沙棘资源开发利用探究论文

摘要[目的]比较不同干燥方法对沙棘提取物水分及活性成分含量的影响，指导沙棘提取物生产实践。[方法]分别采用烘干法、紫外分光光度法、高效液相色谱法测定不同干燥方法沙棘提取物中水分、总黄酮、异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。[结果]冷冻干燥提取物中水分含量最低，总黄酮和异鼠李素-3-O芸香糖苷含量最高。下面小编整理了一些《沙棘资源开发利用探究论文(精选3篇)》的文章，希望能够很好的帮助到大家，谢谢大家对小编的支持和鼓励。

沙棘资源开发利用探究论文 篇1：

沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌活性

[摘要]随着时代发展与社会进步，细菌从被发现到现在已经与人们的生活息息相关，怎样抑制一些细菌的生长成为人们关注的问题。本实验以沙棘叶为原料，通过乙醇提取，再经过多级萃取，然后使用平板涂布菌种的方法探究沙棘叶正丁醇萃取物对三种细菌的抑菌效果。结果表明，沙棘叶正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的确具有抑制效果。

[关键词]沙棘叶;正丁醇;抑菌活性

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）又名醋柳、酸刺，胡颓子科沙棘属，是西藏本地医生、蒙古本地医生习用药材。沙棘可以在许多恶劣的条件下生存，是防风暴、固定沙土、防止水土流失、保护生态环境价值最高的树种[1]。

有研究表明，沙棘叶黄铜提取物对人体的皮下组织具有抗炎作用[2]，对于促进伤口的愈合，治疗炎症与烫伤等有很好的效果[3]。沙棘果实营养丰富，据测定，其果实中含有多种维生素、脂肪酸、微量元素、亚油素、沙棘黄酮等活性物质和人体所需的各种氨基酸[4]。近年研究还表明沙棘黄酮具有抗氧化、抗溃疡、抗肿瘤、抗心律失常、增强机体免疫力、提高耐缺氧能力等药理功效[5-6]，且沙棘果多糖具有明显的抗氧化活性，抗氧化作用随浓度增加而加大[7]。

本文开展了沙棘叶抑制细菌生长的实验研究，对进一步了解沙棘叶的抑菌机理以及今后开发利用沙棘以及沙棘叶等沙棘相关产品提供了理论依据。

1 试验概述

1.1 主要仪器和设备

恒温培养箱：北京恒奥德科技有限公司;电子秤：厦门雄发仪器仪表有限公司;高压蒸汽灭菌锅：山东博科生物产业有限公司;超净工作台：南京贝登电子商务有限公司;恒温水浴锅：苏州江东精密仪器有限公司;分液漏斗、旋转蒸发仪：上海科兴仪器有限公司;电磁炉：美的集团有限公司。

1.2 菌种

大同大学生命科学学院提供的菌种为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subfilis）。

1.3 主要药品

95% 乙醇、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯。

1.4 培养基

1.4.1 牛肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15～25g，加水1 000mL，调pH到7.4～7.6。

1.4.2 液体培养基

牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，蒸馏水100mL，调pH到7.2～7.5。

1.5 沙棘材料

沙棘采用的是中国沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），沙棘叶购买于山西五台山沙棘制品有限公司，为确保数量可以完成实验，购买500g。

1.6 沙棘叶正丁醇萃取物的制备

沙棘叶正丁醇萃取流程图，见图1。

1.6.1 沙棘叶粉碎

沙棘叶放入粉碎机中粉碎后取出筛选，将体积大的叶片加入粉碎机进行二次粉碎，将两次结果合并，干燥保存备用。

1.6.2 沙棘叶粉末乙醇浸提

取100g沙棘叶粉末分别加入1L烧杯中，共4个烧杯，再分别加入1L 95%乙醇，拿玻璃棒轻微搅拌后放入4℃冰箱5h，取出后经过滤得到滤液，保存备用。再取滤渣分别放入4个1L烧杯中，重复上述步骤，弃去滤渣，将所有滤液合并。

1.6.3 减压浓缩

启动旋转蒸发仪的冷凝装置，打开水浴锅，调节温度为45℃，安装回收溶剂瓶，然后打开真空泵里边的循环水，再打开开关，将旋转蒸发仪的放气活塞关闭并将沙棘叶乙醇提取液加入旋转瓶。当整个系统达到一定的真空度时，打开旋转按钮并调节转速。等旋转蒸发结束后，得到浸膏，保存备用。

1.6.4 石油醚萃取

将上一步得到的浸膏放入烧杯中，加入部分蒸馏水搅拌使其完全溶解。再加入3倍上步蒸馏水体积的石油醚，一起加入已經经过检漏的分液漏斗中，将其摇晃充分后，将分液漏斗固定并等待其中的液体静止分层，之后将水层和石油醚萃取液分离。按照上述过程操作3次，合并本步骤所有的萃取液，将其室温条件密封保存备用。

1.6.5 乙酸乙酯萃取

将上一步得到的蒸馏水溶液再加入分液漏斗中，用3倍体积乙酸乙酯来与其混合，然后用上一步的萃取操作重复3次萃取，之后合并所有乙酸乙酯的萃取液。

1.6.6 正丁醇萃取

将上一步蒸馏水溶液加入分液漏斗，同样加入3倍正丁醇和蒸馏水层充分混合，再用上一步萃取的操作重复3次萃取，最后合并所有的萃取液，将其保存备用。

1.6.7 减压浓缩

将石油醚萃取液放入旋转蒸发瓶中，通过操作成为浸膏。然后将乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液用同样的操作达到浸膏，再放入冰箱冷冻干燥，于-20℃冰箱中保存备用。

