生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展（通用7篇）

篇1：生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

本文对两种生化指纹图谱技术在作物品种鉴定中的应用及研究做了综述,并对它们的优缺点和应用前景做了探讨.

作 者：张凤 ZHANG Feng  作者单位：莱芜职业技术学院,271100 刊 名：种子世界 英文刊名：SEED WORLD 年，卷(期)：2009 “”(10) 分类号：S4 关键词：生化指纹图谱   品种鉴定   种子纯度  

篇2：指纹图谱技术在茶叶研究中的应用

1 指纹图谱技术的简介

1.1 色谱指纹图谱

色谱指纹图谱在茶叶品质中的检测原理是以品种之间的相似性进行检测,而不是以个体的独特性为特征进行检测。色谱指纹图谱技术在茶叶分析中,利用某一种茶叶的特性与待检测的茶叶进行各种匹配,匹配的是相似性而不是其完整性。色谱指纹图谱的检测是一种模糊匹配而不是精确分析。在这种技术检测中,需要全面完整地匹配样品茶叶与待检测茶叶的各方面品质,然后根据这些检测结果的分析得出待检测茶叶的品种和品质等。色谱指纹图谱技术是一种模糊匹配,而不是非常精准的分析与计算。色谱指纹图谱技术主要分为四大类,一种是液相色谱,一种是气象色谱,一种是薄层色谱,一种是毛细管的色谱。液相色谱的特点是适用性较广,检测速度很快,灵敏度很高,流动相可供选择范围较为广泛,分离性能好等。但是液相色谱的缺点是遇到较为复杂的色谱实验条件比较苛刻,使得实验的重现性难度比较大。薄层色谱的特点是可在一个同板分析很多个样本,且检测灵活,可适应多种成分的分离,有很多的色彩图像,直观性很强。同时还辅之以功能团显色剂来检测更多的成分。薄层色谱的缺点是对环境要求较高,对温度还有湿度要求高。气相色谱的特点是分离效能高、分析速度快,适用于一些植物挥发油成分并且可转化为可挥发的成分测定。毛细管电泳特点也是分析速度快、高分辨率和分离效能高等。

1.2 光谱指纹图谱

光谱指纹图谱的原理是利用不同的生物有机官能团在红外光谱中有各自特征的吸收峰,低波数的有机官能团能发出高度特征的指纹区这样的特征来判定物体的物理结构从而推断出其特征。简而言之,就是不同的物体会有不同的物理结构,通过其释放出来的波段长短度来检测其吸收峰的强弱,根据吸收峰的不同判定物质的成分和含量。其作用机理是,通过光谱指纹图谱技术分析,根据不同的红外光谱图谱的分析和解释,可以发现待检测茶叶样品中的官能团,通过对这些官能团的分析与检测,最终可以分析和得出不同的样品的化学和物理结构。由此可见,红外光谱是表征物质化学组成,研究其在分子层次上的结构及分子间相互作用的有力手段。光谱指纹图谱的特征是鉴别能力强,图谱的信息含量也大,定量分析需要与化学成分相结合。简便快捷,对茶叶等物品只需要做简单的压片处理而无需进行大规模的分离,检测的仪器也比较普遍,操作比较简单。可见,光谱指纹图谱技术方便快捷,效果显著。因此,光谱指纹图谱技术广泛应用于中药等药材品质的检测中。

1.3 波普指纹图谱

波普的一般概念都被大家普遍理解为电磁波,电磁波是一种磁场的运动形态,其以光速运行。根据电磁波的波长的长短可以划分多个区域。其作用机理是,当用电磁波照射那些物体时,分子便会吸收与分子级差差不多的电磁波,从而引起分子的共振、转动或者运动能级跃迁。波普的分析方法大概有四种,一种是紫外光谱,一种是红外光谱,一种是核磁共振谱,一种是质谱。红外光谱有其自己的特征,它利用自己的红外来判定物体的结构,可用于定量分析。它是判断两个化合物是否相同的一种波普图谱技术。核磁共振谱是由核磁共振产生的。核磁共振现象是由原子核自旋能级跃迁产生的。由于核自旋能级的能差很小,因此它吸收电磁波的频率在无线电波的范围内。核磁共振比红外光谱更准确地判断化合物的类别。紫外线可见光谱又称之为电子光谱,它涉及分子中电子从一个分子轨道向另一个更高级的分子轨道的跃迁。紫外光谱主要应用于有共轭体系的化合物。质谱,就是质量的图谱,或者说是有质量的排列。质谱法的特征是其灵敏度超过其他波普指纹图谱技术,这是一种可以确定分子式的物理方法,分析速度极快,几秒甚至更短时间就可以完成一次分析。由此可见,波普指纹图谱技术有很明显的特征和实验重现性,灵敏度高,信息直观,操作性强。

1.4 生物指纹图谱

生物指纹图谱技术是一种利用基因学形成的技术。它的基本原理是利用DNA技术研究茶叶基因的特征从而发现茶叶的基因规律。这种通过研究茶基因特征,根据其作用于特定生物细胞后传达出一定的规律和其反应套件。这个生物指纹图案在一定水平上表现了茶叶的细胞与一定生物反应之后出现的特征。生物指纹图谱解决了化学成分与茶叶细胞的相关性,是生物指纹图谱的更为高级的一种形式,也是研究生物图谱的更高一层的阶段。生物指纹图谱的特点主要是利用不同的基因拥有不同的生物,这样也在一定程度上体现了生物的多样性。在农业上利用生物指纹图谱划分不同的物种,也是因为生物DNA的不同,这才能产生不同的生物品种,从而鉴定不同的生物品质。

2 指纹图谱技术在茶叶中的应用

现阶段,指纹图谱技术已经广泛应用了。很多的药物和植物的相关质量控制都已经采用指纹图谱技术。美国的食品监管局强制规定食品必须要经过指纹图谱技术的认定与监督。世界卫生组织也规定,食品的质量监管必须经过指纹图谱技术的检测,以完成相关的品质检测。

