一种鲍鱼脏器多糖的鉴定及活性研究

一种鲍鱼脏器多糖的鉴定及活性研究（精选3篇）

篇1：一种鲍鱼脏器多糖的鉴定及活性研究

皱纹盘鲍脏器多糖的分离纯化及鉴定

利用碱性蛋白酶从皱纹盘鲍脏器中提取多糖,采用胃蛋白酶和Sevag相结合的方法脱除蛋白质;经Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-cellulose 52离子交换层析分离纯化得到AHP-2;AHP-2经高效液相色谱和比旋光度法鉴定其为均一性多糖;紫外扫描无蛋白质的.特征吸收峰;红外光谱分析,AHP-2具有典型的多糖吸收峰和硫酸基吸收峰;凝胶色谱法测定其分子量为10 000～15 000;化学组成分析表明,AHP-2是硫酸酯多糖,硫酸根含量11.55%;气相色谱测定单糖组成为鼠李糖、岩藻糖、木糖、半乳糖和葡萄糖,其摩尔比Rha:Fuc:Xyl:Gal:Gul=6.7:2.0:3.9:7.4:1.0.

作 者：李冬梅 谭凤芝 杨静峰 殷红玲 李韬 朱蓓薇 LI Dong-mei TAN Feng-zhi YANG Jing-feng YIN Hong-ling LI Tao ZHU Bei-wei  作者单位：大连工业大学,生物与食品工程学院,辽宁,大连,116034 刊 名：水产科学  PKU英文刊名：FISHERIES SCIENCE 年，卷(期)： 26(9) 分类号：Q538 关键词：皱纹盘鲍   脏器   多糖   分离纯化   相对分子量   单糖组成  

篇2：玉米须多糖的提取及活性研究

本实验以玉米须为原料,采用水提醇沉法及超声波辅助法提取玉米须中的多糖,并利用单因素法研究了两种方法中不同提取条件分别对玉米须多糖提取率的影响。并研究了多糖的抗氧化活性; 研究多糖的降血糖活性。

1 实验部分

1. 1 原材料与设备

玉米须,来源于盐城农贸市场; 葡萄糖( AR) ,天津市科密欧化学试剂有限公司; 无水乙醇( AR) 、95% 乙醇,江苏彤晟化学试剂有限公司; 苯酚( AR) 、丙酮( AR) 、浓硫酸( AR) 、氯仿( AR) 、正丁醇( AR) ,上海申翔化学试剂有限公司;DPPH( AR) 、谷胱甘肽( AR) 、α - 葡萄糖苷酶( AR) 、维生素C( AR) ,Aladdin Industrial Corporation; 紫外可见分光光度计( UV -2100) ,尤尼柯( 上海) 生物仪器有限公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 样品含量测定

将样品用蒸馏水稀释到不同容量瓶中,然后分别吸取1. 0 m L不同浓度的溶液,按上述方法进行操作,测得吸光度值。最后根据得到的标准曲线对样品中多糖含量的进行计算,标准曲线绘制方法参见文献[10]。

1. 2. 2 超声波辅助提取工艺优化

精确称取5 份40 目玉米须粉末3 g于250 m L烧杯中,加入蒸馏水,将烧杯置于60 ℃ 的水中,分别以超声功率,超声时间为实验考察因素,以多糖提取率为指标进行单因素试验,比对多糖提取率的影响。测得最适超声功率,超声时间后,缩小范围继续做两组比对实验。

1. 3 玉米须多糖的生物活性

1. 3. 1 玉米须多糖的抗氧化性

分别配制浓度为0. 03 mg/m L的DPPH溶液,浓度为0. 1 mg / m L、0. 08 mg / m L、0. 06 mg / m L、0. 04 mg / m L、0. 02 mg / m L的玉米须多糖溶液, 浓度为0. 05 mg/m L、0. 04 mg/m L、0. 03 mg / m L、0. 02 mg / m L、0. 01 mg / m L的维生素C溶液,将其封口,摇匀后备用。

