轮叶党参多糖提取及其含量测定

轮叶党参多糖提取及其含量测定（精选6篇）

篇1：轮叶党参多糖提取及其含量测定

轮叶党参多糖提取及其含量测定

采用正交试验方法,以多糖得率为评价指标,对轮叶党参中多糖的提取工艺进行筛选,以期优化轮叶党参多糖的.提取工艺.试验结果表明,当提取时间为4h,料水比为1:15,提取温度为70℃时,多糖得率最高为8.50%.此法的工艺经济、简单、稳定、可行.

作 者：鲍智娟 BAO Zhi-juan 作者单位：白城师范学院,生物系,吉林,白城,137000刊 名：延边大学学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF YANBIAN UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：35(4)分类号：Q539关键词：轮叶党参 多糖提取 含量测定

篇2：轮叶党参多糖提取及其含量测定

西归多糖的提取及含量测定研究

目的.:研究白族药西归中多糖的提取和含量测定方法.方法:采用单因素试验对多糖的提取条件进行选择,采用硫酸-苯酚法测定多糖的含量,显色后检测波长为492nm.结果:西归多糖的最佳提取条件为100℃,料液比为1:30,提取时间3h,提取次数3次.标准曲线方程Y=10.691X-0.0829,r=0.9991,葡萄糖含量在10～60μg/ml范围内线性关系良好.平均回收率为99.64%,RSD为0.83%(n=9).结论:最佳提取条件得率高,测定方法准确,为西归药材的质量控制提供了一个定量方法和参考依据.

作 者：许嘉强 孙进 李艳 高孟婷 梁英丽 杨永寿 Xu Jiaqiang Sun Jin Li Yan Gao Mengting Liang Yingli Yang Yongshou 作者单位：大理学院药学院,云南,大理,671000刊 名：大理学院学报英文刊名：JOURNAL OF DALI UNIVERSITY年，卷(期)：8(10)分类号：Q949.763.3关键词：西归 多糖 提取 分光光度法

篇3：米糠多糖的提取及其含量的测定

米糠, 又名半皮糠, 其重量约占整个米粒的5%—5.5%[1], 是一种产量大、综合利用价值还不高的农副产品。米糠多糖 (RiceBran Polysaccharide, RBP) 是一种以α-1, 6糖苷键为主要结构分子量不等的一类非淀粉多糖, 是结构复杂的杂聚糖[2,3], 具有抗肿瘤、免疫增强、抗细菌感染及降血糖等生物活性及作用[4,5]。文献关于米糠油、米糠蛋白及维生素等报道[6,7,8]较多, 对米糠多糖多限于其性能及生理活性的研究。本文研究了苯酚-硫酸法测定米糠多糖含量的方法, 以正交设计优化显色条件, 对继续开发、利用米糠资源提供了一定的参考价值。

1仪器与材料

1.1仪器

UV—2401型紫外分光光度计 (日本岛津) ;800型离心沉淀器 (4 000r/min, 上海手术器械厂) ;集热式恒温加热磁力搅拌器 (河南省巩义市英峪予华仪器厂) ;200B型高速药物粉碎机 (山东青州市精诚机械有限公司) 。

1.2材料

原料:水稻米糠。

试剂:葡萄糖标准品、α-淀粉酶、石油醚、碘酊正丁醇、三氯甲烷、苯酚、乙醚、丙酮、浓硫酸、碳酸氢钠等均为分析纯, 实验用水为蒸馏水。

2方法与结果

2.1多糖的提取

取干燥的米糠15g, 加入150mL石油醚, 在85℃下加热回流2次, 每次2.0h, 进行脱脂。滤渣挥去石油醚后即为脱脂米糠。在脱脂米糠中加入150mL蒸馏水, 加热回流2次, 时间分别为2.0h1.5h。合并滤液, 减压浓缩后, 加入0.02g淀粉酶加入浓缩液中, 在50℃水浴中反应90min, 去除淀粉, 离心, 取清液。加入3倍体积量的95%乙醇, 边加边搅拌, 迅速有灰白色沉淀出现, 静置, 离心分离沉淀, 取沉淀再重复溶解、沉淀、离心分离操作至乙醇液澄清无色为止。