2.1 色谱指纹图谱技术在茶叶研究中的应用

色谱指纹图谱技术已经有很长的历史,在二十世纪六十年代开始,色谱指纹图谱技术开始应用于茶叶的品质分析。宋冠群(2003)发现色谱指纹图谱技术可以分析十几种中国的茶叶,对于这些茶叶的分析,已经形成了一定的图谱数据。有学者在二十一世纪初用色谱指纹进行聚类分析,进而检测了茶叶的品质。王丽鸳(2008)根据色谱指纹图谱技术,发现不同的产地生产出来的茶的品质和口感非常不一致。因此,她建议不同产地不同品种的茶叶应当根据不同的口感和品质来划分。进一步地,有学者发现不同的茶叶经过色谱指纹图谱技术的分析,其品种的差别与归类的准确可达到90%。

2.2 光谱指纹技术在茶叶研究中的应用

光谱指纹技术也是历史悠久。日本在二十世纪末开始使用光谱指纹技术分析多种茶叶的组成成分。有学者在二十世纪应用过光谱指纹技术分析过黑茶的成分从而辨别出黑茶的品质。SCHUL(1999)发现利用光谱指纹技术分析出绿茶的品质,从而建立可以用来测量茶多酚等的模型。我国引入光谱指纹技术比较晚,在二十世纪的八十年代才开始应用光谱指纹技术检测茶的品质。在这一技术引进后,大批学者用来检测茶叶的质量和种类,有学者通过检测不同的红茶绿茶黑茶等发现光谱指纹技术相当的准确且快捷。在二十世纪末和二十一世纪初,光谱指纹技术广泛应用于茶叶的品质检测中,也通过核共振等技术发现不同茶叶的原产地的区别。

3 指纹图谱技术在茶叶质量检测中的未来发展前景

不言而喻,随着茶叶市场的拓展和进一步开发,茶叶的品质和质量会更加受到人们的关注。因为人们生活质量的提高,我国经济的进一步发展,人们对生活品质的要求也随之提高。品茶成为生活的一部分,一方面可以提高自身的品味,陶冶自身的情操,另一方面还可以满足人们对交际需求,因此茶叶的市场会更加的宽广。指纹图谱技术作为一种非常科学的分析技术,有利于对茶叶品质的鉴定,更加有利于对新产品的开发。利用化学和生物科技,指纹图谱技术的利用范围将变得更广,除了检测茶叶的品质,发现茶叶的原产地,还能将茶叶的种类分析得更加细致且有条理。进一步地,根据相关的数据可以建立相关的茶叶种类信息库,针对客户的需求,寻找与其需求相对应的品种。因此,指纹图谱技术不仅可以满足客户的需求,同时还能将茶叶市场进一步地划分,让更多的茶叶品种占领不一样的市场。同时还可以利用生物指纹图谱去开发新的品种,让我们的茶叶市场更加的丰富,满足更多的客户需求。由此可见,指纹图谱技术在茶叶质量检测中的未来一片光明,我们应该进一步地去分析和了解指纹图谱技术。

4 结语

综上所述,茶叶已经成为现代人所必须的一种饮品,其味甘甜醇厚,延绵悠长,深得很多人的喜爱。不同的茶叶来自不同的产地,其气味色泽都明显不一样。而茶的品质和这些气味色泽等息息相关,不同的茶叶品质呈现的茶物质组成部分均不同。不言而喻,茶叶质量的高低好坏影响着茶的口感和市场。因此,技术性地辨别茶叶质量的高低,是大多数商家所做的必要功课。在如今的茶叶质量检测中,指纹图谱技术被广泛使用。本文介绍了指纹图谱技术的内涵以及其作用方式,其次,本文指出了指纹图谱技术在茶叶中的应用,最后根据分析,本文阐述了这一技术的发展前景。将指纹图谱技术广泛应用于茶叶质量控制中,以保证茶叶的品质。

参考文献

[1]郝志龙,金心怡江丽萍等.化学指纹图谱在茶叶品质鉴定与控制上的应用[J].亚热带农业研究.2009(1):60-63.

[2]何晓叶,李建科赵伟等.化学指纹图谱技术在茶叶质量控制上的应用[J].食品科学技术学报.2015(1):49-54.

[3]宁井铭,张正竹方世辉等.指纹图谱技术及其在茶叶品质控制中的应用[J].中国茶叶加工.2009(3):39-41.

篇3：生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

【关键词】生化指纹图谱；品种鉴定；种子纯度

指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱，此电泳图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和环境稳定性，像人的指纹一样，因而被称为“指纹图谱”。它是鉴别品种、品系的有力工具，指纹图谱技术具有可靠方便、准确快速、不受环境影响等特点，反映了个体间的内在差异，因而极其适合于品种的鉴定工作。

目前在品种鉴定中应用较多的指纹图谱主要有两种：一类是较早开始研究的生化指纹图谱，包括同工酶电泳指纹图谱和蛋白电泳指纹图谱。另一类是九十年代之后发展起来的DNA指纹图谱，目前用于作物品种鉴定的主要有四种：RFLP、RAPD、SSR、AFLP。本文就两种生化指纹图谱技术的研究和应用进行综述，以期为农业生产服务。

1.同工酶电泳指纹图谱

同工酶差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因和非等位基因的差异造成，同工酶谱是基因表达后分子水平的表型，通过其谱带的分析能快速简便的识别出编码这些谱带的基因位点和等位基因。由于几乎25％的基因位点具有多态性,一般不同同工酶酶谱的差异表现为同一基因位点上的等位基因的差异，在分离群体中能区分所有可能的基因型，因而可用作指纹图谱。

从1959年Market和Moller首次提出同工酶的概念以来，同工酶研究得到了迅猛发展。70年代初期，同工酶电泳技术就应用于种子纯度鉴定。1973年，Singh利用酯酶同工酶、亮氨酸氨肽酶及磷酸酶同工酶的淀粉凝胶电泳，对10个燕麦品种进行鉴定，结果表明，每个品种都具有其特有的酶带，证明了利用同工酶电泳鉴定种子纯度的可靠性。1976年，Woods对抱球甘蓝进行了同工酶的淀粉凝胶电泳鉴定。

80年代以后，电泳方法不断改进，分析技术越来越精确，逐渐采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。Nielsen（1986）综合分析了1979-1986年间不同同工酶和不同电泳方法在大麦品种纯度上的鉴定后，认为聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最具有潜力的品种纯度鉴定方法。利用这一技术，Freeman（1991）对早熟禾种子纯度进行了鉴定，并制作了一系列早熟禾品种的酯酶同工酶酶谱，以便于对照比较。国内，最早将这项技术应用于种子纯度鉴定的陆士伟[1]利用酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了杂交水稻种子的纯度。颜启传[2]利用这一技术检测了杂交水稻及其三系种子的真实性和品种纯度，研究证明此方法具有灵敏度高、准确、经济、易于操作等优点。张春庆[3]利用过氧化物同工酶电泳鉴定了玉米自交系及其杂交种的纯度，取得较好的效果。