1.7 抑菌实验

1.7.1 菌株活化

在超净工作台内用无菌接种环将试验菌种接到做好标签标记的斜面培养基上，然后把细菌置于恒温培养箱内，温度设置为36℃，时间为22h，最后放入0℃～4℃冰箱冷藏，准备接下来步骤使用。

1.7.2 培养基平板的配制

将配置好的培养基倒入锥形瓶中，使用高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌后取出，放进超净工作台。放好之后等待培养基凝固，为防止污染，需将平板倒置。最后将所有平板摆放整齐，在无菌条件下保存。

1.7.3 菌悬液的配制

在无菌的操作条件下，取出活化培养好的菌，用接种环分别挑取三种菌，分别接入经过高压蒸汽灭菌的无菌水中，轻微震荡使其均匀。然后用麦氏比浊法测菌悬液浓度，通过加入无菌水等方法控制菌悬液中的细菌数为1×108～2×108个/mL。

1.7.4 沙棘叶正丁醇提取液的配制

将沙棘叶正丁醇萃取物用电子秤称量0.5g、1.0g、1.5g、2.0g，将其分别放入小试管后再分别加入1mL正丁醇，搅拌摇晃使其溶解。

1.7.5 用滤纸片法测定沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌效果

首先在滤纸上画好半径3mm的圈，再用剪刀把滤纸剪成直径为6mm的小圆片，分别放置于小试管内，用报纸包裹，并将其扎紧。准备好后，进行灭菌。将灭菌后的滤纸片放在超净工作台中，分别放入之前准备好的无菌水与提取液中，浸泡放置，以备后用。然后使用移液枪分别取300μL三种菌悬液。用无菌涂布器均匀涂布，用无菌的镊子，分别镊取不同浓度滤纸片，轻轻地贴在前几步制好的平板。同时把对照组的纸片也贴在平板上。每个含菌平板上间隔一定距离贴5片，具体纸片间距大于20mm，纸片与培养皿壁间距超过12mm。通过培养后测抑菌圈直径。

1.8 数据分析

所有的实验均重复3次，之后利用Excel 2003进行标准曲线的绘制与数据分析。

2 结果与讨论

2.1 沙棘叶正丁醇萃取结果

沙棘叶萃取结果，见图2。

2.2 沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌作用

2.2.1 沙棘叶正丁醇萃取物对大肠杆菌的抑制效果

通过观察培养基，可以看出阴性对照组的抑菌圈几乎没有，而其余经过沙棘叶正丁醇萃取物浸泡后的纸片，均出现了抑菌圈，其中萃取液浓度为0.5g/mL和1.0g/mL的纸片抑菌圈小一点，2g/mL的纸片抑菌效果最好（见表1），抑菌圈周围出现不同程度向周围扩散的无菌区域，由此可知，沙棘叶正丁醇萃取物可以抑制大肠杆菌的生长且抑菌效果较为明显。

2.2.2 沙棘叶正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果

观察培养基，可以看到经过沙棘叶正丁醇萃取物浸泡后的纸片均出现了抑菌圈，其中萃取液浓度为1.0g/mL的纸片抑菌圈小一点，达到了9mm，萃取液浓度是2g/mL的纸片抑菌效果较好，达到了11mm（见表2）。

其中抑菌圈周围出现不同程度向周围扩散的无菌区域，而相对于没有萃取物浸泡的纸片，并不存在抑制效果。因此，沙棘叶正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌的生长确实存在抑制效果。并且由于抑菌圈较大，因此可以认为效果较好。

2.2.3 沙棘叶正丁醇萃取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果

观察培养基，可以看出阴性对照组抑菌圈没有，而其余几组经过沙棘叶正丁醇萃取物浸泡后的纸片，在培养基上均出现了抑菌圈，其中萃取液浓度为0.5g/mL的抑菌圈为8mm，萃取液浓度为1.0g/mL的纸片抑菌圈为9mm，萃取液浓度为2g/mL的纸片抑菌效果最好，达到了12mm（见表3），其中抑菌圈周围出现不同程度的向周围扩散的无菌区域，沙棘叶正丁醇萃取物对大肠杆菌的生长确实存在抑制效果，并且由于萃取物成分复杂，且一定范围内，抑菌效果随萃取物的浓度变化而变化，因此浓度越高抑菌效果就越好。

2.3 抑菌实验结果及分析

根据实验结果可知，沙棘叶正丁醇萃取物对三种试验菌都存在不同程度的抑制作用，并且抑制效果非常明显。在一定范围内，抑菌效果随萃取物的浓度而变化，浓度越高抑菌效果就越好。

本文对沙棘叶进行较为常规的提取萃取，从中提取部分有效成分，并对其抑菌活性做了研究。本次研究的初步成果可以作为食品保鲜防腐的技术参考，沙棘叶正丁醇萃取物可以有效抑制有害菌的生长，也有利于沙棘叶资源的综合利用。

关于萃取物抑菌效果，刘世旺等[8]将不同浓度虎耳草乙醇提取物对三种实验菌进行抑菌实验。其实验结果与本实验对照比较来看，沙棘叶正丁醇萃取物与虎耳草乙醇提取物对三种菌的抑菌效果相差无几，并且沙棘叶正丁醇萃取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果较虎耳草乙醇提取物强。