DPPH在其最大吸收波长处有强吸收的特点,加入抗氧化剂后,其溶液由深紫色褪至无色或浅黄色,因此可以用紫外可见分光光度法定量分析多糖溶液中的自由基清除程度[11]。

将配制好的反应液用力摇匀,避光反应30 min后在517 nm处测定吸光度,用无水乙醇调零。测出A0、A1、A2所表示反应液的吸光度值,计算清除率。

式中: A0———2 m L DPPH溶液+ 2 m L无水乙醇的吸光度

A1———2 m L DPPH溶液+2 m L样品溶液的吸光度

A2———2 m L样品溶液+2 m L无水乙醇的吸光度

1. 3. 2 玉米须多糖的降血糖活性

α - 葡萄糖苷酶活力测定: 将1000 μL的p H为6. 8 的磷酸缓冲液( 浓度为0. 1 mol/L) ,50 μL的还原性谷胱甘肽溶液( 浓度为0. 5 mg/m L) 以及5 μL的 α - 葡萄糖苷酶溶液( 20 mg/m L)混匀,在37 ℃ 水浴条件下反应10 min。然后再加入50 μL的PNPG( 4 - 硝基苯基- β - D - 吡喃葡萄糖苷) 溶液( 浓度为0. 5mg / L) ,混合均匀后,在37 ℃ 水浴中恒温反应15 min,加入10m L Na2CO3溶液( 0. 1 mol/L) 进行终止反应。在405 nm处测定反应体系的吸光度A对照。

玉米须多糖标准液: 准确称量25 mg玉米须多糖,以去离子水溶解并将其定容到25 m L的容量瓶中,使其溶液浓度为1 mg / m L,震荡后静置。加入无水乙醇,分别配制得到浓度为0. 1 mg / m L、0. 08 mg / m L、0. 06 mg / m L、0. 04 mg / m L、0. 02 mg / m L的玉米须多糖溶液。将其分别加入酶活力反应体系中,37 ℃ 水浴恒温10 min,与碳酸钠溶液终止反应,于405 nm处测吸光度A样品。

以磷酸缓冲液替代反应体系中的酶,其它条件不变,测定吸光度值A空白。

玉米须粗多糖对 α - 葡萄糖苷酶抑制率的计算如下:

2 结果与讨论

2. 1 标准曲线的制定

对试验数据进行分析并绘制标准曲线,葡萄糖的标准曲线方程为: Y = 16. 1928X + 0. 00586( R2= 0. 99798 ) ,其中Y表示吸光度效率值,X表示葡萄糖溶液的浓度,由线性回归方程系数可知玉米须粗多糖浓度在0. 00 ~ 1. 6 mg/m L的范围内具有一定的线性关系。

2. 2 超声波辅助法对多糖提取率的影响

2. 2. 1 不同超声功率对多糖提取率的影响

实验研究了超声功率与玉米须多糖提取的关系,其结果如图1 所示。

由图1 可以看出,玉米须多糖的提取率随着超声功率的增加而逐渐增高,直至达到最大提取率4. 25% 。当超声功率达到400 W以后,超声功率越大,多糖的提取率越低。这是因为超声波磁场的强度由输出功率和频率决定,当超声波发生器的频率不变时,输出功率的增大有利于提高溶剂的流动速度,从而增强溶液的传质能力; 同时加快了细胞的破碎速度,这些因素都有助于玉米须多糖的提取。但是当输出功率过大时,烧杯内的温度会迅速提高,从而影响多糖的浸出。因此,400 W的超声功率为最适宜的工艺条件。

