇)》，供大家参考借鉴，希望可以帮助到有需要的朋友。

中药引发的生殖毒性研究论文 篇1：

健宫散治疗奶牛产后子宫炎对血清白介素含量的影响

摘要：为探讨中药健宫散对产后子宫炎奶牛治疗前后血清中部分白细胞介素含量的影响以及研究健宫散的抗炎作用机制，选取年龄、胎次、产奶量相近的荷斯坦奶牛18头，按照B型超声波检查结果分为正常组、治疗组和患病组，每组各6头，治疗组进行口服健宫散处理。利用酶联免疫吸附法分别检测各组奶牛用药前、用药中和用药后1、4、7、11、15、20 d血清中白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素2（IL-2）和白细胞介素8（IL-8）的含量。结果表明，中药健宫散能显著降低产后子宫炎奶牛血清中IL-1、IL-2和IL-8的含量。说明中药健宫散能够调节部分白细胞介素的表达，提高机体免疫抗炎能力，可作为奶牛产后保健药，用于子宫炎的防治。

关键词：健宫散;奶牛;子宫炎;血清;白细胞介素

收稿日期：2019-01-02

基金项目：国家重点研发计划（编号：2017YFD0502200）。

作者简介：张保军（1992—），男，甘肃天水人，硕士研究生，研究方向为动物疾病诊断与防治。E-mail：1058915714@qq.com。

通信作者：谷新利，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药制剂开发与应用。E-mail：xlgu@shzu.Edu.cn。

奶牛由于分娩、泌乳等应激因素的影响，容易引起产后虚弱、免疫机能下降，引發子宫内膜炎[1]。子宫内膜炎是子宫内膜层受到细菌或病毒的感染，引起子宫内膜组织发生炎症的过程[2]。白细胞介素（IL）是介导白细胞间相互作用的细胞因子，在子宫炎症中发挥着重要的免疫调节作用，其水平的高低反映了子宫的免疫状态。研究发现，IL能调节生殖活动并与子宫内膜表面受体结合，调节免疫炎症反应[3]。IL-1浓度高低是判定炎性反应和炎症损伤程度的重要标志[4];IL-2是一种免疫增强剂，参与细胞介导的免疫，与炎症反应有关;IL-8是一种重要的促炎细胞因子，可使中性粒细胞向炎症部位聚集，研究发现，IL-8与子宫炎的发生有关[5]。有学者推测，IL-8的表达水平可能对奶牛子宫内膜炎有预测和监测的效果[6]。

中药健宫散由益母草、当归、川芎、五灵脂、桃仁、甘草等药材配伍而成，其组分均有活血祛瘀、抑菌消炎的功效，但抗炎作用目前尚不明确。本试验在前人研究的基础上，对产后子宫炎奶牛进行口服纯中药健宫散处理，检测治疗前后外周血清中IL-1、IL-2、IL-8含量的变化规律，旨在探讨健宫散对子宫炎奶牛的抗炎作用机制，为进一步了解健宫散的临床治疗机制，深入开发利用健宫散提供基础参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象

在新疆维吾尔自治区石河子市西部牧业优良种畜繁育中心奶牛场选择年龄、胎次、产奶量相近，无传染病及寄生虫病的中国荷斯坦奶牛18头，根据B型超声波检查结果，共诊断出健康奶牛6头，子宫炎奶牛12头，记录每头牛的耳号及产犊日期。

1.1.2 药品与试剂

健宫散（散剂，400 g/袋），由石河子大学动物科技学院中兽医学研究室研制而成，由益母草、当归、川芎、五灵脂、桃仁、甘草等中药组成，方中各药材均购自当地药店。

IL-1（货号：E11I0032）、IL-2（货号：E11I0308）和IL-8（货号：E11I0056）检测试剂盒均购自上海Blue Gene生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器

荷兰Piemed ICAL公司生产的50S型Tringa Vet便携式兽用B型超声波扫描仪，配备3.5/5.0 MHz变频扇扫凸阵探头或线阵探头;Power Wave XS2 Bio Tek酶标仪（型号ELx800，Made in USA）;超低温冰箱（型号FORMA 995），购自Thermo美国赛默飞世尔科技有限公司;微量快速振荡仪（型号QB-9002 Kylin-Bell），购自Lab Instruments公司;离心机（型号H1850R），购自长沙湘仪离心机仪器有限公司;恒温培养箱（型号DHP-9082），购自上海浦东荣丰科学仪器有限公司;数显恒温水浴锅（型号HH-4），购自江苏省金坛市友联仪器研究所;微孔板脱水仪（型号BIOS-401），购自BIOSCIENCE梅奥赛斯（天津）生物科技有限公司;洗板机（型号Wellwash 4 MK2），购自Thermo美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物的分组与处理

健康奶牛6头作为正常组（A组）;子宫炎奶牛12头，其中6头进行中药治疗作为治疗组（B组），另外6头不进行治疗，作为患病组（C组）。治疗组奶牛每头每天灌服健宫散400 g，每天1次，连续灌服1个疗程（7 d），正常组和患病组不进行任何处理。

1.2.2 样品的采集

治疗组奶牛灌服健宫散前采血1次，用药中期（即用药3 d时）采血1次，灌药结束后1、4、7、11、1、20 d各采血1次，共采血8次。采血时间为14：00—16：00，正常组、患病组在同一时间采血，采血次数同治疗组。所有供试牛均空腹经尾静脉采取血液5 mL，室温静置自然析出血清，装于1.5 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱中待检。