在萃取物应用方面，因为食品中常常含有本次实验的三种试验菌，其均为对人体有害菌，很有可能会引起食物中毒，甚至可能会导致死亡。故而，沙棘叶正丁醇萃取物可以当作一种很好的食品保鲜防腐剂。

就沙棘叶今后的发展来说，因为沙棘叶中含有的多种活性成分，除了有抑菌作用，还有许多药理作用。沙棘叶黄酮能有效地清除超氧阴离子和羟自由基，并且随着黄酮提取液浓度的增大，清除率逐渐上升。不仅如此，沙棘叶还有许多的活性物质并拥有不同的药用价值。所以，沙棘叶中含有的活性成分是今后研究的内容与方向。

实验还存在不足之处，沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌作用原理复杂，本文只是初探抑菌效果，为了保证充分地利用沙棘叶资源，对其抑菌的特点以及机理还需要进一步深入研究。

3 结 论

本实验以沙棘叶为原料，采用乙醇浸提，然后进行多级萃取，得到沙棘叶正丁醇萃取液11.1g，分别以革兰氏阳性菌中两个较为常见的菌：金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，以及革兰氏阴性菌中较为常见的大肠杆菌为试验菌种，通过抑菌圈来评价沙棘叶正丁醇萃取物的抑菌效果。结果表明，萃取液对三种菌均出現不同程度的抑菌效果。沙棘叶正丁醇萃取物对革兰氏阳性菌抑制明显且对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最好，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌相对来说较差，说明沙棘叶的正丁醇萃取物对革兰氏阳性菌抑制十分明显。经过学者研究，原因很有可能是沙棘叶中有效的抗菌活性物质含量比较高。并且沙棘叶正丁醇萃取物对大肠杆菌也出现了十分明显的抑菌圈，由此可见，正丁醇萃取物对（下转第页）（上接第页）三种试验菌均有抑制效果。

参考文献

[1] 郭云龙.围场沙棘资源开发利用设想[J].防护林科技，2007（S1）： 51-52.

[2] 梁艳文，孙贺，何罗香，等.玉米须纯化黄酮抗炎作用及急性毒性实验[J].吉林化工学院学报，2016，33（7）：13-16.

[3] 张新军，章茂顺，高志芬，等.醋柳黄酮对原发性高血压患者交感神经兴奋性的影响[J].华西医科大学学报，2001（4）：547-550

[4] 李晓花，孔令学，刘洪章.沙棘有效成分研究进展[J].吉林农业大学学报，2007（2）：162-167.

[5] 房兴莉，晋津，晋坤贞.沙棘叶的营养成分及其饮料开发[J].农牧产品开发，1996（11）：15-16.

[6] 张郁松，罗仓学.沙棘资源开发与沙棘黄酮提取[J].食品研究与开发，2005（3）：46-47.

[7] 刘春兰，杨万政，刘海青，等.沙棘叶水溶性多糖的初步纯化及体外清除自由基活性研究[J].内蒙古大学学报（自然科学版）， 2007（1）：35-38.

[8] 刘世旺，徐艳霞.虎耳草乙醇提取物抑菌作用的研究[J].资源开发与市场，2007（6）：481-482+489.

收稿日期：2019-10-23

作者简介：杨阳，男，博士，讲师，研究方向为天然产物营养与抗菌。

作者：杨 阳　郎文凯　杨 茂　刘文英

沙棘资源开发利用探究论文 篇2：

不同干燥方法对沙棘提取物中活性成分含量的影响

摘要 [目的]比较不同干燥方法对沙棘提取物水分及活性成分含量的影响，指导沙棘提取物生产实践。[方法]分别采用烘干法、紫外分光光度法、高效液相色谱法测定不同干燥方法沙棘提取物中水分、总黄酮、异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。[结果]冷冻干燥提取物中水分含量最低，总黄酮和异鼠李素-3-O芸香糖苷含量最高。[结论]干燥方法对沙棘提取物的含水量、活性成分含量产生一定程度影响，该研究结果为沙棘提取物的进一步研究和利用提供了试验依据。

关键词沙棘提取物;干燥方法;水分;总黄酮;异鼠李素-3-O芸香糖苷;活性成分

中圖分类号R282.4文献标识码A

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.050

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Different Drying Methods on the Content of Active Ingredients in the Extracts of Hippophae rhamnoides L.

LI Zhi-fang1，2， WEN Kui-shen1，ZHAO Jian-jun1，2，3 et al

（1. Schoole of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan，Ningxia 750004;2. Ningxia Research Center of Modern Hui Medicine Engineering and Technology，Yinchuan， Ningxia 750004;3. Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization， Ministry of Education，Ningxia Medical University，Yinchuan， Ningxia 750004）

Key wordsExtracts of Hippophae rhamnoides L.;Drying methods;Water;Total flavonoids;Isorhamnetin-3-O rutin;Active ingredients

沙棘为胡颓子科植物沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果实，蒙古族、藏族习用药材，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀的功效，用于治疗脾虚食少、食积腹痛、咳嗽痰多、胸痹心痛、瘀血经闭、跌扑瘀肿等症[1]，是国家卫健委公布的药食同源中药。沙棘富含多种化学成分，包括黄酮类、糖类、维生素类、甾醇类、类胡萝卜素类、挥发油类及微量元素等[2-4]。黄酮类化合物为其重要的活性物质，主要包括槲皮素、异鼠李素、杨梅素、山奈酚等黄酮苷元及其苷类，在治疗心脏疾病、高血压、高血脂、高血糖、肿瘤等方面具有良好的作用[5-7]。