90年代以后，同工酶电泳技术广泛应用于作物品种纯度鉴定上，许多工作者在水稻、玉米、大白菜等作物品种纯度鉴定方面做了大量的工作，取得了良好的经济效益。

同工酶电泳酶带的显现灵敏，较易获得成功，一次可进行多种酶的分析，从而大大提高了种子纯度检测的功效，具有速度快、费用低、准确度高等优点[4]，因此一度应用于作物纯度检测。然而，同工酶的表达在时间和空间上的特异性又影响着同工酶在不同组织或器官中的分布与活性。酶的提取和电泳技术的实验条件要求严格，可利用的同工酶非常有限,并有酶谱不纯的现象，因而在生产实践中未得到推广应用。

2.蛋白电泳指纹图谱

蛋白质作为基因的直接稳定產物，能反映生物DNA组成上的差异，但适合鉴定品种的基因产物必须在品种间存在较高的多态性，且易于检测出来。植物胚乳（种子）贮藏蛋白就是符合要求的一类基因产物，这些蛋白的组成由遗传决定，不受环境影响，其组分上的差异可反映出基因型的不同，因而可作为品种的“生化指纹”。

自70年代以来，蛋白质电泳作为鉴定品种的一种方法引起了人们的极大兴趣。Ellis（1977）利用淀粉凝胶电泳分析了29个英国小麦品种的醇溶蛋白，除极个别外，这些品种都能被区分开。他们认为，每品种分析50粒种子，既不需花费很多时间，又能保证结果统计的准确性。Shewry（1978）利用SDS-PAGE技术对大麦种子醇溶蛋白进行了分析，成功地将88个大麦品种分为29个种类，显示了醇溶蛋白电泳技术在品种鉴定上的巨大价值。Lookhart（1982）建立了一种标准化的麦醇溶蛋白鉴定技术。1986年，国际种子检验协会将大麦、小麦品种醇溶蛋白电泳鉴定技术列入国际种子检验规程。Cross对玉米的胚蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，成功区分了自交系和杂交种。Anisimova（1989）对53个向日葵品种的球蛋白电泳图谱进行比较，表明球蛋白多态性丰富，可用于品种、自交系同质性和遗传纯度的鉴定。Varier（1992）利用球蛋白的SDS-PAGE技术对向日葵的4个杂交种及其亲本自交系进行了研究，总共检测到了27条带，除3条共有带外，其他带的有无可以决定品种间基因型的不同。

此后，蛋白质电泳鉴定种子纯度技术迅速发展起来，广泛应用于小麦、玉米、番茄等作物。同时电泳技术也日臻完善，在品种鉴定和纯度分析中主要有以下两种方法，即根据蛋白质等电点不同来分离的等电聚焦电泳法（IEF）和根据蛋白质分子量不同来分离的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。此外，毛细管电泳技术（CE）、超薄等电聚焦电泳技术（UTLIEF）、酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（Acid-PAGE）、双向电泳技术（2-D）、高效液相色谱技术在蛋白质分离方面也有很多应用，并显示了强大的优势。

蛋白质电泳技术是目前种子纯度检验中广泛适用的方法。蛋白质提取容易，无需低温，需时较短，成分数量稳定，具有较高的准确性和广泛的适应性[5]。但值得注意的是，由于基因表达有时会受到器官、发育阶段甚至环境条件的影响，故进行电泳鉴定时，除了电泳条件的适当选择外，试验材料的采集也直接影响了鉴定的准确性。另外对于某些遗传组成非常接近的品种，如保持系和不育系，不易找到特异蛋白，采用蛋白质电泳难以发现特征带。此外，蛋白质电泳图谱易受种子发育阶段及表达器官的影响，有时不够稳定，影响了电泳图谱的分析，从而影响了鉴定结果的准确性[6]。并且，随着近几年杂交组合的不断推陈出新，品种之间的差异甚微，亲缘关系较近，鉴定更加困难。

3.结语

纯度是种子重要的质量指标，也是种子分级的主要依据。低纯度、真实性差的种子给农业生产带来极大的损失。再者，在短期经济利益的驱动下，一些不法分子常以牺牲种子纯度为代价来获取高额利润，损害消费者的利益，严重影响了正常的农业生产，成为全国良种推广、总产提高的一大潜在障碍。指纹图谱标记是近年来发展快、应用面广、准确性较高的种子纯度鉴定方法，它在分子水平上对不同遗传特性的种子给予辨别，有准确、可靠、快速和不受外界环境条件影响的特点。采用指纹图谱技术建立一套主要作物的标准指纹图谱，对防止伪劣种子流入市场，提高种子市场规范化具有重要意义。

参考文献

[1]陆士伟,黄炳权,邝章标等.应用酯酶同工酶测定杂交水稻杂种纯度的研究.中国农业科学,1982,(15):10

[2]颜启传.杂交水稻三系及其杂交种种子真实性鉴定和纯度检验.种子,1984,(3):15-18

[3]张春庆等.NAV-PAGE技术与玉米种子纯度测定.中国农业科学,1995,（6）：20-24

[4.]文方德,李卓杰，傅家瑞.种子纯度鉴定技术进展及其评论.种子,1995,(5):36-38

[5]严莉等.现代生物技术在作物品种纯度鉴定上的研究进展.种子,2002,(6):45-46

[6] 管晓春,刘康.浅谈种子纯度及真实性室内鉴定.种子,1998,(3):74-76

篇4：生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

BRUKER VERTEX70型红外光谱仪, 光谱范围400cm-1-4000c m-1, DTGS检测器, 分辨率4cm-1, 扫描次数100次。电子天平BS124 (北京赛多利斯仪器系统有限公司) , 粉碎机FW80 (北京市永光明医疗仪器厂) 。