沉淀以少量蒸馏水溶解, 以Sevag试剂 (氯仿/正丁醇=4/1) 去除杂蛋白, 取上清液重复操作3次。收集清液, 再加入三倍体积的95%乙醇进行醇析, 取沉淀用乙醚、丙酮反复洗涤, 干燥, 得产品为米糠粗多糖。

2.2含量测定

2.2.1葡萄糖储备液的制备

精密称取无水葡萄糖25mg, 用蒸馏水溶解并定容至100mL。

2.2.2样品溶液的制备

精密称取米糠粗多糖25mg, 用蒸馏水溶解并定容至100mL。

2.2.3最佳吸收波长的测定

取葡萄糖储备液4mL, 用蒸馏水稀释至10mL, 即为浓度为0.10mg/mL的标准溶液。样品溶液同样稀释得0.10mg粗多糖/mL的溶液。

分别取上述稀释溶液1mL, 置于10mL容量瓶中, 加入6%苯酚溶液1.0mL, 混匀, 冰浴条件下再加入7.0mL硫酸, 以蒸馏水补至刻度, 混匀后, 反应30min。以蒸馏水替代样品溶液如上配制空白对照液, 在 (600—300) nm范围内扫描, 结果见图1、图2。由两图确定最佳吸收波长为490nm。

2.2.4 显色条件的考察

表1为正交设计L9 (33) 优选最佳显色条件 (显色剂6%苯酚用量、浓硫酸用量和反应时间) 。见表2, 可知, 浓硫酸用量影响最大, 6%苯酚用量次之, 反应时间相对最小。最佳显色条件为6%苯酚用量为1.0 mL、浓硫酸用量为7.5 mL、反应时间为30 mL, 即A2B3C2。

2.2.5 标准曲线的绘制

分别吸取葡萄糖储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于10 mL容量瓶中, 根据确定最优的显色条件, 按照“2.2.3最佳吸收波长的测定”加入苯酚和硫酸及相应操作, 测定吸光值。以葡萄糖含量 (C, mg/mL) 为横坐标, 吸光度 (A) 为纵坐标, 作标准曲线。得标准曲线的回归曲线为:A=57.484C—0.001 09, R2=0.999 1 (n=7) , 在 (0.002 5—0.030) mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.2.6 稳定性试验

对同一样品经显色后, 每隔2 min测定吸光值, 连续1 h, RSD=1.21%。结果表面, 该显色反应至少在1 h内是稳定的。

2.2.7 精密度试验

取5份相同的米糠粗多糖溶液, 按上述实验确定的条件分析样品, 得RSD=1.90%, 可见该方法测定米糠多糖含量精密度良好。

2.2.8 重复性试验

对同一批样品重复取样6次, 按上述方法提取、分析, RSD=2.28%。

2.2.9 回收率试验

精密移取同一样品溶液1 mL, 6份。分别加入6份已知浓度的葡萄糖对照品溶液, 测定吸光值, 测定回收率。计算得平均回收率为97.82%, RSD=2.83%。

2.2.10 样品测定结果

连续测定5批米糠粗多糖样品, 平均含量为20.2%, RSD=1.23%。

3 结论

本文以正交设计优化显色条件, 确定了苯酚—硫酸法测定米糠多糖含量的最佳条件。米糠脱脂、水提、淀粉酶水解、醇沉等之后, 得到米糠粗多糖。其中, 米糠多糖的含量为20.2%, 方法简便, 结果准确, 为米糠多糖的研究奠定了良好的基础。

摘要：对米糠中的多糖进行提取与测定, 采用水提醇沉法对米糠中的多糖进行提取, 并采用苯酚—硫酸法测定其多糖含量, 以正交实验优化显色条件。确定检测波长为490nm, 确定6%苯酚用量为1.0mL, 浓硫酸用量7.5mL, 反应时间为30min。在 (0.0025—0.030) mg/mL范围内, 呈良好的线性关系。平均回收率为97.8%, RSD=3.89% (n=6) 。测得米糠粗多糖含量为20.2%。结果表明方法简单、准确, 为继续研究开发提供一定的参考依据。