1.2.3 检测指标的测定

IL-1、IL-2和IL-8含量均采用反向竞争酶联免疫吸附（ELISA）法测定，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 数据的统计分析

应用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，试验数据均以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

分别检测A、B、C组奶牛血清中IL-1、IL-2、IL-8的含量，制作相应标准曲线，得出相关系数：IL-1，r2=0.997 29;IL-2，r2=0.999 16;IL-8，r2=0.997 90。血清中IL-1、IL-2、IL-8含量测定结果见表1。

从表1可以看出，用药前、用药中和用药后1 d，患病组血清IL-1含量均高于正常组;相比于治疗组差异不显著（P>0.05）;用药后4 d，治疗组IL-1含量与正常组、患病组差异均不显著，用药4 d以后，治疗组IL-1含量显著低于患病组，相比正常组差异不显著。

用药前、用药中和用药后1 d，治疗组和患病组血清的IL-2含量均显著高于正常组;用药后4、7、15 d，治疗组1 d以后显著低于患病组;用药后20 d，治疗组与患病组差异不显著;用药1 d以后，治疗组IL-2含量达到正常水平，相比正常组差异不显著（表1）。

用药前，患病组IL-8含量显著高于正常组;用药中，相比于正常组和治疗组差异均不显著;用药后，治疗组IL-8含量总体上不断下降，与患病组相比差异显著，治疗组IL-8含量在用药后相比正常组差异不显著（表1）。

3 讨论

3.1 健宫散治疗前后奶牛血清中IL-1和IL-8含量的变化

白细胞介素是一种在淋巴细胞和白细胞之间传递信息的细胞因子，主要由T淋巴细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞、血管上皮细胞等多种细胞产生，通过与细胞膜表面的受体蛋白结合，介导机体的细胞免疫和体液免疫。IL-1和IL-8属于促炎细胞因子，参与机体的体液免疫。研究发现，IL-1 可以影响子宫的生理功能，适量的IL-1可促进子宫内膜蜕膜化[7]和炎性分泌物的排出[8]。IL-1是炎症免疫反应的主要诱导剂，感染炎症时，其值有不同程度的增高[9]。IL-8是一种中性粒细胞趋化因子，在炎症反应中起重要作用。胡路锋针对产后1～35 d 子宫炎奶牛血清中的IL-8浓度检测发现，子宫炎组奶牛和正常组奶牛IL-8含量均呈波动式增加，无明显规律[10]。本试验中，子宫炎组奶牛IL-8 含量前半段时间持续上升，而后半段时间呈现波动式增加，这与胡路锋的研究结果[10]略有不同，可能是试验方法的不同和供试牛个体之间的差异所造成的。Fischer等的研究表明，亚临床或临床子宫内膜炎奶牛子宫上皮细胞IL-1β和IL-8 mRNA的表达显著高于健康奶牛，IL-1β和IL-8可用于监测和诊断亚临床子宫内膜炎[11]。张冬波等研究发现，患子宫内膜炎奶牛子宫中IL-8含量均高于正常奶牛[12]。李德军的研究表明，产后49 d内患临床和隐性子宫内膜炎奶牛血清中IL-1和IL-8的含量均升高[13]。Galvo等报道称，子宫内膜炎奶牛IL-1β含量表达在产后1周下降，产后5周和7周有上升趋势，IL-8基因表达在产后7周显著高于健康对照组[14]。本试验表明，用药前患病组、治疗组IL-1和IL-8含量均高于正常组，停药1 d以后患病组IL-1和IL-8含量均显著高于正常组，治疗组和正常组IL-1和IL-8含量分别在停药4 d以后显著低于患病组，本研究结果IL-1和IL-8含量变化规律与李德军的研究[13]一致。

陈晓燕等研究发现，益母草浸膏可显著降低产后子宫内膜炎模型大鼠血清中IL-1β的含量[15]。佟建敏等研究了益母草颗粒对人工流产患者炎性因子水平的影响，发现加服益母草颗粒组术后1 d及7 d宫颈黏液中IL-1含量水平显著低于对照组[16]。奚瑾磊等研究发现，当归醇沉物可增强小鼠腹腔巨噬细胞IL-1的分泌[17]。沈维增等研究发现，当归拈痛汤能降低急性痛风性关节炎患者血IL-1、IL-8含量[18]。付彦君等的研究表明，不同剂量天麻川芎可降低自发高血压大鼠血浆心肌炎症因子IL-1β mRNA的表达水平[19]。王桂华等研究发现，桃仁提取物能显著降低急性胰腺炎大鼠血清中IL-8的含量[20]。赵蓓蕾等研究发现，甘草能降低吸烟大鼠血清IL-8的含量[21]。本试验中，停药后7、11、15、20 d治疗组IL-1含量显著低于患病组，治疗组IL-8含量结束用药后显著低于患病组，说明健宫散降低了促炎因子IL-1和IL-8的表达水平，提高了机体的抗炎能力，原因可能是健宫散组方中益母草、当归、川芎、桃仁、甘草等成分发挥了抗炎功效，使得血清IL-1和IL-8含量降低。

