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论文题目：中药蟾毒灵（Bafulin）相关文献的文本计量学分析以及蟾毒灵在弥漫大B淋巴瘤中的作用及分子机制的研究

摘要：目的:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）是目前我国成人淋巴组织肿瘤中最常见的、最恶性的肿瘤之一,DLBCL具有浸润性生长快、恶性程度高、预后差的特点。因此,迫切需要新的药物或治疗策略来提高DLBCL患者的生存率或延缓复发。蟾蜍灵（Bufalin,BF）是从中药蟾酥中分离出来的单体化合物,研究报道对多种癌症均有抗肿瘤的作用。然而,相关的文献分析提示蟾毒灵对DLBC生长的影响的报道较少,其作用机制尚未完全阐明。因此本文首先通过蟾毒灵有关中英文文献进行相关文献计量学、生物信息学分析,明确蟾毒灵目前的研究现状,并分析研究热点,对蟾毒灵目前研究文献进行全面系统的评估,为课题的选择提供指导。随后我们通过生物信息学、分子生物学、生物化学等方法手段,阐明蟾毒灵在DLBCL中的作用及机制,为蟾毒灵在临床中的应用提供理论依据。方法:第一部分:有关蟾毒灵（Bufalin）相关文献的文本计量学分析。1.数据资源与搜索策略:中文文献:检索CNKI数据库中所有的收录的有关蟾毒灵为主题词的中文文献,时间段设置为2000年1月1日至2020年12月31日。利用数据库中自带的相关分析功能,对目前蟾毒灵的中文研究现状进行分析。英文文献:检索2000年1月1日至2019年12月31日,Pubmed数据库中所有的收录的有关蟾毒灵（Bufalin）相关文献,检索式为（“Bufalin”）,将检索结果以“.xml”格式储存,并对文献进行筛选与质量控制。2.英文文献数据提取和矩阵设置:下载数据后,使用书目项目共现矩阵生成器（BICOMB）软件创建共现矩阵。3.高频主题词的双聚类分析:利用g CLUTO软件对上述搜索到的高频主题词,进行双聚类分析。4.战略分析图的建立:根据主题词的中心性和密度绘制主题图,利用Graph Pad Prism 7软件生成战略图。X轴代表中心性或外部内聚力指数,Y轴代表内部内聚力指数或密度,双聚类分析的结果被分配到四个象限。5.社会网络分析（SNA）:利用Ucinet6.0软件,进行数据网络分析。6.Bufalin相关的关键基因及其通路分析。使用“Bufalin”作为搜索词,从Pub Med数据库中提取2000年1月1日至2019年5月31日期间发表的文献。摘要中提到的基因和蛋白质由生物医学命名实体识别器（ABNER）软件识别和标记。7.生物信息学分析。GO分析由webgestat网站进行（http://www.webgestatt.org/option.php）.利用DAVID网站（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）进行KEGG的分析。利用STRING数据库构建了蛋白质相互作用网络（http://www.string-db.org/）。第二部分:蟾毒灵在DLBCL中的作用及作用机制的探讨。1.通过CCK-8细胞增殖实验,检测蟾毒灵对DLBCL细胞的生长抑制作用。2.通过DAPI染色以及流式细胞术检测蟾毒灵对DLBCL细胞凋亡的影响。3.通过流式检测细胞周期,观察蟾毒灵对DLBCL细胞周期的影响。4.利用Transwell法检测蟾毒灵作用后的DLBCL细胞的迁移能力。5.利用生物信息学及分子对接,预测蟾毒灵在DLBCL中的靶点。6.随后利用免疫荧光实验、Western Blot、免疫组化、细胞内钙离子荧光检测、si RNA转染、实时定量PCR以及动物实验的验证,阐明蟾毒灵在DLBCL中的分子作用机制。结果:第一部分:1.2000年至2020年,共有147篇与蟾毒灵相关的中文文章发表,其中在2019年达到高峰,副主题词分析中凋亡和增殖作用排名靠前,提示蟾毒灵的抗肿瘤作用可能和细胞增殖和凋亡相关。学科分析中,主要分布在中药、肿瘤、泌尿科学,在相关机构发表关于蟾毒灵的文献中,上海中医药大学、第二军医大学、山东中医药大学发表相关文献较多。发表的期刊中,排名靠前的依次是,中国人民解放军海军军医学报、中草药、中国中药杂志、现代肿瘤医学、中成药,上海中医药大学学报。在相关的副主题词上,对蟾毒灵的作用研究较多的分别为凋亡、毒理、抑制作用、细胞周期。对主题词及副主题词进行矩阵分析,发现细胞凋亡、抗肿瘤作用、作用机制、细胞增殖排名靠前。而矩阵分析结果也提示在相关的肿瘤报道中,胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、骨肉瘤中均有蟾毒灵的有关研究报道,在伯基特淋巴瘤中有一篇报道,在DLBCL的中文文献未见报道。