样品来源:甘草样品由新疆药物研究所提供和签定。

1.2 样品处理及测定

样品处理:取已干燥甘草样本, 按取样要求取足样本量, 用毛刷除去表面泥土后, 再自然风干10天。按编号粉碎并过200目的筛子, 然后分别装入洁净的玻璃瓶中备用。

取约2 mg过筛后的甘草粉末和约200 mg的光谱纯KBr粉末一起研磨均匀, 压片测定红外光谱。

1.3 数据处理

在聚类分析过程中需要计算的距离有光谱与光谱之间的距离, 新创建类与其他图谱或计算光谱与光谱之间的距离常用的方法是欧氏距离法:

Ai k和Aj k分别为i光谱和j光谱在波长点k处的吸光度值。

计算新创建类与其他图谱或类之间的距离常用算法有很多种, 在此我们采用Ward算法、Correlation算法和Cosine算法。

Ward算法公式为:

其中目标r是目标p和q聚成的一个新类, D (p, q) 是目标p和目标i的光谱距离, D (q, i) 是目标q和目标i的光谱距离, D (r, i) 是目标r和目标i的光谱距离。N (p) , n (q) , n (i) 分别表示目标p, q, i中的聚类谱图的数量。

Correlation算法公式为:

Cosine算法公式为:

xr和xs分别表示两光谱的数据向量, dr s向量r和s间光谱距离。

通过测定得到多种不同产地共34个甘草样品的FTIR, 先将红外吸收谱图失量归一化处理, 以800cm-1-1800cm-1范围内的红外吸光度值为指标, 以不同分布地的甘草为对象, 构建原始数据矩阵。最后对测量结果的聚类分析 (Cluster analysis) 采用matlab 7.5软件自编程序进行, 得到表征不同地域甘草的相似性关系的聚类分析图。

2 结果与讨论

2.1 甘草的红外光谱特征

甘草作为天然产物, 成分复杂, 不同产地、品种的甘草有着不同的化学组成, 但其主要的化学组成变化不大[3,4,5,6,7], 从图1的不同地域甘草样品红外光谱图 (FTIR) 中可以看出, 不同产地甘草样品的红外光谱存在一定差异, 主要表现为各特征峰的吸收强度有所变化和指纹区小峰的微小差异, 这可能是与不同分布地的生态环境条件差异有关。但其主要化学物质在红外光谱吸收峰中的峰强和出峰位置上都很相似, 在3400cm-1、1042cm-1有强的羟基 (O-H) 伸缩振动吸收, 峰形基本一致, 且基本没有其他吸收峰干扰, 在2942 cm-1有强的饱和C-H伸缩振动吸收峰, 1737cm-1处的弱吸收峰是甘草中有机酸、皂苷和黄酮类化合物中的羰基C=O伸缩振动吸收。1610cm-1和1549cm-1左右的吸收峰为酰胺化合物的吸收Ⅰ和Ⅱ带。1452cm-1和1419cm-1等为蛋白质分子肽键中的C—N键的伸缩振动吸收。在1418cm-1、1247cm-1各有一个C-O伸缩振动吸收峰, 应为甘草脂类物质的吸收峰。在甘草红外图谱中, 各个谱区内部包含了多种组分的信息, 而同一组分的信息分布在多个谱区, 不同组分虽然在某个谱区可能重叠, 但在全光谱范围内不可能完全相同。

a.哈萨克斯坦b.天德c.新疆d.安徽大东方

2.2 光谱特征的提取

从图1可以看出, 典型不同产地甘草的红外光谱如图非常相似, 因此在进行聚类分析前对红外光谱数据阵列进行相关系数比对, 发现在800 cm-1-1800c m-1波段范围内不同产地甘草峰位置和峰强度均有较明显的差异, 并具有一定的特征性和指纹性, 这一差异为甘草的聚类分析和产区的鉴别奠定了一定的数学基础。因此特采集该段样本吸光度值作为模式识别的原始数据。以吸光度值为指标, 不同分布地的甘草为对象, 构建原始数据矩阵, 并作归一化处理。

2.3 聚类分析

用于聚类分析的34种不同产地甘草样品及编号见表1, 利用Matlab编程可直接得出不同算法的聚类结果, 如图2~图4所示。图中横轴表示谱图编号, 竖轴为计算距离。距离越近则谱图相似程度越大, 建立指纹谱图的可靠性越高。从新疆 (中亚) 甘草和各地甘草聚类分析图可以看出, 新疆 (中亚) 甘草具有较好的相似性而归为一类。同时, 各地 (中国其他省份) 甘草表现出的相似性较差, 出现了较多的与新疆 (中亚) 甘草交替归类的情况。

在图2中, 17、18、34、20、32中除了34 (安徽) 外, 具有很大的相似性;6、26、31、22、27中除了27 (安徽) 外, 也表现出了同一性。另外, 4、5与13、14能聚为一类。可以看出各地 (非中亚地区) 甘草归类情况既有相似之处, 又表现出了较大的分散性, 如8、34、27等。在图3中, 11、23、17、34、18、20、32中除34 (安徽) 外, 都具有一定的相似性而归为一类。同时, 如图中所示:1、9;4、7;13、14;15、28能较好地两两聚在一起, 也说明这些甘草具有某些相似之处。不难发现, 非中亚地区甘草表现出“大杂居, 小聚居”的特点。在图4中, 1、16、25、9、29、7、19、2、30、20、21、24、11、、23、32、17、18、34中除去1、9、29、7、2、34的分散外, 中亚地区甘草表现出了很大的相似性。

综上所述, 根据不同产地的甘草聚类分析图显示, 不同地源甘草在很大程度上决定了甘草的相似程度, 新疆 (中亚) 地区甘草能较好地聚为一类, 说明其在各方面都有较好的相似性, 同时, 各地 (非中亚地区) 甘草既表现出相似性, 又呈现出较大的分布差异。

3 结论

植物的正确分类需综合大量的分类信息, 而本实验中用红外光谱结合模式识别和计算机技术, 探讨解决一些植物存在的分类系统建立, 属间界限划分与化学成分之间对应程度的问题。从聚类结果来看, 采用红外光谱聚类分析能很好地将同一地区的样品归类在一起, 同时也表明采用红外数据进行聚类时, 体现出聚类算法侧重于揭示具有最相近关系的优点来。结果表明, 本法作为一种辅助工具用于解决植物分类问题是可行和有效的。