3.2 健宫散治疗前后奶牛血清中IL-2含量的变化

IL-2属于Th1型细胞因子，可诱导T细胞增殖，诱导NK细胞和LAK细胞产生IFN-γ和TNF-α，活化Th细胞、细胞毒性T细胞和单核巨噬细胞[22]，介导细胞免疫。IL-2被认为是一种不利于动物生殖的细胞因子，有报道显示，奶牛在产后早期，体内编码IL-2的基因没有明显表达[8]。张冬波等研究发现患子宫内膜炎奶牛子宫中IL-2含量均高于正常奶牛[12]。韩莉莉等研究发现，宫颈病变患者血清中IL-2的含量水平均随着宫颈病变严重程度的增加而减少[23]。引起子宫内膜炎主要原因之一的胎衣不下属于一种免疫功能性疾病，马清河等研究发现，胎衣不下组奶牛胎盘组织中IL-2的含量极显著高于健康组，IL-2的含量可能与子宫炎症有关[24]。本试验表明，用药前、用药中及用药后1d患病组、治疗组的IL-2含量高于正常组，停药1 d以后患病组IL-2含量显著高于正常组，停药后4、7、11、15 d正常组显著低于患病组，此研究结果与上述研究结果一致。

佟建敏等报道称，益母草颗粒能显著提高人工流产后患者宫颈黏液中IL-2的含量[16]。朱邵晴等研究发现，药物中加入当归能够加速IL-2的产生，促进淋巴细胞的增殖，加强免疫[25]。冯永生等研究发现，川芎可显著提高小鼠血清IL-2的含量[26]。吕跃山等研究发现，桃仁总蛋白能提高荷瘤小鼠血清中IL-2的含量[27]。王志国研究了由当归、白芍、川芎等药材组成的当归芍药散对慢性盆腔炎模型大鼠IL-2的影响，发现当归芍药散能增加慢性盆腔炎模型大鼠血清中IL-2的含量[28]。賈书红等研究发现，宫炎净（由益母草、当归、川芎、桃仁、五灵脂、甘草等组成）提取物中生物碱可显著降低子宫内膜炎家兔血清中IL-2的含量[29]。本研究显示，用药后4、7、11、15 d治疗组IL-2含量显著低于患病组，说明健宫散降低了IL-2的含量，此结果与贾书红等的研究结果[29]一致，与佟建敏等的研究结果[16，25-28]不一致，原因可能是健宫散组分的甘草中主要解毒成分甘草甜素的肾上腺皮质激素样作用，降低了机体对各种有毒物质的反应，从而增强肝脏的解毒功能[30]，促使IL-2含量降低。

综上所述，中药复方健宫散能够显著降低产后子宫炎奶牛血清中IL-1、IL-2和IL-8的含量，通过调节IL-1、IL-2和IL-8的表达水平，提高机体的免疫抗炎能力，对奶牛产后子宫炎有明显的防治效果。

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作者：张保军 乔彦杰 刘贤侠 梁小瑞 王丹阳 谷新利

中药引发的生殖毒性研究论文 篇2：

氧化应激与细胞自噬凋亡对卵巢早衰调控的研究进展

〔摘要〕 卵巢早衰是导致女性不孕的主要原因，研究证实氧化应激与卵巢早衰密切相关。氧化应激可以通过不同途径介导细胞自噬和凋亡的发生，在卵巢当中，正常浓度的活性氧的有助于卵巢的发育和排卵，而过多的活性氧则会导致卵巢颗粒细胞和卵母细胞的过度凋亡，从而引发卵巢早衰。因此，减少卵巢的氧化应激，防止颗粒细胞过度凋亡，可为临床防治卵巢早衰提供重要的研究方向。Nrf2-ARE信号通路是目前发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，通过对Nrf2-ARE信号通路与卵巢早衰关系的总结，为卵巢早衰发病机制的进一步研究提供参考。

〔关键词〕 卵巢早衰;氧化应激;Nrf2-ARE信号通路;细胞自噬;细胞凋亡

〔

Advances on Regulation of Premature Ovarian Failure by Oxidative Stress and

Autophagy Apoptosis

YANG Kaifeng， LI Lan， ZHOU Hong， XIAO Xiaoqin*， LIU Huiping*

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔

〔

隨着社会节奏的加快、女性心理压力的增大及肿瘤放化疗诸多不良因素的增加，卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）患者数量逐年增加，且呈年轻化趋势[1]。目前，遗传、免疫、氧化应激、化学因素等是造成POF的最常见的影响因素，但其具体机制尚不清楚[2]。其中，氧化应激被认为是启动或促进女性生殖疾病的关键因素[3]。其可能的机制为氧化应激诱导哺乳动物卵巢卵泡自噬、凋亡和坏死等多种细胞死亡途径，导致卵巢多种退行性改变而造成POF[4-5]。通过阐明POF与Nrf2-ARE抗氧化通路和自噬凋亡通路之间的联系，为POF的发病机制提供新思路。

1 POF与卵巢颗粒细胞的自噬、凋亡

自噬是真核生物通过降解多余或受损的细胞内物质来维持细胞稳态的高度保守的生物途径[6]。在各种细胞应激条件下，自噬通过高度保守的分解代谢途径，在能量或营养缺乏的情况下防止细胞损伤并促进存活，并对各种细胞毒性损伤作出反应[7]。因此，自噬主要具有细胞保护功能[8]，需要严格调节以正确响应细胞经历的不同刺激，从而适应不断变化的环境。自噬通过包裹一部分胞内物质形成自噬小体，在溶酶体的作用下进行降解并作为细胞内物质循环利用的重要途径，这不仅有利于细胞的存活，而且在卵巢发育和疾病中也有着重要意义[9-10]。在某些情况下，自噬的过度激活亦会导致卵巢颗粒细胞的死亡。实验证明，大鼠卵巢颗粒细胞中自噬体的积累可以降低B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）的表达而诱导颗粒细胞的凋亡，导致卵泡闭锁并诱导POF的发生[11-13];此外，自噬亦可通过自噬诱导引起二型细胞程序性死亡，独立于凋亡介导的一型细胞程序性死亡[14]，所以颗粒细胞自噬性死亡（二型细胞程序性死亡）亦有可能是导致POF的另一因素。