2.英文文献检索中,共有474篇论文符合上述搜索标准。与蟾毒灵相关的文献的研究领域主要是药理学、肿瘤学、化学和生物化学分子生物学。中国对蟾毒灵的相关研究的贡献最大,占发表论文的70%以上。美国和日本的论文数量分别排在第二和第三位。21种期刊发表了超过5篇以上的有关蟾毒灵的文章,包括“ONCOLOGY LETTERS”“EVIDENCE BASED COMPLEMENTARY AND ALTERNATIVE MEDICINE”“INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY”。英文文献有一篇关于蟾毒灵在淋巴瘤中的报道。3.一共富集了50个高频主题词。通过双聚类分析,主题词共分为5大类“Drug therapy in related tumors”“Relevant descriptive information of bufalin”“Mechanisms of drug effects”“Pharmacological information of bufalin”“Metabolism related researches on bufalin”。这五大类中,关于蟾毒灵的机制和治疗,是未来主要的研究方向。4.蟾毒灵的关键基因的分析。CASP3、JUN、VEGFA、AKT1、MAPK8、MMP9、MAPK3、MAPK1、FOS、MMP2是相互作用次数最多的枢纽基因。相关的KEGG通路分析,显示了20个最重要的蟾毒灵相关通路。GO分析结果表明,生物调控、代谢过程、刺激反应是蟾毒灵相关基因的主要生物学进程。就分子功能而言,这些基因的重要功能包括蛋白质结合、离子结合、核酸结合和核苷酸结合。第二部分:1.蟾毒灵对DLBCL细胞具有,生长抑制作用并且呈现剂量、时间依赖性。蟾毒灵对SU-DHL-10细胞的24h IC50为5nmol/l,48h IC50为3.7nmol/l;对SU-DHL-6细胞的24h IC50为20nmol/l,48h IC50为7nmol/l。2.DAPI染色提示伴随蟾毒灵的浓度增加,可以看到DLBCL细胞出现凋亡的形态学变化,表现为染色质浓缩、核碎裂和凋亡小体形成。3.流式细胞学也提示蟾毒灵促进了DLBCL细胞凋亡,相关凋亡蛋白中,Bcl-2和Mcl-1表达的剂量依赖性降低,PARP、Bax和C-caspase3的表达显著上调。4.流式细胞仪检测DLBCL细胞周期阻滞。结果表明随着药物浓度的增多,DLBCL细胞的G2M期细胞增多,而且这个过程具有剂量依赖性。5.Transwell实验提示蟾毒灵可抑制DLBC细胞的迁移。6.生物信息学分析提示蟾毒灵可能调节钙离子通路-NFATC1的信号通路,分子对接提示蟾毒灵可与NFATC1相互作用。7.相关数据库证实NFATC1在DLBCL淋巴瘤中差异表达,并与不良预后相关。免疫荧光提示NFATC1主要在核内表达。8.si RNA进行敲低NFATC1后细胞增殖降低,凋亡增多,生物信息学预测NFATC1可能影响c-MYC,并且WB实验证实敲低NFATC1后c-MYC表达降低。9.钙离子分析提示,蟾毒灵抑制了细胞内钙离子的分布。因此蟾毒灵在DLBCL中的作用机制可能通过Ca2+/NFATC1/c MYC信号通路发挥抗肿瘤作用。10.体内小鼠肿瘤试验证实蟾毒灵可显著降低小鼠体内肿瘤生长,免疫组织化学显示,NFATC1、c MYC和Ki-67的表达降低。结论:1.本研究首次将文本挖掘与生物信息学相结合,对蟾毒灵相关文献进行综合分析。结果表明,关于蟾毒灵的机制和治疗的方面的探索大家关注的重点。蟾毒灵在多种肿瘤中均具有抗肿瘤的作用,报道最多的是诱导细胞凋亡的作用,其中凋亡相关基因Caspase3的研究最为充分。蟾毒灵可通过PI3K/AKT、Hedgehog、MAPK-JNK、Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad、整合素信号通路和NF-KB等多种信号途径抑制癌细胞的增殖、侵袭和转移。通过对近20年来有关蟾毒灵的文献进行定量分析和统计,对蟾毒灵的研究现状和抗肿瘤机制进行了评价,提示蟾毒灵在DLBCL中的研究报道较少,为我们的课题选择提供了研究方向。2.结果证实蟾毒灵在体外和体内均能有效的抑制DLBCL癌细胞的生长。其可能的机制是通过调控Ca2+/NFATC1/c MYC通路,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞于G2/M,抑制细胞增殖。我们的结果表明,蟾毒灵可以作为一种潜在的治疗药物来提高DLBCL患者的生存率。