中药提取物的干燥过程是其制备过程的重要环节，不同的干燥方法对提取物中指标成分有不同程度的影响[8-9]。笔者以沙棘总黄酮、异鼠李素-3-O芸香糖苷为指标成分，分析不同干燥方法对沙棘提取物中活性成分的影响，为优化沙棘提取物的干燥工艺提供试验依据，也为其进一步开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。LC-20A高效液相色谱仪（岛津公司）;UV-2450紫外分光光度计（岛津公司）;EL 204电子分析天平（梅特勒-托利多）;Biosafer-12A 冷冻干燥机（赛飞（中国）有限公司）;WFO-700W送风式定温干燥箱（上海爱朗仪器（东京理化器械））;Wi17896超声波中药提取器（东西仪（北京）科技有限公司）;R-1050CE旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）

1.1.2试材。沙棘，购自宁夏隆德县美隆饮料制品有限公司，经宁夏医科大学药学院王汉卿副教授鉴定为沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果实，按《中国药典》2015年版一部沙棘项下标准检测，结果符合规定。

1.1.3试剂。对照品芦丁（批号16111111，纯度98.0%），购自上海雅吉生物科技有限公司;对照品异鼠李素-3-O芸香糖苷（批号604-80-8，纯度98.0%），购自成都埃法生物科技有限公司;乙腈（色谱纯，Fisher公司）;高效液相分析用水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1

提取物的制備。取5 kg沙棘干果，置超声波中药提取器中，加入30 L 60%乙醇（固液比1∶6），提取温度为60 ℃，超声提取3次，每次1 h，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.28～1.31的稠膏（80 ℃）。

1.2.2

干燥处理。将相同质量的沙棘提取物稠膏分别按不同的方法干燥，粉碎后过筛（过3号筛），进行测定。比较不同干燥方法对其含水量及活性成分含量的影响。

1.2.2.1

冷冻干燥。称取沙棘提取物稠膏200 g，在 -80 ℃ 预冻24 h，然后进行冷冻干燥。冻干条件：阱温度-40 ℃，真空度0.025 MPa，干燥时间48 h。

1.2.2.2

低温热风干燥。称取沙棘提取物稠膏200 g，平铺于白瓷盘中，鼓风干燥箱中干燥。干燥条件为60 ℃、36 h。

1.2.2.3

高温热风干燥。称取沙棘提取物稠膏200 g，平铺于白瓷盘中，鼓风干燥箱中干燥。干燥条件为80 ℃、18 h。

1.2.3

水分的测定。按照《中国药典》2015年版第四部0832水分测定法之烘干法（第二法）测定。分别精密称取不同方法干燥的干膏粉2 g，依法操作，每个样品平行测定3份。

1.2.4

总黄酮含量的测定。

1.2.4.1

对照品溶液的制备。精密称定芦丁对照品19.20 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含芦丁0.384 mg的对照品溶液。

1.2.4.2

标准曲线的绘制。精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按照紫外可见分光光度法，在500 mn的波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标、对照品溶液浓度（X）为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4.3

供试品溶液的制备。取不同干燥方法制得的干浸膏粉约0.1 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液。

精密量取续滤液5 mL，置25 mL容量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，按照“1.2.4.2”方法，自“加5%亚硝酸钠溶液1 mL”起，依法测定吸光度，同时取供试品溶液5 mL，除不加氢氧化钠试液外，其余同“1.2.4.2”操作，得到的溶液作为空白，通过回归方程计算出供试品中总黄酮的量（以芦丁计）。

1.2.4.4

精密度试验。取同一对照品溶液，按照“1.2.4.1”方法显色后，测定吸光度6次，并计算RSD。

1.2.4.5

重复性试验。精密称取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，各约0.1 g，按照“1.2.4.3”方法测定，并计算总黄酮含量的RSD。

1.2.4.6

稳定性试验。精密量取供试品溶液和对照品溶液各5 mL，按照“1.2.4.3”方法显色，放置15 min后，分别在30 min内每隔5 min在500 nm波长处测定，计算30 min内吸光度的RSD。

1.2.4.7

加样回收率试验。取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，各约0.1 g，精密称定。精密称定芦丁对照品25.20 mg，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得每1 mL含芦丁2.52 mg的对照品溶液。分别精密量取对照品溶液1 mL，加入所称样品中，即各加入芦丁对照品2.52 mg，平行制备供试品溶液，按照“1.2.4.3”方法测定，计算回收率。

1.2.4.8不同干燥方法沙棘提取物中总黄酮含量。总黄酮含量按下式计算：

总黄酮含量（mg/g）=（Y+0.003）×25×250.011×m×5×1 000（1）

其中，Y为吸光度;m为称取的样品质量（g）。

1.2.5异鼠李素-3-O芸香糖苷含量的测定。

1.2.5.1

色谱条件。采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相A为乙腈，B为1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～6 min，5%～15%A;6～15 min，15% ～20%A;15～20 min，20%～25%A;20～30 min，25%～40%A;30～35 min，40%～50%A;35～39 min，50%～70%A;39～39.5 min，70%～5%A;39.5～45.0 min，5%～5%A;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长380 nm，进样量20 μL。