摘要：采用傅里叶红外技术对不同产地的甘草进行考察, 获得植物内在的成分信息, 以800-1-1800cm-1范围内的吸收峰为指标, 应用聚类方法进行数据分析, 最终将甘草分为2个类别, 同类别甘草的化学组分相似, 聚类分析结果可作为甘草药材质量评价的依据。基于FTIR谱的聚类分析能够在一定程度表征出甘草在不同地理位置和气候条件的多样性分化, 能对甘草的合理利用提供依据。

关键词：红外,甘草,聚类分析

参考文献

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篇5：生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

关键词：纳豆菌；形态学；ERIC-PCR；聚类分析；电镜

中图分类号： Q934；Q933文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0300-03

收稿日期：2013-12-12

基金项目：山东省科学技术厅省良种工程项目（编号：2011LZ006）。

作者简介：宋凯凯（1988—），女，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事食药用菌分子遗传育种。E-mail：skk1003@126.com。

通信作者：郭立忠，教授，主要从事食药用菌的品种改良。E-mail：glz119@126.com。纳豆（natto）是日本传统大豆发酵食品。纳豆的主要发酵菌为纳豆菌，属芽孢杆菌属，是好氧的革兰氏阳性菌[1]。纳豆菌能分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的成分，还能分泌各种酶和维生素，从而可促进小肠黏膜细胞的增殖，保证小肠功能正常[2-6]。纳豆还能有效预防和辅助治疗心脑血管疾病。纳豆防治心脑血管疾病的药用价值主要源自纳豆激酶[7]。自1987年纳豆中发现强力溶栓激酶——纳豆激酶以来，纳豆引起了全世界的广泛关注[8]。该酶不仅有显著的溶栓作用，还可以激活静脉内皮细胞的纤维蛋白酶原[9-10]。此外，纳豆菌发酵液中含有多达17种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸[11]，因此纳豆具有“超级健康食品”的美誉。然而，由于当今市场纳豆产品种类繁多，都有各自的菌种命名，因此本试验利用扫描电子显微镜和ERIC-PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR）指纹图谱技术[12]对4个纳豆菌生产种进行鉴定分析，旨在鉴定其个体形态的差别及亲缘关系的远近。

1材料与方法

1.1供试菌株

4个纳豆菌株（高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM 无臭），由青岛农业大学农业应用真菌研究室提供。

1.2方法

1.2.1单菌落培养 将4种纳豆菌株接种到LB液体培养基（成分为 10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl）中，放入摇床37 ℃、180 r/min条件下过夜培养，将过夜培养的菌液稀释100倍后取50 μL均匀涂布在LB固体培养基（成分为10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl、20 g/L琼脂）上，放入 37 ℃ 恒温箱中过夜培养，分别挑取菌落做四区划线放入 37 ℃ 恒温箱中培养5 h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中过夜培养。

1.2.2菌种的形态学分析——制作纳豆菌的电镜样品（1）将浸泡在75%乙醇中的洁净盖玻片取出在酒精灯火焰上烧一下，待盖玻片冷却后将其放到平板培养的菌落上轻压一下粘取菌落；然后用PBS（pH值为7.4，将2.9 g NaH2PO4·2H2O与29 g Na2HPO4·12H2O用去离子水定容到500 mL）处理3次，每次10 min；用戊二醛固定液（配制比例为戊二醛 ∶PBS ∶去离子水体积比1 ∶8 ∶1）固定2 d，中间换1次固定液。（2）固定2 d后用PBS洗3次，每次10 min。（3）分别用30%、50%、70%、90%、100%乙醇洗样品1 h，使其逐步脱水，再用100%乙醇洗样品30 min。（4）用乙醇 ∶叔丁醇=1 ∶1 的混合液洗样品30 min，再用100%叔丁醇洗样品2次，每次30 min，用叔丁醇逐渐将乙醇从样本中替换出来。（5）将样本抽真空，把盖玻片压碎，将有菌的碎片用导电胶粘附到观察台上喷涂导电材料，然后在电子显微镜下观察。

1.2.3细菌基因组DNA的提取（CTAB/NaCl法）（1）将活化好的菌株转接到5 mL LB液体培养基中，培养至饱和状态，取1.5 mL培养物10 000 r/min离心3 min。（2）沉淀物加入600 μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬，加入少量溶菌酶，37 ℃温浴30 min，加入30 μL 10%的SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K，混匀，于37 ℃温浴1 h。（3）加入 100 μL 5 mol/L的NaCl，充分混匀，再加入80 μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65 ℃温浴15 min。（4）加入等体积的三氯甲烷、异戊醇，混匀，12 000 r/min离心10 min，将上清液转到一个新管中，如果难以移出上请，先用牙签去除界面物质。（5）加入等体积的酚、三氯甲烷、异戊醇，混匀，12 000 r/min离心10 min，将上清液转入另一支新管中。（6）加入1倍体积无水乙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，放入-20 ℃冰箱沉淀 30 min，取出后12 000 r/min离心10 min，将沉淀转移到 1 mL 70%乙醇中洗涤。（7）12 000 r/min离心15 min，弃上清，用超净工作台稍加干燥，重溶于50 μL的TE缓冲液。（8）取 2 μL 上述提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4基因组DNA纯度检测用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，如果DNA条带清晰、整齐、明亮且无拖尾，则表明DNA完整性好且纯度较高，可用作PCR反应。

nlc202309032303

1.2.5ERIC-PCR扩增ERIC-PCR扩增应用的引物ERIC1（5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′）、ERIC2（5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′）均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反应体系为50 μL，由25 μL Dream Taq PCR Master Mix（2×）、2 μL引物ERIC1（20 μmol/L）、2 μL引物ERIC2（20 μmol/L）、3 μL 基因组DNA、18 μL去离子水组成。ERIC-PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火1 min，65 ℃ 延伸5 min，35个循环；最后65 ℃延伸 16 min，4 ℃ 结束扩增。

2结果与分析

2.1形态学分析

由图1、图2、图3、图4的电镜照片可以看出，MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的菌体呈单杆状，而高桥纳豆的菌体呈长杆状，因此MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭3个菌株的亲缘关系较近，而高桥纳豆与其他3个菌株的亲缘关系较远。

2.2DNA提取结果

4个纳豆菌株的基因组DNA 0.8%琼脂糖凝胶电泳图谱见图5，图中1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的DNA条带。从图5可以发现， DNA条带