关键词：蟾毒灵;分子对接;弥漫大B细胞淋巴瘤;文献计量学;生物信息学

学科专业：肿瘤学

摘要

Abstract

英文缩略语

第一部分:中药蟾毒灵(Bafulin)相关文献的文本计量学分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 数据资源与搜索策略

2.2 数据提取和矩阵设置

2.3 高频主题词的双聚类分析

2.4 战略分析图的建立

2.5 社会网络分析(SNA)

2.6 Bufalin相关的关键基因及其通路分析

3 结果

3.1 关于蟾毒灵中文文献的分布特点及研究现状

3.2 英文文献中关于蟾毒灵的文献分布特点及研究热点分析

3.3 蟾毒灵的策略图分析

3.4 蟾毒灵的知识结构和象限坐标

3.5 蟾毒灵的关键基因的分析

3.6 结合文献总结蟾毒灵可能影响的信号通路

4 讨论

5 结论

第二部分:蟾毒灵(Bufalin)在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制的研究

1 前言

2 材料与方法

2.1 试剂和细胞

2.1.1 研究药物

2.1.2 细胞系

2.1.3 其他主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 细胞复苏

2.1.6 细胞传代

2.1.7 细胞冻存

2.2 CCK-8 细胞存活实验

2.2.1 原理

2.2.2 步骤

2.3 DAPI染色检测细胞凋亡

2.3.1 原理

2.3.2 步骤

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

2.4.1 原理

2.4.2 步骤

2.5 流式检测细胞周期

2.5.1 原理

2.5.2 步骤

2.6 Transwell法检测细胞迁移能力

2.6.1 原理

2.6.2 检测步骤

2.7 免疫荧光实验

2.7.1 原理

2.7.2 步骤

2.8 Western Blot

2.8.1 原理

2.8.2 步骤

2.9 免疫组化

2.9.1 原理

2.9.2 步骤

2.10 细胞内钙离子荧光检测

2.10.1 原理

2.10.2 步骤

2.11 siRNA转染

2.12 RNA的提取和实时定量PCR(q RT-PCR)

2.12.1 步骤

2.12.2 PCR过程

2.13 分子对接

2.13.1 原理

2.13.2 步骤

2.14 动物成瘤实验

2.15 生物信息学分析

2.16 统计学分析

3 研究结果

3.1 蟾毒灵抑制DLBCL细胞的生长

3.2 蟾毒灵促进DLBCL细胞系的凋亡

3.2.1 DAPI染色检测凋亡结果

3.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡结果

3.2.3 WB检测凋亡相关蛋白的结果

3.3 蟾毒灵阻滞细胞周期

3.4 蟾毒灵抑制DLBCL细胞系迁移

3.5 蟾毒灵药物作用靶点的预测

3.6 预测的靶点NFATC1在DLBCL中的作用

3.7 蟾毒灵抑制DLBCL的分子作用机制

3.8 蟾毒灵在体内抑制了小鼠肿瘤的生长

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 中药蟾毒灵(bufalin)的抗肿瘤作用及其机制研究进展

参考文献

致谢