2 氧化应激与卵巢颗粒细胞的凋亡自噬

2.1  氧化应激与卵巢颗粒细胞凋亡

氧化应激指机体内活性氧（reactive oxygen species， ROS）与抗氧化成分失衡而引起的一系列适应性的反应。在无外界刺激源的条件下，机体内ROS的产生和清除处于一种动态平衡，而当机体ROS含量相对升高，机体对其清除能力相对不足时，会使组织当中过氧化水平明显升高，并导致机体受到损害。ROS由正常的生理过程产生，在细胞信号传导和组织稳态中起着重要作用[15]。然而，过多的自由基物种也会对细胞成分产生不利的修饰，一是各种细胞成分的破坏，如蛋白质、脂类、DNA的损伤，二是触发特定信号通路的激活，这两种效应都可以导致细胞凋亡[16-18]。现有研究[19]表明，ROS在细胞信号传导以及线粒体、死亡受体和内质网（endoplasmic reticulum， ER）介导的凋亡主要途径的调控中起着核心作用;实验研究[20-21]证明，H2O2可以诱导内源性促凋亡相关分子（Bax、Bak）升高和抗凋亡分子（Bcl-2、Bcl-xL）的降低，并通过ROS-JNK-p53途径调节卵巢颗粒细胞的细胞凋亡。

2.2  氧化应激与卵巢颗粒细胞自噬

在生理状态下，自噬对机体具有保护作用，ROS和氧化应激可以激活自噬，自噬通过负反馈作用保护细胞，有选择地消除ROS的来源[22-24]，从而维持颗粒细胞的稳定。线粒体是机体内发生氧化反应的主要场所，这个过程伴随着ROS的产生，然而过量的ROS会引起线粒体损伤[25-26]，释放出凋亡因子引起细胞死亡。选择性自噬通过去除受损的卵巢颗粒细胞当中损伤的线粒体，不仅可以帮助卵巢颗粒细胞生存，而且可以使ROS维持在一个相对较低的水平[27-29]。但是，在某些情况下，ROS引起的过度自噬也会导致自噬性细胞死亡。研究[30-33]表明，脂质过氧化可以加合到特定的线粒体和自噬相关蛋白中，以自噬细胞死亡的方式导致细胞功能障碍，而且脂质过氧化物还可诱导溶酶体功能障碍和脂褐素合成，导致自噬活性降低。脂质过氧化物可能通过不同的信号途径触发自噬细胞死亡。首先，脂质过氧化物可能通过AMP依赖的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase， AMPK）抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1， mTORC1）的活性启动自噬，AMPK作为mTOR途径的上游调节剂，可感知营养和能量消耗，激活结节性硬化复合物（tuberous sclerosis complex， TSC），抑制mTOR活性，并且提高微管相关蛋白2轻链3（microtubule-associated protein 2-light chain 3， LC3-II）的水平导致自噬[34-36];其次，脂质过氧化物可以使Bcl-2与c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）的相互作用，從而通过JNK途径促进自噬[37]，JNK介导Bcl-2磷酸化，使得Bcl-2从Bcl-2/Beclin1复合体解离出来，参与自噬的溶酶体降解途径，该途径不会使mTOR通路失活，在Bcl-2依赖的自噬过程中起重要作用。生理性自噬可以抑制细胞凋亡，促进细胞存活;而病理性自噬会导致细胞程序性死亡，而不利于细胞存活，这主要取决于机体内氧化应激的程度和抗氧化水平。

3 Nrf2-ARE通路对POF防治的积极意义

3.1  Nrf2-ARE信号通路与氧化应激

Nrf2-ARE信号通路是目前认为最为重要的内源性抗氧化通路[38]。其中，抗氧化反应元件（antioxidant response element， ARE）是一种能编码启动子区域的多种解毒酶和细胞保护蛋白基因的增强子序列[39]。核因子NF-E2相关因子（nuclear factor erythroid 2 related factor 2， Nrf2）靶基因编码的蛋白具有广泛的细胞保护作用，包括抗氧化、解毒和抗炎，而Nrf2缺失或失活会使细胞对各种刺激的敏感性显著上升[40-41]。Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）被鉴定为是一个Nrf2的E3泛素连接酶底物接头，可导致蛋白酶体的快速降解[42]。Keap1确保了正常生理状态下Nrf2蛋白的低水平，其半衰期仅为15～40 min。更重要的是，Keap1为含有高活性的半胱氨酸，一旦被亲电分子修饰，就会阻止对Nrf2进行蛋白酶体降解，从而导致Nrf2蛋白在氧化应激下迅速积累，激活后的Nrf2进入细胞核，并与小肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物（sMAF）蛋白结合形成二聚体，并与顺式作用元件ARE相结合，诱导基因表达，调节相关抗氧化物质保护细胞[43]。此外，蛋白激酶c、促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇激酶通过诱导Nrf2磷酸化也参与了Nrf2-ARE的通路激活[44]。