1.2.5.2

对照品溶液的制备。精密称取异鼠李素-3-O芸香糖苷对照品14.10 mg，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得每1 mL含异鼠李素-3-O芸香糖苷0.282 mg的对照品溶液。

1.2.5.3

供试品溶液的制备。取不同干燥方法制得的干浸膏粉约0.2 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜濾过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.5.4

标准曲线的绘制。分别精密量取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的对照品溶液。在“1.2.5.1”色谱条件下进样测定，以对照品溶液浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。

1.2.5.5

精密度试验。取同一对照品溶液，连续进样6次，测定异鼠李素-3-O芸香糖苷峰面积的RSD。

1.2.5.6

重复性试验。精密称取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，按照“1.2.5.3”方法制备供试品溶液，进样测定，计算含量的RSD。

1.2.5.7

稳定性试验。取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、1、2、4、6、8 h测定峰面积，并计算峰面积的RSD。

1.2.5.8

加样回收率试验。取冷冻干燥的沙棘提取物干浸膏粉6份，各约0.2 g，精密称定。各加入异鼠李素-3-O芸香糖苷对照品1.15 mg，平行制备供试品溶液，按照“1.2.5.1”条件进行测定，计算回收率和RSD。

1.2.5.9不同干燥方法沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。异鼠李素-3-O芸香糖苷含量按下式计算：

含量（mg/g）=（Y+83 081）×2559 085×m×1 000（2）

其中，Y为峰面积;m为称取的样品质量（g）。

2结果与分析

2.1不同干燥方法沙棘提取物水分含量

经分析，高温烘干沙棘提取物水分含量（2.8%）略低于低温烘干的（3.1%），而冷冻干燥沙棘提取物水分含量（1.0%）明显低于前二者。冷冻干燥是将含水物质先冻结成固态后，再使其中的水分升华成气态而除去水分的方法，干燥后的物质成多孔的海绵状，体积、性状基本不变，水分不会被包裹，因此能使水分除去更完全。

2.2不同干燥方法沙棘提取物中总黄酮含量

2.2.1

线性关系考察。以吸光度（Y）为纵坐标、对照品溶液浓度（X）为横坐标绘制标准曲线（图1），进行线性回归，得出回归方程为Y = 0.011 6X-0.003 8（R2= 0.999 7），表明总黄酮在7.68～76.80 μg/mL有良好的线性关系。

2.2.2精密度试验。按“1.2.4.4”方法操作，测定吸光度6次，RSD为0.25%，表明在此试验条件下精密度良好。

2.2.3重复性试验。按“1.2.4.5”方法操作，计算得总黄酮含量的RSD为1.7%，表明该方法重复性良好。

2.2.4

稳定性试验。按“1.2.4.6”方法操作，计算得出30 min内吸光度的RSD为0.86%（n=7），表明显色放置15 min 后的溶液在30 min内稳定。

2.2.5加样回收率试验。按“1.2.4.7”方法操作，计算得出回收率为93.1%，RSD 为2.4%，表明该方法准确、可靠，可用于沙棘提取物中总黄酮的含量测定。

2.2.6不同干燥方法沙棘提取物中总黄酮含量。试验结果表明，干燥方式影响沙棘提取物中总黄酮含量;干燥过程中温度越高，总黄酮损失越多。冷冻干燥提取物中总黄酮含量最高（47.35 mg/g），低温烘干的次之（29.04 mg/g），而高温烘干的最低（23.37 mg/g）。提取物热烘干过程中需要经过60 ℃或80 ℃的持续加热，可能会造成黄酮类成分损失。

2.3不同干燥方法沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量

2.3.1线性关系考察。以对照品溶液浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线（图2），进行线性回归，得出回归方程为Y =59 085X - 83 081（R2= 0.998 3），表明异鼠李素-3-O芸香糖苷在2.82～70.50 μg/mL有良好的线性关系。

2.3.2精密度试验。按“1.2.5.5”方法操作，测得异鼠李素-3-O芸香糖苷峰面积的RSD为0.42%（n = 6），表明在此试验条件下精密度良好。

2.3.3重复性试验。按“1.2.5.6”方法操作，计算得出异鼠李素-3-O芸香糖苷含量的RSD为2.0%（n = 6），表明该方法重复性良好。

2.3.4稳定性试验。按“1.2.5.7”方法操作，计算得出异鼠李素-3-O芸香糖苷峰面积的RSD为1.8%（n = 6），表明异鼠李素-3-O芸香糖苷在8 h内比较稳定。

2.3.5加样回收率试验。按“1.2.5.8”方法操作，计算得出回收率为93.1%，RSD 为3.2%，表明该方法准确、可靠，可用于沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷的含量测定。

2.3.6不同干燥方法沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量。试验结果表明，干燥方式对沙棘提取物中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量略有影响。冷冻干燥中异鼠李素-3-O芸香糖苷含量最高（4.86 mg/g），低温烘干的次之（4.65 mg/g），而高温烘干的最低（4.41 mg/g）。

3讨论与结论

干燥是中药生产中的重要环节，中药在干燥过程中，除有物料间的混合和物理蒸发外，还有药物各成分间的相互作用，可能发生氧化、还原、聚合、水解、异构化等化学反应，从而引起物料物理稳定性、化学稳定性及生物稳定性的改变，进而对中药的内在质量与后续的临床疗效产生不同程度的影响[10]。