关键词：米糠,多糖,苯酚—硫酸法,含量测定

参考文献

[1]童永鹏, 阎蒙刚.米糠的综合利用.化学教育, 2006; (1) :4—5

[2]易翠平, 王立, 姚惠源.米糠多糖研究进展.粮食与油脂, 2003; (2) :20—22

[3]汪艳, 吴曙光, 周杰, 等.米糠多糖的提取纯化及其成分结构和活性分析.生命科学研究, 2003;4 (3) :273—277

[4]姜元荣.米糠免疫活性多糖的研究.无锡:江南大学博士学位论文, 2004;13—75

[5]陈明, 汪善锋.米糠多糖的提取工艺及其生物活性的研究进展.食品研究与开发, 2007;28 (6) :173—175

[6]Gopala A G Krishna, Hemakumar K H, Sakina khatoon.Sturdy on the Composition of Rice Bran Oil and Its Higher Free Fatty Acids Val-ue.J Am Oil Chem Soc, 2006;83 (2) :117—120

[7]Hanmoungjai P, Pyle D L, Niranjan K.Enzymatic Process for Ex-tracting Oil and Protein from Rice Bran.J Am Oil Chem Soc, 2001;78 (8) :817—821

篇4：轮叶党参多糖提取及其含量测定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器:

Agilent 1200型高效液相色谱仪器(系统包括Agilent G1200型四元泵,1200型真空在线脱气机器,1200型自动进样器),色谱柱为Agilent Eclipse C18(150mm×4.6mm,5.0μm),梅特勒电子分析天平(美国梅特勒生产,精密度为0.0001g),KQ-251TTB型高频数控超声波清洗器(购于昆山超声仪器责任有限公司),HH-D恒温水浴锅(苏州威尔实验用品有限责任公司生产),DGF24-IA电热鼓风干燥箱(南京实验仪器制造厂)。

1.1.2 实验试剂:

党参多糖对照品、党参炔苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号分别为111402-201204,20120326),乙腈为色谱纯(北京科技化工有限公司生产,批号:20121426)、甲醇为色谱纯(北京科技化工有限公司生产,批号:20122618)、水为三蒸水、中药党参为本地中药房提供,所有药材均经过相关专家鉴定为真品。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的选择:

色谱柱采用Agilent Eclipse C18(150mm×4.6mm,5.0μm),流动相为乙腈∶水=32∶68,流速为1.0ml/min,柱温为25℃,检测波长为273nm,进样量为20μl。以党参炔苷理论塔板数作为参考,色谱柱的理论塔板数>5000。在上述色谱条件下党参多糖与党参炔苷与其他组分均可以达到基线分离。

1.2.2 对照品溶液的配制:

分别精密称取党参多糖、党参炔苷对照品5.0mg,分别置于20ml容量瓶中,加入甲醇溶液定溶至刻度后摇匀,放置得到0.25mg/ml的对照品储备液。采用微量加样枪精密吸取党参多糖、党参炔苷对照品储备液200μl置于2ml容量瓶中,甲醇溶液定溶至刻度后摇匀,分别得到0.025mg/ml的对照品溶液,置于-20℃冰箱中储存备用。

1.2.3 供试品溶液的配制:

取中药党参对照药材适量,置于微型粉碎机器中粉碎后过40目筛,粉末放置于45℃恒温干燥箱中放置干燥6h后置于量瓶中,加入甲醇溶液20ml后超声35min,滤过后量瓶中残渣再次加入甲醇溶液15ml,置于超声仪器中超声30min,滤过,残渣加入甲醇溶液12ml后继续超声15min,滤过,合并3次过滤液,滤液置于水浴锅上加热将多余甲醇溶液挥去干燥后,残渣加入甲醇溶液适量进行溶解,置于5ml容量瓶中定溶至刻度,摇匀后过0.22μm微孔滤膜,收集放置于-20℃冰箱中备用。