3.2  Nrf2-ARE通路抑制颗粒细胞凋亡

POF的一个主要原因是卵泡过度闭锁，而卵泡过度闭锁是由卵巢颗粒细胞凋亡所致，因此，颗粒细胞的正常生理功能对卵母细胞的发育起着至关重要的作用[45]。氧化应激可以通过不同途径导致卵巢颗粒细胞凋亡，而Nrf2-ARE通路通过表达抗氧化相关产物如血红素加氧酶-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶[46]等，通过降低ROS水平抑制细胞凋亡，促进颗粒细胞存活。其次，一旦Nrf2-ARE通路激活，便会诱导P62蛋白表达，从而降解Keap1蛋白，减少Bcl-2/Keapl相互作用，增加Bcl-2/Bax异二聚体，抑制颗粒细胞凋亡，保护卵巢功能[47-48]。Keapl在ROS诱导的细胞凋亡中发挥着重要的作用，Keapl不仅可以通过线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PGAM5）与Bcl-xL结合形成Keapl/PGAM5/Bcl-xL的复合体，而且还可以与Bcl-2蛋白结合形成Keapl/Bcl-2复合体，导致Bax的积累，增加线粒体细胞色素c的释放，激活Caspase-3/7，增加了DNA的碎片化和凋亡[49-51]。抗氧化剂破坏了Keap1/PGAM5/Bcl-xL及Keap1/Bcl-2复合体的稳定性，促使Bcl-2、Bcl-xL的释放，减少细胞凋亡。Nrf2信号通路在氧化应激诱导的细胞凋亡中发挥着重要的抗凋亡作用，而Nrf2信号通路在POF的治疗中发挥的作用可进一步深入研究，为POF治疗提供新依据。

3.3  Nrf2-ARE通路对颗粒细胞自噬的双重调节作用

P62作为一种自噬衔接蛋白，结合泛素化蛋白聚集体并将它们传递给自噬体[52-53]。氧化应激诱导P62基因的表达是由NRF2-ARE通路介导的，P62与Keap1的相互作用，将Keap1固定到自噬体中，从而损害由Keap1介导的Nrf2的泛素化作用，导致Nrf2信号通路的激活[54-55]，形成了一个由自噬和keap1/Nrf2/ARE通路组合而成的抗氧化损伤的正反馈循环。线粒体自噬通过清除受损的线粒体，对维持卵巢颗粒细胞的正常功能至关重要，而Nrf2-ARE信号通路诱导P62表达，在介导线粒体自噬中有着重要的作用，通过降解老化或者受损的线粒体，不仅可以降低ROS水平，而且可以防止线粒体损伤而导致的颗粒细胞凋亡。此外，Nrf2-ARE信号通路通过表达相关抗氧化蛋白，抑制氧化应激导致的脂质过氧化而引起的病理性自噬[56-57]，防止卵巢颗粒细胞自噬性死亡。由于Nrf2信号通路和自噬相关通路的复杂性，目前尚不能完全理解所有的分子机制，但是通过调节氧化还原水平以达到自噬的稳态对POF的治疗意义重大。

3.4  中药复方通过干预Nrf2-ARE通路治疗POF的潜力

中医学虽无卵巢早衰之病名，但可归属为“月经病”“不孕症”范畴。目前，研究认为肾虚为POF的决定因素，血瘀为发病的关键环节，心肝脾为发病的重要环节。《黄帝内经·上古天真论》中指出：“二七而天癸至，任脉通……故有子”“七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，……故形坏而无子也”。天癸作为女性生育的关键物质基础，而其充盈源于肾中之先天之精，并赖于后天水谷之精的滋养。正如《医宗金鉴》所言“先天天癸始父母，后天精血水谷生”，所以治疗POF最常用的方法是补肾健脾法。中医学治疗疾病往往通过扶正和祛邪两个方面，而中医药治疗POF“扶正”的分子机制尚不清楚，该机制有可能是通过调节Nrf2-ARE信号通路达到增强机体正气的目的。现代药理研究[58-61]表明，治疗POF常用补肾健脾的基础药物，如黄芪、黄精、巴戟天、铁皮石斛等，都具有抗氧化作用，其抗氧化的“扶正”作用机制极有可能与Nrf2-ARE信号通路的保护作用有关。中医药具有多靶点，对机体进行全面调控以维持稳态的作用，而目前对Nrf2-ARE信号通路与中医药的研究较少，加大这方面的研究可以更好地理解中医药及Nrf2-ARE信号通路在POF中的防治作用。

3.5  其他

目前，研究认为导致POF的最可能的机制是氧化应激，然而使卵母细胞的数量减少和质量降低的具体分子机制仍值得探索，这种机制可能是通过氧化应激通路和自噬凋亡相关通路的相互交叉串扰导致的[62]。Nrf2可以作为卵巢细胞化学稳态的重要传感器和调节剂，通过控制代谢排毒、ROS防御来保护细胞免受有毒化学物质的侵害[63]。且有研究[64]表明，通过口服富马酸二甲酯（DMF）激活Nrf2-ARE信号通路来提高颗粒细胞的抗氧化能力，减少氧化应激和DNA损伤，从而改善小鼠卵巢中的卵巢储备，保护卵巢功能。Nrf2信号通路的激活可以减轻卵巢颗粒细胞中氧化压力[65]，这可以为克服年龄相关的生育能力下降提供新的见解。

4 展望

POF当前临床治疗主要方法是雌、孕激素人工周期替代疗法，但临床使用雌、孕激素有局限性，且不良反应较多。针对于POF在氧化应激、自噬、凋亡的复杂病因病机，可以通过对转录因子Nrf2的调控进行干预，Nrf2的激活可以产生有益的、全面的、多靶点的和持久的细胞保护效应。尽管目前还不能排除NRF2激活剂的致癌风险，但令人鼓舞的是，DMF的3期试验的荟萃分析显示，安慰剂组和DMF治疗组之间的癌症发病率没有差异[66]。由于NRF2系统的特殊性使得药物研发在监测参与靶点和靶外效应方面仍然具有挑战性，而中医药在Nrf2信号通路与POF机制当中研究甚少，加大中医药与Nrf2信号通路的研究，毫无疑问可以为POF的防治提供一种新的思路。