该试验以沙棘提取物中总黄酮及其主要黄酮苷类成分异鼠李素-3-O芸香糖苷为评价指标，分析不同干燥方法对沙棘提取物的影响，结果表明，冷冻干燥法所得沙棘提取物水分含量明显低于烘干法。原因可能是冷冻干燥过程中物质先冻结成固态后，其中的水分直接升華成气态而除去，干燥后的物质成多孔的海绵状，水分不会被包裹，能使水分除去更完全。物料含水量较低，不易返潮结块，有利于长期保存。

干燥温度对沙棘提取物中活性成分含量有显著影响，试验结果表明，冷冻干燥沙棘提取物中总黄酮含量远高于低温和高温烘干者。黄酮类物质含有大量酚羟基，容易被氧化，而冷冻干燥可以阻止氧化过程。冷冻干燥不经过加热过程，有利于保持提取物中的黄酮类成分。而低温烘干和高温烘干需经过60 ℃和80 ℃的加热过程，会造成黄酮类成分的损失。低温烘干提取物中总黄酮含量高于高温烘干者，试验也证实温度越高，黄酮类物质损失越多。由此可见，冷冻干燥对提取物中活性成分的保留具有明显优势。

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作者：李治芳 温奎申 赵建军 雍婧姣 高晓娟 王汉卿 张霞

沙棘资源开发利用探究论文 篇3：

肋果沙棘幼苗抗氧化酶系统及总黄酮对UV-B辐射增强的响应

摘 要： 该文以青藏高原特有木本植物肋果沙棘为材料，在62 μW·cm-2的UV-B辐射强度下，分别测定处理了0～6 d幼苗叶片的氧化损伤程度、抗氧化系统酶活性和总黄酮含量及其抗氧化活性，以探究肋果沙棘对UV-B辐射的生理生态响应机制。结果表明：随UV-B辐射时间的增加，肋果沙棘幼苗过氧化氢含量（H2O2）和膜脂过氧化产物（MDA）显著增加;抗氧化系统酶中过氧化氢酶（CAT）活性显著升高;过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性呈先降后升的趋势，且活性均显著低于对照，超氧化物歧化酶（SOD）活性无明显变化;总黄酮含量随辐射时间的积累显著增加，作为非酶抗氧化物质的总黄酮对1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）的清除率与其含量变化具有显著正相关关系。综上结果表明，肋果沙棘幼苗在抵御该辐射产生的氧化损伤中，通过提高CAT活性及增加总黄酮含量来抵御辐射造成的氧化损伤。

关键词： 木本植物， 肋果沙棘， UV-B辐射， 抗氧化酶系统， 总黄酮

文献标识码： A

Key words： woody plant， Hippophae neurocarpa， UV-B radiation， antioxidant enzyme system， total flavonoid

近40年來，臭氧层一直受到人为的化学扰动（Portmann et al.， 2012）。据统计，全球范围内的臭氧浓度在过去的20年内已减少2%～3%，南极地区的减少量已达50%，且臭氧层空洞仍在继续扩大（方荧等，2018），而臭氧层变薄会导致到达地球表面的UV-B（280～320 nm）辐射增强，这已引起了国内外研究者的高度关注。尽管UV-B辐射是太阳辐射中极小的一部分，但它具有的能量极高，即便是微量的增加，也足以对植物生存及全球生态系统带来严重的影响（蒲晓宏等，2017）。增强的UV-B辐射会导致植物出现矮化、叶面积减小、叶片卷曲、叶片厚度增加、节间缩短等形态方面的变化（Shi et al.， 2004）;也会造成多数植物花粉萌发和花粉管生长受到不同程度的抑制（Llorens et al.， 2015）、细胞活性氧（ROS）水平增加、叶片中紫外吸收物含量增加、光合作用减弱等生理生化方面的影响;在分子水平上影响植物体内蛋白质的合成与分解、造成DNA损伤等;使生态系统中群落结构和物种多样性发生改变等。植物为抵御UV-B辐射带来的伤害，就必须及时有效地做出相应的适应性反应。许多针对此方面已开展的研究工作表明，植物不仅可以通过抗氧化酶系统的调节以降低UV-B对其产生的氧化损伤（王园等，2017;褚润等，2018），还会促进以黄酮类化合物为主的次生代谢产物的合成，来吸收紫外辐射、发挥抗氧化作用（Tegelberg et al.， 2004;李元等，2006;田向军等，2007）。然而，国内外此类研究多在草本植物中开展。UV-B为短波光，会产生漫射性辐射，木本植物植株因较草本植物高大，且世代时间长，所以比草本植物受到的辐射量大，次生代谢产物的积累量大（Lin et al.， 1998），这种特点可能会造成木本植物和草本植物不完全相同的响应机制，因此开展木本植物的相关研究对揭示植物响应UV-B辐射的机制具有重要的意义。