1.2.4 线性关系考察:

分别吸取党参多糖、党参炔苷对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0ml置于5ml容量瓶中,甲醇溶液定溶至刻度后,分别吸取20μl,按照2.1项下的色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标,对照品浓度作为横坐标绘制标准曲线,得到回归方程。

1.2.5 精密度和稳定性考察:

精密吸取供试品溶液20μl按照2.1项下的色谱条件连续重复进样5次,按照2.4项下的线性关系方程测得党参多糖和党参炔苷的峰面积,计算RSD值。

1.2.6重复性考察:精密称取中药党参药材5份,每份1.0g,按照2.3项下的供试品溶液的配制方法得到样品溶液,分别吸取20μl,按照2.1项下的色谱条件进行测定党参多糖和党参炔苷的RSD值。

1.2.7 回收率实验:

采用加样回收方法,取已经含量的2.3项下的供试品5份,分别精密加入党参多糖、党参炔苷对照品溶液适量,按照2.1项下的色谱条件进行含量的测定,计算回收率并计算平均加样回收率。

2 结果

党参多糖的线性回归方程为:Y=10.624X+0.0314(r=0.9997),在50~600μg范围内线性关系良好;党参炔苷的线性回归方程为:Y=306.251+10.268(r=0.9998),在50~500μg范围内线性关系良好。精密度和稳定性考察:党参多糖和党参炔苷的RSD值分别为0.15%、0.26%,表明色谱条件的精密度良好,稳定性强。重复性考察:党参多糖和党参炔苷的RSD值分别为1.32%、1.64%,表明该方法的重复性较好。党参多糖和党参炔苷的平均加样回收率分别为99.65%、99.17%,见表1、表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择分别取党参多糖和党参炔苷对照品溶液,以中药党参供试品溶液作为阴性对照溶液,经显示后在200~350nm范围内进行紫外扫描[6,7,8],结果党参多糖和党参炔苷对照品溶液和供试品溶液在273nm处均有明显的吸收光谱,因此试验中选择273nm波长作为测定波长。

3.2 色谱流动相溶剂的选择本实验在实验前采用甲醇∶水,乙腈∶水不同分配系数作为流动相分别对党参多糖对照品溶液、党参炔苷对照品溶液进行色谱峰的分离[9,10],结果表明在采用乙腈∶水=32∶68时色谱峰的分离度良好,因此实验中采用乙腈∶水=32∶68作为流动相。

摘要：目的 分析高效液相色谱法(HPLC法)测定中药党参中党参多糖及党参炔苷的含量。方法 采用HPLC色谱法,色谱柱采用Agilent Eclipse C18(150mm×4.6mm,5.0μm),流动相为乙腈∶水=32∶68,流速为1.0ml/min,柱温为25℃,检测波长为273nm。结果 党参多糖的线性回归方程为:Y=10.624X+0.0314(r=0.9997),在50~600μg范围内线性关系良好,平均加样回收率为99.65%;党参炔苷的线性回归方程为:Y=306.251+10.268(r=0.9998),在50~500μg范围内线性关系良好,平均加样回收率为99.17%。结论 HPLC法测定党参中党参多糖和党参炔苷的含量,方法操作简单、稳定性好、精密度高,重现性好,可以作为党参的质量控制方法。

关键词：高效液相色谱法,党参,党参多糖,党参炔苷,质量控制

参考文献

[1]黄健,车晓平,陈志峰,等.不同产地党参中党参炔苷的含量测定[J].北京中医药,2011,30(6):467-469.

[2]邹元锋,曹朝生,刘江,等.党参质量评价研究进展[J].中草药,2010,41(3):附3-6.

[3]杨静,苏强,刘恩荔,等.党参多糖滴丸中党参多糖的含量测定[J].中国药物与临床,2010,10(5):515-517.