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作者：杨开锋 李兰 周虹 肖小芹 刘慧萍

中药引发的生殖毒性研究论文 篇3：

补骨脂主要不良反应的研究与思考

摘要 本文对补骨脂的历史沿革及其主要成分做了回顾；对现代研究中补骨脂的肝、肾以及其生殖毒性进行了综述，并将其和其他中药配伍后毒性的改变进行了总结；最后由对补骨脂的认识引发对中草药及其复方用药的安全思索，以期中医药能够更加规范化、安全化的应用。

关键词 补骨脂；主要成分；肝毒性；肾毒性；生殖毒性；综述；中草药；中药复方

近年来，随着国家对中医药事业的大力支持和人们对中医药的逐渐深入了解和认识，中医药在治疗疾病中所起的作用越来越受到重视，与此同时，部分中药的不良反应也被推到了风口浪尖，引起了国外医学界的强烈反响，甚至一部分医学者认为应该抵制有毒中草药在临床中的应用。补骨脂作为一味在临床中常用的药物，我们对其主要成分及其不良反应的认识也由来已久。补骨脂在临床的辨证用药中也遭到一部分医师的抵制。我们将补骨脂的历史沿革、主要成分及不良反应的研究概述如下。

1 补骨脂历史沿革、主要功用及主要成分

1.1 历史沿革 补骨脂始记于《雷公炮制论》。补骨脂是豆科植物补骨脂干燥成熟的果实，《开宝本草》中有云：“生广南诸州及波斯国”。补骨脂，乃梵语“Vakuci”的音译名。

1.2 主要功用 本草有曰：“补骨脂，有名破故纸，补骨脂言其功也。其性味辛，大温，主治五劳七伤，风虚冷，骨髓伤败，肾冷精流，及妇人血气堕胎”。其炮制法也始载于《雷公炮制论》，曰：“凡使，性本大燥毒，用酒浸一宿，漉出，却用东流水浸三日夜，却蒸从巳至申出，日干用”。补骨脂药性：苦、辛，温。归肾、脾经。功效：补肾壮阳，固精缩尿，温脾止泻，纳气平喘[1]。临床应用注意事项：《本草经疏》曰：“凡病阴虚火动，梦遗，尿血，小便短涩及目亦口苦舌干，大便燥结，内热作渴，火升目赤，易饥嘈杂，湿热成痿，以致骨乏无力者，皆不宜服”。《得配本草》曰：“阴虚下陷，内热烦渴，眩晕气虚，怀孕心胞热，二便结者禁用”。现代药理学研究发现，补骨脂的主要活性成分具有显著的抑制细菌生长、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗炎性反应，甚至可以抗丝虫活性，抗抑郁，抗真菌以及皮肤真菌活性，抗糖尿病活性等[2]。不同的提纯法提取的补骨脂的有效成分，其功用也不尽相同[3]，在普遍采用的醇提法对补骨脂的有效成分进行提纯的研究中发现，用75%乙醇提取物和95%乙醇提取物具有明显雌激素样作用，而水提物雌激素样作用不明显。

1.3 补骨脂主要成分 人们对补骨脂成分的研究由来已久。补骨脂的成分包括黄酮类、苯并呋喃类、香豆素类、单萜类、部分微量元素以及其他有机化合物。呋喃香豆素类、二氢黄酮类、异黄酮类补骨脂酚等是补骨脂的主要成分。其他有机化合物包括：豆甾醇、β-谷甾醇-D-葡萄糖苷、三十烷、葡萄糖、棉子糖等。其中补骨脂还包含大量人体所需要的微量元素如Zn、Mg，Fe、Ca等[4]。

2 补骨脂肾毒性的研究概述

其不良反应可追溯至《雷公炮灸论》一书，书中曾这样记载：“此药辛温，大燥，毒性骏猛，需用酒浸泡一夜后再用潺潺流水浸泡三日，随后置于干出晾晒，晾晒的时间尾巳时至申时，待药物干燥后便可使用”。现代研究也证实，长期服用含有补骨脂的药物，有可能引起肾脏的毒性。

2.1 补骨脂酚对肾脏作用的研究 张玉顺等[5]从补骨脂中提取出补骨脂酚，并对该药物的毒性进行了分析试验，结果证实该成分有明确的肾毒性。实验动物选用昆明种小鼠，分4个剂量组灌胃给药，给药一周之后，所有剂量组（包括最低剂量组，每千克体重0.125 mL）的小鼠肾脏均出现轻度的病理改变，且停药28 d后小鼠的肾脏病变并未出现好转。也有研究指出肾小球毛细血管中的间质细胞核及内皮细胞的增大与补骨脂生品以及补骨脂炮制品有关，其中毒性最弱的是酒制品。另外，补骨脂酚对早孕小鼠的肾脏亦可造成损伤[6]。单味补骨脂对肾脏的毒性已非常明确，此外在临床中对怀孕女性的中药应用中也该避免。