2. 2. 2 不同超声时间对多糖提取率的影响

超声时间对于多糖提取率的影响的实验结果如图2 所示。由图2 可以看出,玉米须多糖的提取率随着超声时间的增多而逐步提高,这是由于超声波的震荡及空化作用有利于溶出细胞内的物质。当超声时间过短时,玉米须中的多糖成分不能够完全溶出; 而当超声时间太长时,会导致多糖分子结构的瓦解,从而使玉米须多糖的提取率下降。因此,综合考虑之下,最适超声时间为45 min。

2. 3 玉米须多糖的生物活性

2. 3. 1 多糖的抗氧化性

DPPH属于有机氮自由基的种类,其性质比较稳定。它的乙醇溶液的颜色为深紫色,517 nm是其最大的吸收波长。当自由基清除剂被加入DPPH的溶液中时,DPPH自由基的孤对电子被匹配,其溶液由紫色逐渐变化为黄色,吸光度也随之变小。吸光度数值的变化和自由基的清除程度通常成正比例,因此可以用吸光度来表示物质对于自由基的清除效果[12],一般用清除率表示,因此可以通过清除率来反映样品的抗氧化能力。

通过实验研究了多糖的质量浓度与DPPH自由基的关系,实验结果如图3 所示。

由图3 可以看出,玉米须的多糖提取物对自由基DPPH有一定的清除能力,其自由基清除率和反应物中多糖的质量浓度成正比。通过实验我们能够发现玉米须多糖具有一定的抗氧化能力。

2. 3. 2 多糖的降血糖活性

由实验可知玉米须多糖的质量浓度对于抑制率的影响,结果如图4 所示。

由图4 可以看出,玉米须多糖对于 α - 葡萄糖苷酶的抑制率与其质量浓度呈一定的正比关系,在多糖达到最大浓度0. 1 mg / m L时,其抑制率高达85. 26% 。由此可见,玉米须多糖对于 α - 葡萄糖苷酶存在比较厉害的抑制效果。因此,玉米须多糖具有一定的降血糖活性。

3 结论

研究不同实验方法提取多糖的最优工艺条件。通过单因素实验,超声波辅助法提取玉米须多糖的最优工艺参数为: 400 W的超声功率,超声时间为45 min。

抗氧化试验表明,在一定的玉米须多糖浓度范围内,提取液对DPPH自由基的清除率随浓度的增加而增大,最大清除率为68. 13% ,玉米须多糖具有一定的抗氧化能力。玉米须多糖存在一定的降血糖活性,其对 α - 葡萄糖苷酶的抑制率随质量浓度的增加而增大,最大抑制率为85. 26% 。

摘要：优化了超声波辅助提取法提取玉米须植物多糖的工艺条件,用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法研究了玉米须多糖的抗氧化活性,以对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试方法测定玉米须多糖的降血糖活性。结果超声波辅助提取法的优化工艺参数为:45 min的超声时间,提取功率为400 W。玉米须多糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除率随其质量浓度的增加而增大,最大清除率为68.13%;对α-葡萄糖苷酶的抑制率随质量浓度的增加而增大,最大抑制率为85.26%。

篇3：铁皮石斛多糖抗癌及免疫活性研究

1 材料

1.1 仪器

SynergyTMH1全能酶标仪,Bio Tek;CO2细胞培养箱,Thermo Forma;ECLIPSE-TS100倒置相差显微镜,Nikon;YJ-1450医用净化工作台,苏州金燕净化设备厂;HIMAC高速离心机,HITACHI;Cryo 1℃程序细胞冻存盒,NALGENE Labware。

1.2 细胞株

人肝癌细胞株Hep G2,人肺癌细胞株A549,小鼠畸胎瘤干细胞株F9,人畸胎瘤干细胞株NCCIT:均来自于杭州华安生物技术有限公司;小鼠脾脏细胞和腹腔巨噬细胞由本实验分离,所用ICR品系小鼠购于浙江省医学科学院。