清晰、整齐、明亮且无拖尾，表明DNA完整性好且纯度较高，可用作PCR反应。

2.3基因组DNA的ERIC-PCR及聚类分析

图6为4个纳豆菌株的ERIC-PCR 1.4%琼脂糖凝胶电泳图谱，图中M泳道为marker，1～4号泳道分别为高桥纳豆、MIZKAM 1、寿纳豆、MIZKAM无臭的ERIC-PCR电泳图谱。

使用NTSYS 2.10e软件对4个菌株的相似性进行聚类分析，结果见图7。

由图7可知，当以相似性系数0.64为阈值时，4个菌株聚成2组：第1组为MIZKAM无臭、寿纳豆、 MIZKAM 1， 第2

组为高桥纳豆；当以相似性系数0.75为阈值时，4个菌株聚成3组，MIZKAM无臭和寿纳豆聚为一组，MIZKAM 1和高桥纳豆各为一组。因此MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近。

3讨论

本试验通过扫描电子显微镜及ERIC-PCR指纹图谱技术对4个纳豆生产菌株进行了亲缘关系鉴定。通过ERIC-PCR指纹图谱的聚类分析与电镜2种技术，最终都得到MIZKAM无臭与寿纳豆的亲缘关系较近，而高桥纳豆则与其他品种亲缘关系较远的结论，同时也证明了这2种技术对纳豆菌种鉴定的准确性与可靠性。

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篇6：生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

关键词：中药,色谱技术,光谱技术,多维指纹图谱

中药指纹图谱是指中药材、提取物或中药制剂等经适当处理后, 采用一定的分析手段, 得到的能够标示该中药材、提取物或中药制剂特性的共有峰的图谱。从1984年香港中文大学中药研究中心提出了开展中药成分“指纹”鉴定工作的设想以来, 我国就开始了指纹图谱的研究[1]。国家药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行) 》[2], 要求中规定, 为确保中药注射剂质量稳定、可控, 中药注射剂在固定了中药材品种、产地和采收期的前提下, 需要制订中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。特别是在《中国药典》 (2010年) 中, 建立了能反映中药整体特性的色谱指纹图谱方法 (如满山红油、薄荷素油、积雪草总苷、莪术油、丹参酮提取物、丹参总酚酸提取物、三七总皂苷和三七三醇皂苷等药材及其提取物) 。指纹图谱技术在我国中药质控方面得到了迅速发展。

2000年罗国安等[3]提出了多维指纹图谱的概念。多维指纹图谱, 即采用多种分析仪器联用的模式来建立指纹图谱 (如HPLC-DAD-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS、CE-MS[4]) 。多维指纹图谱的优点是在色谱分离的同时还能进行光谱的在线检测, 从而产生的数据既包括色谱的化学信息又包括光谱的信息。因此, 这一方法特别适合中药及其制剂这一复杂体系的测定。

建立多维指纹图谱的组合方式主要包括:不同柱子的串并联、不同检测器的串并联、不同色谱方法的组合及不同仪器间的组合。建立多维指纹图谱的一些常见联用技术主要有高效液相色谱-光电二极管阵列检测器 (HPLC-DAD) 、高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-质谱 (HPLC-DAD-MS) 、高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器 (HPLC-DAD-ELSD) 、高效液相色谱-光电二极管阵列检测器-核磁 (HPLC-DAD-NMR) 、毛细管电泳-质谱 (CE-MS) 、气相色谱-质谱 (GC-MS) 等。

1 HPLC-DAD

高效液相色谱仪的DAD检测到的图谱是三维谱图, 用DAD建立指纹图谱, 得到的图谱就是最简单的多维指纹图谱。DAD的光栅在流通池后, 用阵列二极管同时测定各个波长的光强度, 因此在每一个色谱时间点上都可以同时得到紫外光谱图, 而且得到的光谱图会随着色谱保留时间方向上的化学成分和浓度的不同而发生变化。测得的数据中既包含色谱信息也包含光谱信息。色谱的保留时间结合光谱信息可以用来进行定性鉴定, 而色谱的峰高与峰面积等可以用来进行定量检测[5]。

谢显珍等[6]利用HPLC-DAD建立了黄芪药材中黄酮类化合物的色谱指纹图谱。在利用联用色谱提供的色谱以及光谱信息的基础上, 利用一些化学计量学方法获取了主要黄酮类物质的光谱图, 将这些光谱图与标准图谱相对照, 以定性指纹图谱中主要的黄酮类组分, 进而表征和建立了不同产地黄芪药材中黄酮类化合物特征色谱指纹图谱。此外, 胡建兰等[7]利用HPLC-DAD建立了凉膈散汤剂的指纹图谱, 建立了该方汤剂整体特征的质量评价方法。侯志飞等[8]利用HPLC-DAD建立了栀子及其炮制品指纹图谱, 应用在线紫外光谱对指纹峰进行了定性归属研究。胡虒尧等[9]建立了当归芍药散的HPLC-DAD指纹图谱, 根据HPLC图中各峰的保留时间和DAD检测的紫外光谱图的进行比对, 认定了峰的来源, 对方中部分特征峰进行了归属。袁晓等[10]建立了茜草HPLC-DAD指纹图谱, 提供了茜草药材的质量控制方法。

2 HPLC-DAD-MS

质谱检测器 (MSD) 在选择性、通用性、灵敏度和化合物的分子量及结构信息的提供等方面均有较突出的优点。HPLC-DAD-MS联用技术实现了在分离成分时, 能够在线提供各指标性成分或活性成分化学结构信息, 能够提供深层次分析信息的工具, 而且检测的高灵敏度可以解决一些药材近缘品种指纹图谱中虽然有指纹特征, 但信号微弱, 又有必要辨认组分的分析[11]。

早在2001年, 戴德舜等[12]及曹进等[13]就利用HPLC-DVD-MS-MS技术对桂枝汤A部分双向调节样品及单向升温样品进行指纹图谱的确定。该实验分析了MS总离子流图及高效液相谱图主峰对应的可能分子量, 根据药典和桂枝汤中五种单味药有效成分的相关资料, 推测出了桂枝汤A部分双向调节作用的物质基础可能对应单味药的物质来源。并且利用LC-MS联用技术对桂枝汤A部分以及组成桂枝汤五味单味药A部分进行多维全息化学特征谱的指认。通过Mass的质荷比 (M/Z) 值及HPLC色谱峰的保留时间相互对照, 将桂枝汤A部分中主要成分进行归属, 为进一步研究药效作用的走向提供了有效途径。聂晶等[14]采用HPLC-UVD对生血宁片的指纹图谱进行了研究, 并利用UPLC/DAD/Q-TOF-MS技术对其中主要色谱峰进行了归属, 为更好地控制生血宁片质量提供可靠依据。