[4]陈前锋,邓小艳,祝慧凤.HPLC法测定不同产地党参中党参炔苷和丁香苷的含量[J].食品工业科技,2016(6):64-67.

[5]宋英,周小初,宋崎,等.党参多糖的含量测定方法研究[J].中国药业,2012,17(23):9-11.

[6]窦武宇,崔治家,侯嘉,等.甘肃不同产地党参药材总皂苷含量测定[J].中兽医医药杂志,2015,1(6):59-62.

[7]秦卫红,王响群,秦迎春.HPLC法同时测定中药多种有效成分含量的应用[J].中国医药指南,2013,11(5):439-440.

[8]关琳静.不同来源党参成分含量测定及党参HPLC特征图谱研究[D].太原:山西医科大学,2015.

[9]吴银华.蒙药材党参含量测底研究进展[J].北方药学,2012,9(2):28-30.

篇5：乌头多糖的提取分离与含量测定

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-3010型紫外可见分光光度计(日本日立);FA1104型电子天平(上海天平仪器厂);仪表恒温水浴锅(黄骅市综合电器厂);Zk-92A真空干燥箱(上海实验仪器厂)。

1.2 试剂

蒸馏水、95%乙醇、蒽酮、浓硫酸等试剂均为分析纯;无水葡萄糖标准品由中国药品生物制品检定所提供,批号:0833-9501,乌头购于山东建联药店,经山东中医药大学中药鉴定教研室鉴定为毛茛科植物乌头的块根。

2 方法与结果

2.1 多糖的提取分离

称取干燥的圆锥乌头粉末5 g,共9份,加入一定量的95%乙醇超声提取一定时间后,离心,弃上清液,留药渣,自然挥干至无醇味。按照L9(34)正交设计试验表对提取次数、溶剂用量、浸渍温度、提取时间4因素进行考察。由方差分析优选最佳提取工艺,结果最佳提取工艺为:提取次数为3次,溶剂用量为20倍量,浸渍温度为45℃,提取时间为40 min。

2.2 乌头多糖含量测定方法学研究

2.2.1 葡萄糖对照品溶液的制备

精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品16.83 mg置于25 ml容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度,配成0.673 mg/ml的储备液。精密吸取0.673 mg/ml葡萄糖对照品溶液3 ml定容至25 ml容量瓶中,得葡萄糖对照品溶液0.080 8 mg/ml。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称定多糖0.151 0 g于25 m容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度,得6.04 mg/ml的多糖溶液。

2.2.3 蒽酮-硫酸试液的制备

精密称量0.2 g蒽酮,将其溶解到5 ml乙醇中,再于100 ml容量瓶中以75%硫酸定容,现配现用。

2.3 最大吸收波长的选择

精密吸取0.080 8 mg/ml的葡萄糖对照品溶液2 ml和6.04 mg/ml的多糖溶液2 ml于试管中,冷水浴5 min,加入蒽酮-硫酸试液8 ml摇匀,立即置沸水浴加热10 min,立即置冷水中冷却至室温40 min,以2 ml蒸馏水代替葡萄糖溶液如上法配制空白,用紫外可见分光光度计在500～750 nm内进行波长扫描。结果表明,在波长为(490±1)nm处溶液有最大吸收,故选择(490±1)nm作为检测波长。

2.4 标准曲线的制备

用0.080 8 mg/ml的葡萄糖对照品溶液中分别配制0.020 2、0.040 4、0.060 6、0.080 8、0.101 0 mg/ml 5个不同浓度的对照品系列溶液。分别精密吸取2 ml置具塞试管中,冷水浴5 min,加入蒽酮-硫酸试液8 ml摇匀,立即置沸水浴加热10 min,取出用冷水冷却至室温,室温放置40 min,以2 ml蒸馏水代替葡萄糖溶液如上法配制空白,于625 nm处测定吸光度。以吸光度(Y)对葡萄糖浓度(mg/ml)(X)进行线性,得回归方程为Y=6.445 5X+0.016 6(r=0.999 8),表明在0.020 2～0.101 0 mg/ml范围内葡萄糖含量与吸光度呈良好的线性关系。见图1。