1.3 试药

铁皮石斛全草购于浙江台州铁皮石斛种植基地,经浙江大学生命科学学院张铭教授鉴定为铁皮石斛。

噻唑兰(MTT),Sigma;丝裂霉素C,Sigma;刀豆蛋白A(Con A),Sigma;1640培养基,Gibco;高糖DMEM,Gibco,胎牛和新生牛血清,杭州四季青生物公司;胰蛋白酶,Hyclone。

2 方法

2.1 铁皮石斛多糖的提取

取新鲜的铁皮石斛全草适量,清水洗涤除去杂质,100℃杀青后于60℃烘箱中烘干、粉碎,过60目筛,取其干燥粉末。用传统水提醇沉法提取铁皮石斛粗多糖。所提粗多糖用Sevage法脱蛋白:加入1/5倍体积氯仿:正丁醇(4∶1)混合液剧烈振摇20~30 min,3 000 r·min-1离心5 min,分去水层和溶液层交界处的变性蛋白质,重复4~5次;旋转蒸发仪减压浓缩、醇析、冷冻干燥得铁皮石斛多糖。

2.2 小鼠脾脏细胞及腹腔巨噬细胞的制备

脾脏细胞的制备:引颈处死小鼠,超净台内取出脾脏并用PBS清洗。用注射器芯轻轻挤压出脾细胞,过200目筛去除大块组织,所得细胞悬液用红细胞裂解液裂解红细胞,PBS清洗后加培养液重悬,台盼蓝染色检测细胞活力。

腹腔巨噬细胞的制备:引颈处死小鼠,超净台内剪开外层皮肤暴露腹膜。用注射器注入5 m L培养液,轻揉腹部数下后吸出腹腔内液体到离心管中,1 500 r·min-1离心5 min,2 m L无血清培养液重悬细胞。台盼蓝染色检测细胞活力。

2.3 铁皮石斛多糖对癌细胞Hep G2、A549、F9、NCCIT生长形态的影响

分别取对数生长期的Hep G2、A549、F9、NCCIT细胞,用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化,调整细胞密度分别至5×104个/m L、5×104个/m L、1×104个/m L、1×104个/m L,混匀后分别接种于6孔板,1.5 m L每孔,各接种2个孔(一个对照,一个给药)24 h后换液,对照孔换完全培养液,给药孔分别换含有0.5 mg·m L-1铁皮石多糖的完全培养液继,继续培养3~4 d,每天拍照记录Hep G2、A549、F9、NCCIT各自形态并分析。

2.4 铁皮石斛多糖对癌细胞Hep G2、A549、F9、NCCIT增殖的影响

将对数生长期的Hep G2、A549、F9、NCCIT细胞消化后分别以4×104个/m L、4×104个/m L、1×105个/m L、1×105个/m L密度接种于96孔板,100μL每孔,培养24 h后更换成含铁皮石斛多糖浓度分别为0(对照)、25、50、100、200、400μg·m L-1的培养液。每个浓度做4个重复。同时设置无细胞的空白对照组,阳性对照组加5μg·m L-1的丝裂酶素C。继续培养48 h后按已报道方法进行MTT实验,在490 nm下用酶标仪测定各孔吸光值。以各个样品组的吸光度值减去空白对照孔的吸光度值作为各组真实的吸光度值以反映细胞的增殖水平。

2.5 铁皮石斛多糖对小鼠脾脏细胞及腹腔巨噬细胞增殖的影响

取脾脏细胞和腹腔巨噬细胞接种于96孔板中,密度分别为1×106个每孔、5×105个每孔。培养24 h后更换成含铁皮石斛多糖浓度分别为0(对照)、25、50、100、200、400μg·m L-1的培养液。每个浓度做4个重复,同时设置无细胞的空白对照,脾脏细胞组阳性对照组添加5μg·m L-1Con A。继续培养48 h后如上进行MTT实验。

