动物源活性多糖提取、纯化和结构鉴定技术的最新进展

1. 引言

动物源多糖以糖链作为基本骨架，常与蛋白质、脂质等结合成多糖复合体，这种结构特征赋予动物多糖不同的生物学活性，但对其纯化、结构鉴定、作用机制等研究带来了极大困难。在生物学、分析科学、生物信息学等相关学科发展的推动下，动物多糖在研究内容、方法上都获得了一定的进展。此前不断有综述报道，但大多集中于讨论动物多糖的提取分离和生物活性方面进展，对纯化过程、尤其是结构鉴定中诸多技术手段的应用和发展无系统总结。本文通过调研近年来文献，对提取、纯化、结构鉴定三个环节中常见的技术手段进行了总结，并对未来的研究方向进行了展望。

2. 提取方法

早期研究多采用水提法，该方法适用于透明质酸等不含硫酸基多糖的提取。近年来，动物多糖大都采用碱提取法或蛋白酶水解法。稀碱液提取法适用于多糖与蛋白质间结合型的转化，蛋白酶水解法是提取动物多糖的理想方法，蛋白酶作用的肽键范围广泛，可使蛋白质充分水解。

(1)水提法

动物多糖是极性大分子化合物，易溶于水，可采用热水提取，并利用多糖不溶于有机溶剂的性质，在提取液中加入乙醇等有机溶剂使多糖从提取液中沉淀出来，达到初步分离的目的。对黑螵蛸多糖[1]、蚕蛹多糖[2]的热水浸提试验表明，提取温度、提取时间、水的用量和料液比等因素可影响方法提取率。水提法操作简单方便，无污染，有广泛的适用性，但提取率低、多糖活性损失大，后续纯化困难。

(2)碱提法

碱提多糖是基于动物多糖中的糖肽键对碱的不稳定，利用稀碱液将糖肽键断裂而游离出多糖的过程。碱提法操作简便，得到的多糖粗制品中蛋白质的含量较少，在实际应用中较为广泛。目前已被用于黄粉虫多糖[3]、地鳖虫多糖[4]、微生物多糖[5]的提取。在提取过程中碱的浓度不易过大，应在温和条件下进行，以避免氨基多糖的碱降解和发生Walden转化或脱硫现象。

(3)蛋白酶水解法

由于动物多糖普遍以蛋白、肽等缀合物形式存在,是“粘多糖”“糖胺聚糖”。植物多糖提取方法不能完全适用动物多糖。相比较而言，酶法可选择性游离释放产物，具有产物反应条件温和、能使蛋白质充分水解、降解少且产量高、不破坏多糖生物活性，提取效果较好等优点。因此酶法提取在动物多糖的提取中有广泛的应用。其中蛋白酶水解法是提取动物多糖的理想方法，常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。酶法提取已被用于自水生动物[6]、昆虫[7]中多糖提取。

有学者将上述两种或两种以上的方法联合使用提取多糖，能对特定动物多糖提取获得良好效果[8]。目前，动物多糖的提取普遍存在着提取率不高、产品重现性差等缺点，除寻找快速、高效的动物多糖提取方法外，建立提取产品的质量控制标准并与产物活性相关联是多糖提取分离技术的关键，获得质量稳定，可重现的动物多糖产品对进一步开展产物的结构鉴定及体内的代谢研究具有十分重要的意义。

3. 分离纯化

动物多糖粗提液中含有无机盐类、低分子有机物、高分子量的蛋白质、核酸等大量杂质，需要通过各种有效的分离手段将其纯化成为单纯的均一多糖，以满足结构鉴定和下一阶段研究。目前动物多糖纯化方法主要有：分级沉淀、透析法、层析法、超滤法、制备性区域电泳等(表1)。这些方法和技术的特点及使用范围不同，如动物多糖的分级沉淀可能对糖胺聚糖活性产生影响，但能迅速除去粗提物中大量杂质，而层析法虽对活性无影响却存在产量小的问题。因此，在选择分离纯化方法的时候不仅要考虑到多糖的特异性，还要充分利用每种方法的优势，以达到最佳的分离纯化效果。实际工作中往往联合多种方法来达到纯化的目的。

4. 结构测定

目前，动物多糖结构鉴定主要为一级结构测定，包括糖基的组成、糖基排列顺序、异头碳构型、相邻糖基的连接方式、糖链有无分支、分支的位置与分支的长短等研究，通常联合采用物理方法及化学方法进行测定。物理方法主要采用红外光谱法(IR)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)等仪器分析技术进行解析。随着多糖结构研究向纵深发展，物理方法愈来愈显示其在大分子结构剖析中的重要性。