2.5 精密度试验

精密吸取2 ml供试品溶液,共6份,按“标准曲线的制备”项下操作,分别测定吸收度。结果显示,RSD=0.22%(n=6),表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取2 ml样品溶液,按“标准曲线的制备”项下操作,置阴暗处室温条件下放置,分别于0、30、60、90、120、150 min测定吸光度,以此考察其稳定性。结果显示,RSD=0.17%(n=6),表明样品溶液在150 min内显色稳定,可进行测定。

2.7 重现性试验

精密称取同批样品粉末1 g,共6份,按“多糖的提取分离”项下操作制备多糖,按“供试品溶液的制备”项下操作制备供试品溶液,按“标准曲线的制备”项下操作,分别测定吸光度。结果显示,RSD=0.23%(n=6),表明此测定方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定多糖样品50 mg,共6份,分别加入葡萄糖对照品0.7 mg,按“供试品溶液的制备”和“标准曲线的制备”项下操作,测定各试验液中多糖的量,并计算回收率。结果显示,样品回收率RSD=1.97%(n=6),表明该方法准确度高。见表1。

2.9 含量测定

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液2.5 ml于25 ml容量瓶中,定容至刻度,分别吸取2 ml至具塞试管中,按“标准曲线的制备”项下操作,测定吸光度,平行测定3次,计算平均值,按标准曲线方程计算药材中多糖含量。实验结果表明,药材中的多糖以葡萄糖为标准含量,含量为15.82%。见表2。

3 讨论

3.1 多糖的含量测定

植物多糖组成复杂,获得相应多糖对照品也比较困难,在多糖含量测定时,往往采用单糖如葡萄糖代替对照品,以测定样品多糖的相对含量。本法的原理为糖类在强酸作用下脱水生成糖醛及其衍生物,与蒽酮缩合生成有色物质,其生成量可用于其定量研究。

3.2 多糖测定的准确度

蒽酮-硫酸比色法测定乌头多糖时,采用冰水浴中加入硫酸-蒽酮溶液,可提高乌头多糖测定的准确度。

3.3 蒽酮-硫酸法测定乌头多糖含量的优点

在最佳操作条件下,利用蒽酮-硫酸法测定乌头多糖含量的精密度试验RSD为0.22%,平均回收率为100.60%,RSD为1.97%,测得样品中乌头多糖含量为15.82%,提示本法简单、显色稳定、灵敏度高、重现性好。

摘要：目的:从中药乌头(Aconitum Paniculigerum Nakai)中提取多糖并对其进行含量测定。方法:乙醇超声提取得到多糖,采用蒽酮-硫酸比色法、紫外可见分光光度法对其进行含量测定,检测波长为(490±1)nm。结果:乌头多糖在0.020 2～0.101 0 mg/ml范围内有良好的线性关系,r=0.999 7,平均回收率为100.60%,RSD=1.97%。药材中多糖以葡萄糖为标准含量,含量为15.82%。结论:该方法准确快速、重现性好。

关键词：乌头,多糖,提取,蒽酮-硫酸法

参考文献

[1]肖培根.中药志[M].北京:人民卫生出版社,1979:128.

[2]王庭欣,王庭祥,庞佳宏.植物多糖生物活性研究进展[J].食品研究与开发,2005,26(2):200-202.

[3]张宪党,马驰,张群,等.植物多糖抗辐射损伤作用研究进展[J].中国辐射卫生,2003,12(2):122-123.