2.6 统计学处理

应用SPSS 20软件对实验数据进行统计分析,各变量以实验组±S表示,采用t检验进行组间比较,所有绘图分析应用Origin8.0软件生成。

3 结果

3.1 铁皮石斛多糖对癌细胞Hep G2、A549、F9、NCCIT生长形态的影响

如图1所示,对照组(Control)和给药组(Administration)每天拍照所记录的细胞形态。从细胞形态图上明显可以看出与对照组相比,给药组的细胞形态较差,长势较慢,有较多细胞死亡。此实验结果初步说明铁皮石斛多糖可以抑制癌细胞Hep G2、A549、NCCIT和F9的生长,促进其凋亡;具有一定的抗癌活性。

3.2 铁皮石斛多糖对癌细胞Hep G2、A549、F9、NCCIT增殖影响

MTT实验结果显示铁皮石斛多糖浓度在100~400μg·m L-1对癌细胞Hep G2、A549、NCCIT和F9均有较显著的抑制作用,如表1、表2、表3和表4所示:其抑制率在20%~50%之间,且对Hep G2、A549、和NCCIT细胞之间的抑制效果并无显著差异;对于F9细胞,其抑制作用相对稍弱。

*P<0.05;**P<0.01;与对照组比较。

*P<0.05;**P<0.01;与对照组比较。

*P<0.05;**P<0.01;与对照组比较。

*P<0.05;**P<0.01与对照组比较。

3.3 铁皮石斛多糖对小鼠脾脏细胞增殖的影响

如表5所示:铁皮石斛多糖在25~200μg·m L-1的浓度范围内可以显著促进小鼠免疫脾细胞的增殖,100μg·m L-1时促进效果最为显著,可达48.44%。

*P<0.05;**P<0.01;与对照组比较。

3.4 铁皮石斛多糖对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响

如图2所示,铁皮石斛多糖在实验浓度25~400μg·m L-1范围内,对小鼠腹腔巨噬细胞的生长无显著影响。

图2不同浓度铁皮石斛多糖协对小鼠腹腔巨噬细胞细胞作用(mean±S.D.,n=4)Fig.2 Effect of Dendrobium officinale polysaccharide on proliferation of macrophages(mean±S.D.,n=4)

4 结论

近年来,天然多糖的研究逐渐受到人们重视,多糖类作为一类信息物质参与机体分子和细胞识别,在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面起着重要作用[10]。关于石斛多糖的研究亦已有不少报道。本次实验主要通过细胞形态观察和MTT法初步研究了铁皮石斛多糖对癌细胞A549、Hep G2、F9和NCCIT及小鼠脾脏免疫细胞和腹腔巨噬细胞的作用。此实验结果初步证实铁皮石斛多糖可以抑制A549、Hep G2、F9和NCCIT的生长,具有一定的抗癌活性。MTT免疫实验结果显示,铁皮石斛多糖在25~200μg·m L-1的浓度范围内可以显著促进小鼠免疫脾细胞的增殖,而对小鼠腹腔巨噬细胞无显著影响。此实验结果说明,铁皮石斛多糖具有一定的免疫活性,特别是对脾细胞相关的体液免疫有较显著的增强作用,而对腹腔巨噬细胞相关的非特异性免疫效果影响不大。

本次实验初步证实了铁皮石斛多糖具有一定的抗癌活性及免疫活性(主要是脾细胞相关的体液免疫),然而对于其抗癌作用的具体机制尚未进行相关研究,有关免疫活性的机理也需进一步的探索,二者之间是否存在某种联系,也需进一步的实验研究,同时,这也是本实验未来的研究方向之一。

摘要：研究了铁皮石斛多糖的抗癌及免疫活性。水提醇沉法提取铁皮石斛多糖,将其作用于癌细胞株(HepG2、A549、F9、NCCIT)和小鼠脾脏细胞、腹腔巨噬细胞,观察细胞形态变化,并用MTT法分析其对细胞增殖的作用。结果表明:铁皮石斛多糖能抑制癌细胞的增殖并促进脾脏细胞生长,铁皮石斛多糖具有一定的抗癌活性及免疫活性。