2.2 与甘草配伍及炮制后对肾脏不良反应研究 补骨脂在与甘草配伍后，并没能够有效的减少其对肾脏的损害[7]。研究表明，N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）是一种酸性水解酶，其中尿NAG的活性会因肾脏近曲小管的受损而明显增高，与其他脲酶比较，尿NAG会提前出现变化。研究人员将小鼠分为2组，一组灌服补骨脂-甘草配伍，另一组灌服补骨脂，实验发现NAG明显提高，大鼠肾小管因补骨脂剂量的提高产生一定的毒性，对2组实驗结果进行比较分析发现，补骨脂-甘草配伍组小鼠增加的NAG更多，但差异无统计学意义。经分析发现，可能与大鼠体内产生的毒代动力学的变化有关，对补骨脂酚能够有更好的吸收，同时对补骨脂酚的代谢有抑制作用，因此大鼠体内的补骨脂酚量增大。研究还发现，补骨脂酚的代谢与大鼠的性别也有关系。补骨脂重复连续给药28 d可引起大鼠肝、肾功能损伤，停药后可恢复至正常水平。补骨脂-甘草配伍并未增强或减弱补骨脂酚所引起的肝、肾毒性[8]。

另外，食用盐腌制过后可以使补骨脂的肾脏毒性作用变强[9]，怀疑可能与食用盐和其某些相关活性物质发生作用，或者渗透性增高后，增加了胃肠道对补骨脂某些成分的吸收功能，补骨脂味辛、苦，性温，归肾、脾经，而盐又入肾，可能改变了小鼠肾脏的功能，使其代谢出现紊乱等原因有关。

3 补骨脂肝脏毒性的研究概述

3.1 补骨脂素对肾脏的影响研究 补骨脂具有很好的抗肿瘤作用[10-13]，尤其是其有效活性成分补骨脂素，研究证实，补骨脂素具有很好的抗肿瘤作用，补骨脂素能够上调乳腺癌干细胞拓扑异构酶基因和蛋白的表达，增加药物的作用靶点，逆转乳腺癌干细胞对阿霉素的耐药[14]。但与此同时，补骨脂素对肝脏的功能也会产生一定的影响，且对雌性大鼠的肝脏损伤更加明显[15]。根据有关报道，1978—2005年，中国大陆地区有11例白癜风患者在服食含补骨脂的白蚀丸后，出现不同程度的肝脏病理性损伤。Bjellerup等[16]对补骨脂素对生化水平的影响进行了研究，数据表明用补骨脂素加紫外线照射法治疗3次后可以影响肝脏功能，提高丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸转氨酶（AST）水平，其中肝细胞受损与损伤类型密切相关，损伤的发生不可预见。这种不良反应目前还仅限于试验中，在临床上还没有详细的统计。研究证实，补骨脂中的有效活性成分香豆素可以通过影响肝微粒体，从而影响肝细胞的正常功能，引起机体内转氨酶的升高[17]。

3.2 补骨脂水提物对肝脏的影响

补骨脂水提物可以影响胆汁酸的代谢和转运。连续给予大鼠补骨水提物，可以使大鼠肝脏造成病理性损伤[18]。

实验表明，大剂量，多次使用补骨脂水提物可以影响小鼠体重，造成小鼠体重下降。小鼠肝脏中的NTCP和BSEP蛋白水平会在补骨脂水提物的作用下明显下降，从而导致肝细胞吸收和排泄胆汁酸的能力下降，由此可见，肝细胞排出胆汁酸的能力降低是胆汁酸转运体受补骨脂水提物影响的主要原因，由于胆汁酸排出功能紊乱可能会导致肝细胞中胆汁酸的浓度提升[19]。肝细胞中的胆汁酸浓度过高会引起细胞损伤，因此肝损伤可在补骨脂水提物的作用下形成[20]。此外，给予正常大鼠补骨脂水提物也可以引起大鼠肝脏的脂肪变性，从而对肝细胞造成损害[21]。补骨脂水提物亦可以导致大鼠肝损害，补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素有肝毒性[22]。

3.3 不同剂量对肝脏毒性作用的影响

补骨脂的毒性作用与剂量及具有一定相关性，试验中补骨脂剂量越大，肝损伤程度越明显[23-25]。在研究补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚对小鼠肝脏损害的实验中，补骨脂素可使小鼠肝脏出现散在局灶性坏死，而异补骨脂素仅出现部分肝脏细胞变性，补骨脂酚对小鼠肝脏的影响较前2组较轻[26]。此实验证实，在补骨脂的单个提取物中，补骨脂酚的毒性作用相对较低，补骨脂素与异补骨脂素有可能是补骨脂导致肝脏损伤的主要活性成分。

补骨脂中的香豆素类是促进骨骼发育的主要活性成分[27]，补骨脂水煎液（WD）和醇提物（EE）有显著促进骨骼发育的效果，但其毒性也非常大，提示补骨脂起效或致毒的关键成分有可能是其脂溶性特征性成分[28]。

3.4 补骨脂对肝脏线粒体的影响 实验研究发现，补骨脂对小鼠肝细胞形态及线粒体膜电位也有影响。选用昆明种小鼠，实验结果表明对小鼠连续28 d补骨脂灌胃后，小鼠肝细胞出现肿胀和坏死的症状，且血清中的IL-6、AST、ALT、TNF-α的活性变高；随着给药剂量的增加肝细胞线粒体膜的明显降低[29]。因此小鼠肝脏出现的损伤与连续服用补骨脂密切相关。

3.5 补骨脂对肝脏损害的相关报道 据相关病例报道显示，2005年发生过一起因泡茶饮用补骨脂导致急性肝损害的案例，经临床分析发现患者的胆汁浓度与ALP明显上升[30]，对补骨脂的作用成分分析发现，多种成分具有雌激素一样的效用[31-32]，而肝脏损害与雌激素过量也有关系[33-34]，因此在补骨脂的作用下对肝脏中代谢酶水平具有显著影响[35]。补骨脂注射液可以出现起皮疹、水疱等过敏反应，这些症状怀疑和补骨脂中具有扩血管作用的活性成分黄酮有关[36]。