篇6：轮叶党参多糖提取及其含量测定

1 仪器与试药

1.1 仪器

日立U-3010型紫外可见双光束扫描分光光度计, RE-52C型旋转蒸发仪 (巩义市予华仪器有限责任公司) , SHZ-D型循环水式真空泵 (巩义市英峪予华仪器厂) , Saritorius CP225D型电子天平;FW-80高速万能粉碎机 (北京市永光明医疗器械仪器厂) 。

1.2 试药

白茅根药材 (批号:20070601) 产于河北省, 购买于大连同仁堂药店, 经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为Rhizoma Imperatae;葡萄糖 (天津市科密欧化学试剂有限公司) 为分析纯, 乙醇、浓硫酸、苯酚均为分析纯 (天津市凯信化学工业有限公司) 。

2 方法

2.1 白茅根多糖提取工艺的优化

2.1.1 正交试验提取白茅根多糖

将白茅根药材粉碎过10目筛, 准确称取白茅根粉末500g, 加入8倍量95%乙醇回流脱脂2次, 每次2h。将乙醇提取后的药渣挥干至无醇味, 称重, 将药渣平均分成10等份, 即每份相当于50g白茅根药材生药量。取其中9份, 加适量的水提取, 抽滤, 滤液冷却后浓缩至约100m L。向浓缩后的滤液加入适量的乙醇, 使乙醇的最终体积分数为80%, 4℃静置24h。醇沉的沉淀用布氏漏斗抽滤, 40℃减压干燥至恒重, 得白茅根粗多糖。经预实验, 最终确定提取温度 (A) , 提取时间 (B) , 提取次数 (C) , 料液比 (D) 4个因素为最终因素进行考察, 每个因素3水平, 选用L9 (34) 正交试验设计方案, 以白茅根多糖百分含量为考察指标, 确定最佳提取条件。因素水平见表1。

2.1.2 醇沉浓度的考察

取4份白茅根样品50g, 分别用8倍量乙醇脱脂2次, 每次2h, 药渣挥干至无醇味, 分别加入10倍量的水, 在100℃水浴中提取2次, 每次2.5h, 抽滤, 浓缩。浓缩液分别用70%、75%、80%、85%乙醇醇沉, 于4℃静置24h。

2.2 白茅根多糖的含量测定及方法学考察

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称定105℃干燥至恒重的葡萄糖0.10212mg, 置于100m L容量瓶中, 加蒸馏水溶解并定容至刻度, 再从中吸取10m L置于100m L容量瓶中, 加蒸馏水使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得。

2.2.2 最大吸收波长的选择

采用苯酚—硫酸比色法, 精密吸取0.5m L对照品溶液, 加蒸馏水至1m L, 加入5℅苯酚溶液1m L, 迅速贴壁加入浓硫酸5m L, 摇匀, 静置30min。同法得空白溶液。在紫外分光光度计200~600nm波长范围内测定吸光度。结果表明, 最大吸收波长为488nm。

2.2.3 标准曲线的制作

精密吸取对照品试液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8m L于15m L试管中, 另以水作为空白, 分别加入现配置的5%苯酚溶液1m L后, 再迅速贴试管壁加入5m L浓硫酸, 摇匀, 静置30min, 测定吸光度。以葡萄糖对照品浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标, 根据葡萄糖溶液吸光度的实际计算值绘制标准曲线, 并建立标准曲线的回归方程。

2.2.4 精密度试验

取同一对照品溶液, 分别测定6次, 计算的吸光度值相对标准偏差为0.40%。

2.2.5 重复性试验

取同一样品, 平行处理6份, 测定吸光值, 计算得样品含量的相对标准偏差为0.52%。

2.2.6 稳定性试验

取同一样品溶液, 每隔0.5h测定一次吸光值, 共测6次, 相对标准偏差为0.77%, 表明样品在3h内具有良好的稳定性。

2.2.7 回收率试验

采用加样回收法, 精密称取6份已知多糖含量的样品10mg, 置于100m L容量瓶中, 加入已知浓度葡萄糖对照品溶液20m L, 用蒸馏水定容。分别从6份样品中量取1m L置于15m L刻度试管中, 按上述标准曲线项下苯酚—硫酸法分别测定吸光度, 根据葡萄糖的检出量计算回收率。