3 HPLC-DAD-ELSD

蒸发光散射检测器 (ELSD) 的工作原理是, 色谱柱流出物经过蒸发器将流动相蒸发, 待测成分变成微粒气雾流, 一定强度的光照射此微粒, 测定其散射光, 散射光的强度取决于测定的微粒的大小和多少, 而与其结构关系不大。因此, 对于没有紫外吸收的皂苷类等化合物来说, 用ELSD特别适合。DAD可检测出有共轭体系的化合物的特征吸收, ELSD可检测皂苷类化合物等紫外吸收不明显的化合物的吸收信息。应用二极管阵列检测-蒸发光散射检测联用测定中药材及其制剂可有效的互补。

闫艳等[15]建立了酸枣仁药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱。现代药理研究表明, 酸枣仁中镇静催眠的主要有效成分是皂苷类和黄酮类。皂苷类成分大多没有明显的紫外吸收, 用紫外检测器测定效果不好, 基线漂移严重, 相应值低。应用ELSD测定皂苷类成分效果好, 基线稳定, 有很好的响应值。因此, 采用HPLC-DAD-ELSD法既能测定酸枣仁药材中的黄酮类成分, 又能测定皂苷类成分, 一次进样可同时测得两类成分的指纹图谱, 从而使得对酸枣仁的质量评价更加全面。此外, 苏碧茹等[16]采用HPLC-DAD-ELSD串联技术建立了黄芪药材的HPLC-DAD-ELSD色谱指纹图谱, 为黄芪药材的全面质量控制提供了科学依据。石媛慧等[17]采用DAD串联ELSD建立不同品种石斛的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱, 可直接反映石斛品种与化学成分变化的关系。

4 HPLC-DAD-NMR

核磁共振波谱法 (NMR) 是将自旋核放入磁场, 用适宜频率电磁波照射它们, 其吸收能量, 发生原子核能级跃迁, 同时会产生核磁共振信号, 从而得到核磁共振谱。核磁共振谱能够提供的参数主要有化学位移、质子的裂分峰数、偶合常数及各组峰的积分高度等。而这些参数与有机化合物的结构有着非常密切的关系。故此, 核磁共振谱是鉴定有机化合物、金属有机化合物及生物分子结构和构象等的重要工具之一。NMR作为一种波谱型指纹图谱与HPLC这一色谱型指纹图谱相结合, 在中药材及中药复方这一复杂体系中将所有成分的信息尽可能多的表现出来, 具全面性和整体性的优势。

林云良等[18]建立了金银花的HPLC-DAD-NMR指纹图谱。采用高效液相色谱法及核磁共振的方法, 对山东产金银花的乙醇提取物中的活性成分进行了系统的研究, 建立了其指纹图谱。此两种方法联用作为检测手段能够很好地表征中药材及其制剂的内在化学成分特征及其相对之间含量差异。

5 CE-MS

毛细管电泳法 (CE) 是指带电质点 (胶粒或离子) 在电解质溶液中在电场的作用下, 向荷电相反电极迁移的现象称为电泳。因为带电质点的电荷数量、电荷符号和质点大小的差别, 迁移速度有所不同, 从而分离。电泳若是在毛细管中进行的则为毛细管电泳法。毛细管电泳法不仅能分离分析有机化合物, 无机阴、阳离子, 手性分子, 中性分子和大分子, 而且具有柱效高、样品用量少、分析速度快、应用范围广等特点。CE指纹图谱具有很好的专属性, 当与高灵敏度的质谱检测器联用时, 能够得到较低的检测限。此外, 质谱还可以提供分子量用于定性, 多级质谱还可以提供结构的碎片信息, 而用于结构鉴定。因此, 毛细管电泳质谱联用技术用于中药的研究, 应用前景比较广阔。孙毓庆等[19]系统总结了毛细管电泳指纹图谱以及毛细管电泳-质谱联用技术在中药质量控制中的作用。

6 GC-MS

气相色谱法 (GC) 是以气体为流动相的色谱分离技术。在中药质量现代化的研究过程中, 气相色谱法有较为重要的地位。对于含有挥发性成分、主要成分为脂肪酸类的中药材及挥发油等成分的质量控制有着不可替代的作用和比较理想的分离效果。气相色谱法和质谱联用具有比较好的定性功能, 使中药材及其制剂指纹图谱的研究更加系统和完整, 并且为解决中药研究中缺乏标准品提供了可行之路。

华永丽等[20]建立了当归及其炮制品挥发油的GC-MS化学指纹图谱。以当归及其不同炮制品为样品, 以气相色谱-质谱联用技术为分析方法, 运用统计分析手段, 建立了从化学指纹图谱中发现不同炮制品潜在标志物的方法。耿放等[21]建立了桂枝茯苓丸脂溶性成分GC-MS指纹图谱, 从整体定性方面评价桂枝茯苓丸的质量优劣。潘瑞景等[22]对不同产地半枝莲药材及其混淆品的GC-MS指纹图谱进行研究, 证明了九个不同产地半枝莲具有统一性, 与混淆品之间具有明显的差异。

7 不同仪器的组合

用不同仪器建立指纹图谱, 这些仪器在技术上及在原理上能够优势互补, 能够合理交叉地整合定性信息, 为综合鉴定中药质量的全貌奠定基础, 这为寻找中药大复方体系的标准制剂提供一种探索模式, 且具有现实性、有效性、可靠性和可操作性。