高山、高原等全球高UV-B辐射量地区受到的紫外辐射要比同纬度其他地区强很多。青藏高原是世界第三极，也是臭氧递减的强中心之一（刘煜和李维亮，2001;薛志航等，2018），以生存分布于此的生物为材料展开相关研究，对于理解植物抵抗UV-B辐射的生理生态响应机制也具有独特的价值。肋果沙棘（Hippophae neurocarpa）是胡颓子科沙棘属（Hippophae L.）雌雄异株的落叶灌木，喜光照，仅分布于青藏高原海拔2 800～4 300 m的河流沿岸、河滩及沟谷，具有重要的经济和水土保持价值（廉永善，2000;Sun et al.， 2002）。作为长期生活于强紫外辐射环境中的特有木本植物，如何适应这一胁迫条件？其叶片中富含的黄酮类化合物是否在其适应强紫外辐射方面发挥着重要作用？这些问题值得我们去探究。所以本文将对增强UV-B辐射下肋果沙棘幼苗叶片的氧化损伤和抗氧化机制进行研究分析，以助于我们了解肋果沙棘等生长于青藏高原的植物对UV-B辐射的生理响应及适应机制，进一步揭示木本植物对UV-B辐射的适应对策，同时这对于肋果沙棘资源的保护与开发利用具有理论参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验通过对肋果沙棘种子进行室内培养，以其幼苗叶片作为研究对象。选取颗粒饱满、大小均一的肋果沙棘种子，种植于直径11 cm的塑料花盆内，培养基质为蛭石∶草炭土∶珍珠岩=2∶1∶1，每盆8颗，在植物培养室内培养，昼夜温度26 ℃/22 ℃，保持水分充足，每天光照14 h，光强7 000 lx。供试肋果沙棘种子于2016年10月采自青海省海北藏族自治州祁连县野牛沟，地理位置为100°14′39″ E、38°20′41″ N，海拔2 936 m。

1.2 UV-B辐射增强处理

待肋果沙棘幼苗长至20片真叶时，选取长势一致的幼苗，随机分配为对照组（CK）和UV-B处理组（T）2个实验组，处理组（T）在对照组（CK）基础上，进行UV-B辐射增强处理。UV-B辐射光源为国产紫外灯管（UV-B 313），将紫外灯管垂直悬挂于培养材料正上方，辐射强度为62 μW·cm-2，以模拟海北地区7月份UV-B辐射全天平均值增强30%，每天处理8 h（8：30—16：30）。随植物生长的高度，随时调整灯管的高度以保持植物所受紫外辐射强度的一致，辐射剂量由UV-B辐射照度计测得。于辐射处理的第0、1、2、3、4、5、6天在同一时间取样，进行实验指标的测定，每个指标3个生物学重复。

1.3 测定指标与方法

（1）H2O2的测定：称取0.1 g鲜叶加入2 mL丙酮进行研磨，然后参照Patterson et al.（1984）的方法进行测定。（2）MDA采用Aravind & Prasad（2003）的方法并略加修改。（3）抗氧化系統酶活性的测定：CAT活性采用紫外吸收法，酶活性用每分钟A240减少0.01的酶量为1个酶活单位（孙群和胡景江，2006）;SOD活性和POD活性分别采用NBT光还原抑制法和愈创木酚显色法（张蜀秋等，2011）;APX活性的测定参考Nakano & Asada（1981）的方法，并略加修改。（4）总黄酮的提取采用超声法：乙醇体积分数65%、提取时间40 min、料液比1∶25（g·mL-1）、功率40%、温度75 ℃，测定参考曹群华等（2004）的方法。（5）总黄酮对DPPH自由基清除率的测定参考张晓璐和徐凯宏（2008）的方法。

1.4 数据分析

采用Excel 365整理数据，SPSS 17.0进行相关性分析，Origin 7.5进行双样品t 检验，

P<0.05 差异显著。

2 结果与分析

2.1 过氧化氢和膜脂过氧化程度对不同辐射时间的响应

增强UV-B辐射，显著加剧了肋果沙棘叶片中H2O2含量及膜脂过氧化程度（MDA含量），在辐射1 d时，与CK相比差异不明显，之后随辐射时间的延长，H2O2和MDA含量总体呈上升趋势，且均在辐射2 d后出现显著升高现象，于6 d后达到最高值，分别与CK相比增加了107.9%和48.6%（图1：A， B）。

2.2 抗氧化酶活性对不同辐射时间的响应

随着UV-B胁迫时间的增加，4种抗氧化酶表现出不同的变化规律。SOD活性只在辐射1～2 d时有明显提高，在3 d开始与CK相比无显著差异，维持于平稳状态（图2：A）。CAT活性在辐射处理后逐渐升高，并于2 d后上升速度加快，随辐射时间的延长，于6 d时达到最高值，较CK增加了31.8%（图2：B）。而APX、POD在UV-B辐射处理下活性明显降低，分别于5 d和4 d达到最低值，较CK降低了40%、82.6%，虽在后期其活性有所回升，但均显著低于CK，且POD的活性变化较APX更为敏感（图2：C，D）。

2.3 总黄酮含量对不同辐射时间的响应

UV-B辐射对肋果沙棘幼苗叶片中总黄酮含量的积累具有显著影响，在辐射处理期间，其含量随辐射时间的延长呈先升高后降低的变化趋势，且均显著高于处理前的水平，并于辐射5 d达到最大值，

较CK增加了35.5%，但随辐射时间的延长，在辐射6 d时较辐射5 d下降了9%（图3）。

2.4 不同辐射时间下总黄酮对DPPH自由基的清除率

通过对肋果沙棘幼苗叶片中总黄酮的抗氧化活性进行研究，发现不同辐射时间下总黄酮对清除DPPH自由基的能力有显著差异。如图4所示，总黄酮对DPPH自由基的清除率随辐射时间的延长明显上升，在辐射处理3～5 d时，清除率趋于平稳且显著高于其他处理时间，并于4 d时达到最大值，清除率为85.7%，较CK提高8.2%。通过相关性分析表明，不同辐射时间下DPPH自由基的清除率与总黄酮含量之间呈显著的正相关关系。