(1)红外光谱法

红外光谱主要用于不同糖的鉴别、糖苷键及糖构型的确定、糖键上主要取代基的识别等。IR分析常用的方法是将干燥的多糖用KBr压片在400-4000cm-1区间扫描获得红外光谱图。该红外谱区包含了多糖极为丰富的分子结构与组成的信息，其振动光谱的谱带较窄，特征性强，并且不破坏样品,对鉴定多糖结构有着重要价值。一般情况下，3600-3200cm-1O-H伸缩振动峰，表明多糖存在分子内和分子间的氢键;2900-2800cm-1左右处吸收为C-H的伸缩振动吸收峰;1400cm-1范围的吸收峰为C-H的变角振动吸收峰。上述三个吸收同时存在，即可判断待测分子为多糖[8]。在动物多糖的结构分析中，IR法不仅可以用于不同糖的鉴别、进行微克级的定量测定、取代基的识别等，还能够识别吡喃糖和呋喃糖、确定多糖中各种吡喃糖的糖苷键构型。此外，IR技术亦可用于已经被用于植物多糖的定量分析[9]。但红外谱图不能反映糖结构细微的变化，必须借助其他谱图综合考虑。因此，在一级结构分析中，通常将红外和气相色谱、核磁共振分析中得到的数据进行对照确认，例如对文蛤多糖的FT-IR分析，3406.43cm-1处吸收为-OH伸缩振动;1153.41cm-1、1079.83cm-1、1023.84cm-1处吸收是糖环C-O-C的特征骨架振动;在2926.06cm-1和1373.26cm-1的吸收是C-H的伸缩振动和变角振动;在929.21cm-1处有吸收，为D型吡喃环的伸缩振动;849.53cm-1处吸收，是α异头端基的特征吸收。由上述红外特征，可以初步推断文蛤多糖是主要由α-D-吡喃糖组成的多糖。不仅为进一步的精细结构鉴定奠定了基础，也为GC-MS和NMR的鉴定结果提供佐证[10]。

(2)核磁共振波谱法

核磁共振波谱法是解析物质结构最有效的手段，可以提供多糖的单糖组成、单糖残基间的顺序、单糖残基在糖苷键中的位置、环状结构的类型和糖苷键的构型等许多信息，成为分析动物多糖结构不可或缺的工具。

动物多糖的核磁共振波谱主要是1H、13C核磁共振波谱。多糖在1H-NMR谱图上大多集中在4.0-5.5PPm范围内，1H-NMR主要解决多糖结构中糖苷键构型问题,根据各峰的面积之比可求得多糖中不同糖苷键的相对含量或各种残基的比例。如：通常α型吡喃己糖C-1质子的δ值超过5.0×10-6，而β型则小于5.0×10-6[11]。而13C-NMR主要应用于多糖结构分析，如异头碳的构型问题、多糖残基中取代位置和分支点的确定、多糖中各残基种类和比例的确定等。13C NMR谱较1HNMR谱有更宽的化学位移范围(可达2.0×10-4)和更高的分辨率。通过异头碳信号数目可以确定糖残基数目，异头碳信号的位置可以确定该异头碳是α或β构型。例如在文蛤多糖的13C-NMR图谱中，存在4个异头碳信号，化学位移δ依次为99.59ppm、98.61ppm、95.74ppm和91.83ppm，又结合一维氢谱中有4个异头氢信号，推断文蛤多糖中存在4种糖残基，且都为吡喃型糖环，这与FT-IR和GC-MS结果相符[10]。糖链上如发生取代，取代位置的碳的化学位移将向低场移动，即出现“苷化位移”[11]。通过与已知单糖的碳的化学位移相对照，从而可确定糖链的连接位置。另外还可由谱图上的信号确定某些单糖的种类,如：δ170-176范围内的低场信号反映有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在，δ16-18范围内的高场信号表明有6-位脱氧糖的甲基存在;除此之外还可根据异头碳上α异构体比β异构体高场δ2-3确定异头碳的构型。如根据FT-IR和1HNMR提供的信息可以推断瓦布贝母内生真菌Fusarium redolens两个多糖主要为吡喃型，均含有α-糖苷构型异头氢，由半乳呋喃糖和甘露呋喃糖及少量的α-D-吡喃葡萄糖的酸性多糖组成[18]。

随着NMR技术的发展和高磁场核磁共振仪的出现，尤其是80年代发展起来的2D NMR技术，使得其在多糖结构的研究中得到广泛应用。在对文蛤多糖的结构解析中，核磁二维谱显示出强有力的精细结构剖析工具。首先通过一维谱可以明确异头氢和异头碳为呋喃型糖环，并存在四种异头碳残基A、B、C、D;进一步根据从1H-1HCOSY谱中已经识别的氢的化学位移，由HSQC谱找到结构中与氢相连碳的化学位移;再由HMBC谱并结合氢与碳化学位移归属表，发现各残基A、B、C、D内部或之间具有相关耦合关系，从而确定A与A之间通过1→4连接，A与C之间通过1→4,1→6连接，D与C之间通过1→4连接，B与C之间通过1→6连接。最后确定文蛤多糖可能的结构单元[10]。