2.2.8 白茅根多糖含量测定

准确称量白茅根粉末80g, 用乙醇脱脂, 回流提取2次, 每次2h, 药渣自然挥干至无醇味。根据正交试验及醇沉浓度考察, 以最佳提取条件对醇提后的白茅根进行提取, 经醇沉、减压干燥, 得白茅根粗多糖。精密称取白茅根粗多糖10mg, 置于100m L容量瓶中, 加蒸馏水溶解并稀释至刻度即得供试品溶液。取溶液1m L置于15m L刻度试管中, 按上述苯酚—硫酸比色法操作, 测定吸光度, 并计算白茅根总多糖的含量。

3 结果

3.1 各因素对提取白茅根多糖的影响

经过水提、过滤, 滤液进行浓缩 (60℃以下) 后醇沉, 醇析, 离心并减压干燥至恒重, 得棕黄色粗多糖。取粗多糖质量分数为指标得正交试验结果见表2, 方差分析结果见表3, 醇沉时最佳乙醇体积分数见图1。

注:F0.05 (2, 2) =19.0。

由表2、表3可知, A因素对提取工艺有显著性影响 (P<0.05) , 且影响多糖得率的因素主次顺序为A>C>B>D, 各因素的最佳水平依次为A3B3C3D2, 即最佳工艺条件为:100℃, 10倍量的水, 提取3次, 每次2.5h;醇沉时, 乙醇体积分数达到80%时多糖的质量分数最高。

3.2 葡萄糖标准曲线

葡萄糖在20~80μg·m L-1之间与吸光值A488有良好的线性关系。计算出的回归直线方程为:Y=8.463X-0.017, r=0.999。

3.3 加样回收试验

计算结果见表4。

3.4 白茅根多糖的含量

结果见表5。

粗多糖净含量 (g) =C×N×G/M

C为由回归直线方程求得的浓度 (mg/m L) ;N为稀释倍数;G为减压干燥所得粗多糖的质量;M为从干燥后所得粗多糖中称取的质量。

4 讨论

(1) 多糖是一类天然大分子化合物, 由10个以上至上千个单糖脱水而形成的天然高分子聚合物, 是构成生命的分子基础之一。多糖易溶于水, 不溶于乙醇等有机溶剂, 最常见的提取方法是水提醇沉, 沉淀干燥后即为粗多糖。大量的药理及临床研究表明, 多糖具有抗癌、增强免疫力等功效[4], 对于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病都具有巨大的潜力。因此多糖的研究成为了关注的焦点, 促进了多糖研究的进展。

(2) 提取条件的优选。本实验采取4因素3水平正交试验方案, 对白茅根多糖的提取条件进行了优化。由正交试验的直观分析及方差分析结果可知, 在该多糖提取中温度是最主要的影响因素, 具有显著性差异, 其次为提取次数、提取时间、料液比, 影响均不显著。因此, 在提取白茅根多糖时应注意控制提取温度。本实验同时又考察了醇沉浓度, 结果表明多糖在80%乙醇中的溶解度最小。该工艺条件简单, 稳定可行, 为有效开发利用白茅根多糖奠定了基础。

(3) 含量测定。采用苯酚—硫酸法测定白茅根多糖的含量, 通过95%乙醇脱脂去除单糖、低聚糖等醇溶性成分, 再以80%乙醇醇沉分离多糖成分。通过稳定性实验和加样回收率实验可知, 本法所测定白茅根多糖的含量, 简单可靠, 重复性好, 显色稳定。实验结果表明白茅根中多糖的含量为0.807%。

综上所述, 白茅根多糖尚待进一步研究, 通过基础的最佳提取方法确定和含量测定, 为进一步研究多糖的纯化方法及药理活性奠定基础。

参考文献

[1]黄泰康.现代本草纲目[M].北京:中国医药科技出版社, 2001:828-829.

[2]吕世静, 黄槐莲, 袁汉尧, 等.白茅根多糖对人T淋巴细胞免疫调节效应的研究[J].中国新药杂志, 2004, 13 (9) :834-835.

[3]吕世辞, 黄槐莲.白茅根对IL-2和T细胞亚群变化的调节作用[J].中国中药杂志, 1996, 21 (8) :488-489.