3 讨论与结论

肋果沙棘幼苗叶片在增强UV-B辐射4 d后，开始出现卷曲、轻度萎蔫、叶缘褪绿的现象，且表现出积累效应。植物叶片是对UV-B、干旱、低温等逆境较为敏感的器官，叶片会快速直接地作出响应。但当遭受到胁迫时，在植物的形态结构还未发生明显可见的变化前，其体内ROS就已发生产消失衡，诱导H2O2等活性氧含量增加，诱发膜脂过氧化，出现MDA积累，进而造成氧化损伤。与高欣（2015）和魏晓雪等（2011）对木本植物的研究结果相似，在本实验中，增强UV-B辐射对肋果沙棘幼苗叶片的H2O2和MDA含量有较大影响，且随UV-B辐射的时间延长，H2O2和MDA含量都显著增加。

抗氧化酶系统可直接或间接地去除植物细胞中的ROS，从而减轻植物细胞受损程度（卡迪尔·阿布都热西提，2018），因此成为植物抵御胁迫的主要防御机制之一。其中存在于植物叶片细胞中不同部位的SOD、CAT、APX及POD，在清除细胞ROS的不同阶段发挥着不同作用。SOD主要存在于细胞质、叶绿体和线粒体中，可以使O2-·歧化为H2O2和O2，是构成植物抵抗氧化应激反应的第一道防线（Alscher et al.， 2002; Ding et al.， 2010）;而主要位于过氧化物体中的CAT和APX以及POD，则可消除H2O2。本研究中，肋果沙棘幼苗在UV-B辐射下，其叶片SOD活性在1～3 d较CK有所提高，但在辐射后期略有降低然后趋于平稳，与CK无显著差异，说明前期的辐射有助于SOD提高活力以清除O2-·，虽在后期其活力略有下降，但仍与对照几乎处于同一水平，同时这种较高的SOD活性，也可能是导致肋果沙棘叶片内H2O2含量较高的原因之一。CAT在辐射过程中一直表现为活性增加的趋势，且与对照差异显著，而POD和APX活性均低于处理前水平，虽在辐射后期有所回升，但仍与对照有显著差异，说明CAT在增强UV-B辐射持续处理肋果沙棘幼苗的过程中，一直对ROS的清除起主要作用，而POD和APX虽对胁迫产生了一定的适应性反应，但具有一定的局限性。这些结果表明，肋果沙棘幼苗对较高剂量的UV-B辐射可能存在一定的耐受性，并能够通过协调各抗氧化酶活性，达到减少UV-B辐射对肋果沙棘幼苗产生伤害的目的。

通过次生代谢产生紫外吸收物质是植物除了抗氧化酶系统外的又一抵御UV-B辐射伤害的有效防御机制。黄酮类物质主要分布于植物体近茎叶表皮细胞、叶蜡和叶茸毛及新生幼苗或幼叶中，已有研究表明，它不仅是UV-B辐射的主要吸收物质，可通过在植物地上部分表皮层的累积以有效减少UV-B辐射在表皮层的透过率，而且还可发挥作为自由基（如羟自由基、氧自由基）清除剂等的抗氧化作用（Anna et al.， 2013），协助抗氧化酶系统以共同抵御UV-B辐射对植物造成的氧化损伤。而DPPH就是一种以氮为中心的稳定的有机自由基，用于评估化合物抗氧化性的强弱（Foh et al.， 2010）。前人研究发现，青藏高原特有木本植物肋果沙棘幼苗叶片的总黄酮基础值高于苦荞、铁皮石斛、小麦、彩色马铃薯等一些草本植物（孟朝妮等，2005;董新纯等，2006;张新永等，2009;莫运才等，2015），且增强UV-B辐射能够诱导其总黄酮含量增加，Warren et al.（2002）在对其他木本植物的研究中也得到了类似结论，肋果沙棘幼苗叶片的总黄酮含量出现下降，这可能是由于长时间的UV-B辐射致使叶片的氧化损伤加剧。在增强UV-B辐射处理过程中，不同辐射时间下总黄酮清除DPPH自由基的能力随辐射时间的增加而增强，清除率可高达79.18%～85.70%，并呈现出与总黄酮含量变化一致的趋势，二者具有显著的正相关关系。以上结果表明，增强UV-B辐射能促使肋果沙棘幼苗叶片积累总黄酮，此类黄酮化合物除可先行屏蔽一部分紫外辐射外，还可作为自由基的清除剂，参与植物的抗氧化反应，与抗氧化酶系统在抵抗氧化损伤中共同协调发挥作用，从而增强对UV-B辐射的抵御能力。肋果沙棘幼苗叶片中较高的总黄酮含量可能是其在高寒强紫外环境下的长期进化形成的適应环境的对策。但当辐射时间进一步延长，会对其叶片细胞产生不可逆的伤害，损伤的积累效应增强，从而造成总黄酮的合成困难。

综上所述，在抗氧化酶系统中，肋果沙棘幼苗以提高CAT活性为主要机制，并通过协调各抗氧化酶之间的活性，来降低氧化损伤。而其较高水平的黄酮类物质代谢和积累在吸收紫外辐射和清除自由基方面也起着重要作用。这两大防御机制相互协同发挥作用，以抵抗UV-B辐射为其带来的伤害，这可能是肋果沙棘应对高海拔强UV-B辐射环境的适应性对策。

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（责任编辑 何永艳）

作者：周璇 贾志鹏 王娟 杜梅娜 苏雪