(3)质谱法

由于糖类具有结构复杂、不均一性以及没有显色基团等特点，使得糖类在光谱、色谱分析上难度较大;另外，常规的结构分析技术如NMR需要制备出一定量的样品(mg数量级)，而质谱在鉴定多糖结构时仅需极少量的样品，能够满足更高的处理通量。目前，质谱及其联用技术已成为一种重要的多糖分析方法。它可以提供相对分子质量、多糖的单糖组成、糖苷键的连接方式以及分支状况等多种信息。近年发展了各种软电离技术，如场致电离、场解析电离、快速原子轰击法，尤其是电喷雾电离质谱和基质辅助激光解析质谱,都可以用于多糖结构解析[8]。

质谱法分析多糖中的单糖组成首先要对糖苷键进行甲醇解、酸解，使之形成完全游离的单糖或糖醛酸，进而对各单糖组成进行定量分析。传统上，利用GC-MS进行的单糖组成被称为糖分析的“金标准”，但是不论GC或者LC分析多糖的组成，均需要将水解后的单糖进行柱前衍生化，而毛细管电泳技术则无需对水解单糖进行衍生，而且进样量在纳升数量级，对于难以纯化的样品来说，无疑是非常有意义的[23]。

自然状态下多糖或糖肽是生物体翻译后修饰的结果，目前尚无完整的数据库，无法通过实验碎片数据检索已经建立的数据库。因此，目前对多糖的质谱分析方法依然是从头测序法(De novo)[24]。质谱法分析多糖的序列结构的基本策略是：首先将其酸解或酶解成相对分子质量较小的寡糖后在一定的条件下和中性气进行碰撞(CID)，令从还原末端开始裂解为糖残基碎片，分析相邻两碎片峰之间的质量差可获得糖残基排列顺序的信息。配合应用其他技术如衍生化处理、同位素标记方法，从而对多糖结构和序列进行测定[25]。然而，大部分多糖侧链多，体积庞大。因此根据实验碎片数据穷举可能的多糖结构、进而评价确定最合理的多糖结构是一项耗时耗力的工作[24]。也有学者提出一些新的从头测序法，如g Novo，它无需像传统的枚举算法那样，列举出所有可能的结构供评估打分，而在算法的每一步都将无效和冗余的结构排除，显著提高了候选化合物的枚举效率，避免了漏掉可能的结构，计算实验表明，g Novo能够对N-聚糖准确从头测序，并可对糖蛋白中释放的聚糖进行结构归属和谱学研究[26]。

基于二级质谱数据的多糖结构解析技术从早期的穷举法例如OSCAR，发展为启发式算法、到迄今比较成功的动态编程算法如GLYCH，目前能够实现对于直链型和二分枝型寡糖解析，准确度较满意。但对复杂的糖肽和多糖分子，仍需其他技术方能解决。另外，基于De novo策略的解析方法在多数情况不能给出唯一解析结果，需要进一步人工解析。目前，采用多质谱仪联用解析、多级质谱解析、以及现有解析方法联用可望成为质谱寡糖结构解析的发展方向[27]。

动物多糖的空间结构是决定大分子活性的重要因素。在准确测定一级结构的基础上，将特定的物理常数计算和现代分析方法联合，推断其高级结构，并利用动物多糖高级结构模型与生命细胞受体模型推断多糖的作用方式，可为多糖的改造和活性筛选提供理论基础。多糖高级结构的研究正在成为多糖研究的一大热点[28]。

5. 总结与展望

动物多糖结构复杂，不同提取工艺可能造成最终产品差别较大，超声波辅助提取等新技术的不断应用，为解决收率和目标产物选择性之间的矛盾提供了可能，是走向大规模生产的前提。多糖纯化过程中可能伴随着药效的散失和毒副作用的产生。因此，目前仍以常/低温温和条件下的物理分离技术为主流，尽量减少对大分子构象和活性的破坏。仪器分析在多糖一级结构研究中有快速、准确的特点，但经典的化学降解方法仍然不可或缺，尤其是异头碳和链结构的剖析。鉴于多糖构象和活性之间的紧密关系，X-射线衍射法、核磁共振法、圆二色谱法等方法已被运用测定多糖的高级结构研究;相信在化学、生物学、分析科学等科学工作者的不懈努力下，“糖组学”的研究必将呈现光明的前景，造福人类。

摘要：目的：评述动物源多糖在提取-纯化-鉴定过程中使用的主流技术方法及特点；方法：对最近文献中的动物多糖提取-纯化-鉴定方法进行对比、分析和总结；结果：超声波辅助提取等新技术为解决收率和目标分子选择性之间的矛盾提供了可能；多糖纯化技术仍以常/低温温和条件下的物理分离技术为主流；仪器分析在多糖一级结构研究中有快速、准确的特点，但经典的化学降解方法仍然不可或缺；结论：研究动物源多糖需要多种技术手段的综合运用。

关键词：动物多糖,糖胺聚糖,提取分离,结构测定

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