孙国祥等[23,24]建立了防风通圣丸及柏子养心丸的高效液相色谱指纹图谱、紫外光谱指纹图谱、红外光谱指纹图谱及热值谱, 形成多元多维方法交叉评价防风通圣丸质量的方法。用190~400 nm的紫外区间紫外光谱指纹图谱表达π→π*, n→π*和n→σ*的化学组分, 用4000~400 cm-1红外光谱指纹图谱表达单键、双键及三键等的振动 (或转动) 对中红外线的吸收, 这些均以光谱点为评价单元。用燃烧焓衡量中药的有机物达到高价氧化态的热释放度, 以此来揭示有机组分的总量。故以此四种多元多维指纹图谱的交叉整合能够监测中药各类化学成分分布的情况, 为中药的质量控制提供了一种简单探索性的方法。此外, 陈新新等[25]建立了六味地黄丸 (浓缩丸) 的五波长高效液相色谱指纹图谱、紫外指纹图谱和导数指纹图谱, 为其药效物质均一性的评价提供了一种有效的方法。孙国祥等[26]建立了维C银翘片紫外指纹图谱、红外指纹图谱及测定燃烧热, 利用两种光谱指纹图谱实现对中药全化学成分的 (双键、三键和饱和键) 全面监测。

篇7：生化指纹图谱技术在品种鉴定中的应用及研究进展

1 试剂与材料

1.1 实验试剂

黄芩苷标准品 (国家标准物质中心, 12112909) ;黄芩购于药材市场 (由黑龙江中医药大学陈效忠教授鉴定) ;所用试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

调温加热套 (ZDHW, 黄骅市新兴电器厂) ;多功能磁力搅拌器 (MTS-III, 安徽天长市仪器仪表配套厂) ;电化学工作站 (LK2005型, 天津兰力克科技有限公司) ;电子天平 (BP211D, 德国Sartorius) 。

2 试验方法

2.1 黄芩提取、检测方法

取黄芩30g放入圆底烧瓶中, 按料液比加入60%乙醇, 升温至回流, 保温提取一定时间, 保温过滤, 收集提取液备用, 重复提取药材数次, 合并提取液, 经蒸馏、烘干、粉碎, 得浸膏粉。取浸膏粉适量, 开启电化学工作站, 控温在 (37±0.02) ℃, 依次加入硫酸、硫酸锰、丙酮溶液各10mL及待测物, 搅拌15min后, 加入KBrO3溶液10mL, 计时开始, 以诱导时间为检测指标, 检测提取物。

2.2 标准曲线绘制

精密称取黄芩苷标准品20mg, 置于25mL容量瓶中, 加入20mL二氯甲烷, 超声分散15min, 定容。精密移取1、2、3、4、5mL上述溶液, 分别置于10mL容量瓶中, 以二氯甲烷定容, 测定诱导时间, 以浓度与诱导时间为坐标轴绘制标准曲线。

2.3 精密度考察

按照标准曲线, 按高、中、低三个重量精确称取同一提取条件的浸膏粉, 分别为150、200、250mg, 以诱导时间为指标进行检测, 每天5次, 连续测量5天, 计算日内及日间精密度。

2.4 回收率考察

精密称取一定量的黄芩浸膏粉, 于10mL棕色容量瓶, 配制成高、中、低三个剂量, 加入一定质量黄芩苷对照品, 二氯甲烷定容, 测定诱导时间, 每个样品平行测定3次。

2.5 正交试验设计

在单因素考察实验结果基础上, 对溶剂用量、提取时间及提取次数设计正交试验进一步优化提取工艺。正交试验设计见L9 (3) 4试验表。

3 实验结果

3.1 标准曲线绘制

以浸膏粉取样量m (mg) 与诱导时间t (s) 为坐标, 采用origin软件, 得图1。经线性回归分析得线性方程:Y=6 120.8-18 476X, (r=0.997 2) , 可见, 浸膏粉取样量在0.32~1.6mg范围内线性关系良好, 诱导时间与加样量成反比关系。

3.2 精密度考察结果

测得日内日间精密度均小于2%, 符合方法学要求, 结果见表2。

3.3 回收率考察结果

测得回收率在96.0~100.4%之间, 符合方法学要求, 结果见表3。

(n=5)

(n=3)

3.4 正交试验结果

经L9 (3) 4正交试验, 对浸膏粉活性诱导时间指标进行数据处理, 电化学指纹图谱见图2, 正交试验结果见表4, 方差分析结果见表5。

从表4中各因素极差值和表5中F值大小, 可以得出, 三个因素对浸膏粉活性的影响主次关系为:提取次数 (B) >提取时间 (C) >溶剂用量 (C) , 最优组合为A2B3C3。从表3的方差分析结果得出如下结论:提取次数 (因素B) 对浸膏粉活性影响特别显著, 随着提取次数增多, 浸膏粉活性提高, 但并非次数越多越好, 次数增多浪费能耗, 提高成本, 结合单因素考察结果, 提取次数为3 (即B3) 时可以得到最优提取工艺, 即60%乙醇用量为10倍, 提取次数为3次, 提取时间为3h。

4 讨论

中药的有效成分极为复杂, 中医理论以协同为基础, 故药效发挥并非只有有效部位, 而是全药成分共同结果[5]。传统方剂熬制尽取其全部成分已达到治疗与辅助治疗作用, 其提取液成分极其复杂, 治疗效果明显, 但采用现代分析方法如高效液相、气相色谱, 只能针对单一组分进行比较分析[6], 并且样品处理繁琐, 分析其成分很难, 因此对方剂每次熬制提取结果的优劣难以评估。电化学指纹图谱的原理是待测物与反应体系发生周期性振荡化学反应, 在产生的振荡中一些特征参数反映出不同待测物的不同信息, 并呈现相应的规律性, 方法简单、快速, 样品无需预处理, 参数具有很好的特征性和重现性[7]。在实验中发现定量信息随检测用量的变化诱导时间有一定的规律性, 并有成良好的函数关系, 根据函数关系对中药提取液进行质量评价[8]。这种方法弥补了指纹图谱对复杂成分定量分析的空白, 避免了单一成分失去全成分中药疗效的缺点, 具有广阔的应用前景。

摘要：目的:建立优化中药提取工艺新方法。方法:以电化学指纹图谱的特征参数诱导时间为指标, 设计正交试验, 优化中药方剂的提取工艺。结果:药材的最佳提取工艺为10倍药材量的60%乙醇, 提取时间3h, 提取3次, 中药处方提取物活性成分最高, 方法学考察符合要求。结论:电化学指纹图谱技术用于优化中药提取工艺, 具有很好的应用前景。

关键词：电化学指纹图谱,中药提取,工艺优化

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