4 补骨脂生殖毒性分析

通过对小鼠进行补骨脂素服用试验中，用治疗剂量的补骨脂素给雌性小鼠长期服用后，小鼠出现卵巢功能低下、排卵数变少、雌激素水平下降、子宫质量下降的症状[37]。此外，在补骨脂提取物的作用下，大鼠的雄性激素分泌被抑制，导致大鼠睾丸和附睾出现质量下降的症状[38]。

5 不同炮制法、配伍及新旧品毒性的比较

实验研究证实，补骨脂经盐炙法炮制后（LD50）有所下降，说明其毒性有所下降。根据不同补骨脂制品对肾小球毛线血管丛产生的毒性作用研究发现，酒制的补骨脂毒性作用最弱，且对肾曲管上皮的毒性作用也是所有制品中最弱的，但作用差异不大。另外，补骨脂對雄性小鼠生殖器的影响：生品>清炒品>雷公法品>盐蒸品，其中生品和清炒品组的小鼠睾丸重量显著降低[39]。在对生品、老品、新品的半数致死量（LD50）比较的实验中提示，在3种试品中，新品的毒性最小，老品次之，生品的毒性最大[40]。不同炮制后的补骨脂不良反应随着补骨脂素与异补骨脂素含量的增多而增大，补骨脂的毒性与其含量呈正相关。补骨脂有效活性单体种类繁多，确定其毒性物质基础还需要做很多的工作。

经过炮制后的补骨脂或者与其他中药配伍后再一定程度上可以降低其对肝脏的损害。应用不同炮制法炮制后的补骨脂，其疗效均有不同程度的增加，在临床治疗中，选择不同方法炮制过补骨脂可能增强其对不同疾病的治疗效果[41-42]。补骨脂盐炙后可缓解药物对肾阳虚大鼠肝肾功能的不良反应；同时缓解生品的燥性，盐炙对药物燥性有缓解作用[43-44]。

补骨脂配伍不同性味的中药可以达到减毒或者增效的目的，而配伍不当也可能会增强补骨脂的毒性作用。从中药性味的角度配伍，可以在补骨脂的配伍用药方面寻找一定的规律，如减毒配伍包括寒-温并用、辛-酸相制。增效配伍有温-热通用、辛-温配合、甘-温合用等。目前补骨脂相关不良反应的研究仅限于对其主要活性成分的单体部分，忽略了补骨脂不同成分之间是否存在相互的影响，具有一定的片面性[45]。补骨脂在人体内的吸收及转换和其安全性和有效性密切相关，也是药理作用研究的基础，在以后的研究中，可以结合其在机体内的药代动力学进行研究，可能会有更多的不同的发现。

6 对补骨脂的认识和思索

随着中医药的不断发展和科学技术的不断进步，人们对中药的机理机制研究也日渐地深入和完善。补骨脂作为一味临床的常用药物，其临床的治疗范围和治疗功效均日渐突出，尤其在治疗不孕不育、女性雌激素水平下降以及抗肿瘤等方面的相关疾病中，补骨脂有着不可替代的重要位置。但是，随着人们对其认识的深入，补骨脂的一些弊端，即目前基于实验研究方面的补骨脂的毒性，也时刻困扰着医师和患者，至于补骨脂在其治疗疾病的同时，到底会不会给人体带来不可逆转的伤害，到底是其功大于过，还是过大于功，有待于进一步的研究和探讨。

补骨脂单味药的不良反应研究到目前为止已经非常明了。不过，中医药临床辨证用药中很少有用單味的补骨脂来治疗疾病，很多时候都是用补骨脂复方来治疗临床上的一些疾病。中药中有许多有毒的药物，但是在其合理的用药范围内是安全的，相关规定补骨脂的临床用量范围是6～9 g不会出现不良反应。中药毒性在中医中分为广义和狭义2种解释，广义毒性是指药物具备的特性和功能，狭义上指的是药物的不良反应。

中医临床用组方讲究的是君、臣、佐、使相辅相成。其中佐药中又有佐制药，即消除或减轻君、臣的的毒性或制约其峻烈之性的药物。所以，许多药物的毒性在复方中药中得到了抑制甚至消除。目前没有足够的实验或临床研究表明复方补骨脂的毒性是否依然影响其临床中的使用。另外，中药之间亦有有相须、相使、相杀、相畏等，两味中药之间的相互毒性可以得到消除或抑制，实验研究表明，补骨脂和甘草配伍，并没有增强或减弱其不良反应，但是和其他药物的配伍呢？有没有可以增强或者降低甚至消除补骨脂的毒性的中药呢？

根据中医理论，中药毒性是在临床辨证用药的过程中，通过其临床的治疗功效研究发现和认知的。中药的功效、不良反应以及证候3者之间密切相关，不可单独地割裂开来。对其毒性的研究应置于适应证、证候之中，综合、科学地评判整体治疗效果，而不能独立地认为其有毒性就不加以应用而“就毒性论毒性”，因噎废食，当然，也不可以无视单味中药本身的毒性而盲目的使用。

目前我们对中药的研究还比较倾向于对单味中药的成分及药理作用的机制研究，而对中药复方的研究尚且缺乏，因此对多味中药配伍的开发及研究，科学地阐明更多中药之间的相互影响，对中医药事业的进步发展、对人类的健康及幸福都是必不可少的。

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作者：穆国华 石玥 申萌萌 吴丽婷 赵青竹 刘雁峰