亲和层析在蛋白质纯化中的应用

2022-09-11

亲和层析 (affinity chromatography, AC) 是一种简单易操作的生物大分子分离纯化的重要方法之一, 它的基本原理是将与待分离纯化的目标产物具有亲和力的亲和配体固定在载体上 (比如说, 常用载体有琼脂糖、壳聚糖、纤维素、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等) , 利用目标产物与亲和配体之间的特异性亲和力, 使得亲和配体选择性地结合目标产物, 从而达到分离纯化的目的。亲和层析原理如图1所示。

亲和层析主要包括四个步骤: (1) 制备亲和层析柱; (2) 样品裂解液与亲和层析柱结合; (3) 将杂质洗出; (4) 洗脱目标产物。亲和层析因具有简单易操作、选择性高、载量大以及分离纯化的蛋白纯度较高等优点, 因而被广泛应用于在生物大分子的纯化, 如结合蛋白、酶、抗体、抗原、DNA、RNA、病毒、细胞等生物大分子的纯化[1]。本文就亲和层析在近几年蛋白质纯化中的应用作一介绍。

1 亲和层析的类型

亲和层析的类型主要有:生物亲和层析 (BAFC) 、免疫亲和层析 (IAFC) 、固定化金属离子亲和层析 (IMAC) 、拟生物亲和层析 (BMAFC) 以及特殊基团亲和层析等[2]。科研人员可以根据自己实验的实际需要选择相应的亲和层析方法来达到实验目的。

2 亲和层析在蛋白纯化中的应用

蛋白的分离纯化是蛋白组学研究中一个非常重要的环节, 蛋白质能否有效的分离纯化关系到整个实验的成败。

2011年Arnold等[3]用有机小分子1A4, 2A8, 2A9以及2A10作为亲和配体, 与N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖凝胶4B (Sepharose 4B) 共价结合制备成亲和层析柱, 纯化了不同的抗体, 其中以2A10作为亲和配体所制得的亲和层析柱纯化得到的抗体产率大于90%, 纯度大于80%, 这与以蛋白A为配体亲和纯化的抗体的产率和纯度相当, 然而小分子为配体的亲和层析柱却解决了以蛋白A为配体易污染、不稳定的难题。

乙酰胆碱酯酶维持乙酰胆碱在动物体内平衡起着非常重要的功能作用, 对乙酰胆碱酯酶的研究有着极其深远的意义。2011年Askar等[4]以伴刀豆球蛋白和滕喜龙 (一种抗胆碱酯酶药) 作为配体, 分别将它们偶联到琼脂糖凝胶4B上和琼脂糖凝胶6B制成亲和层析柱, 然后从羊的肝脏中分离纯化了乙酰胆碱酯酶, 纯化倍数达到842倍, 且酶的活性保持良好。

2011年Yari等[5]应用对结核分枝杆菌A60抗原具有特异性免疫能力的抗体作为亲和配体, 将其偶联到经溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B上制备成亲和层析柱, 成功地纯化了结核分枝杆菌A60抗原。

与其它亲和配体相比较, 染料亲和配体有着价格低廉、稳定性好等优点。2013年Silva等[6]以氨基方酸菁染料为亲和配体与交联琼脂糖凝胶6B (Sepharose CL 6B) 偶联制成亲和层析柱, 并用溶菌酶、ɑ-糜蛋白酶以及胰蛋白酶三种酶的混合物对该亲和层析柱的分离纯化效果进行了考察, 结果表明, 通过改变硫酸铵在洗脱液中的浓度, 可以对三种酶进行很好的分离纯化。

2013年Edupuganti等[7]将T-2毒素 (T-E toxin) 共价结合到琼脂糖凝胶上制成所需要的亲和层析柱, 从蛋黄中分离纯化了免疫球蛋白 (Ig Y) , 并用凝胶电泳对纯化了的Ig Y的纯度进行了表征。

2014年Baieli等[8]以染料Yellow HE-4R为亲和配体, 将其偶联到琼脂糖凝胶4B上制备成亲和层析柱, 从牛乳清中纯化了乳铁蛋白, 产率为71%。同年, Baieli等[9]同样以Yellow HE-4R为亲和配体, 将亲和基质从琼脂糖凝胶4B换为壳聚糖微球 (chitosan mini-spheres) 制成亲和层析柱, 仅通过一步简单的亲和纯化就从牛乳清中纯化了乳铁蛋白, 产率从71%提高至77%, 而且乳铁蛋白的纯度超过了90%。

3 展望

随着蛋白组学研究的不断深入, 亲和层析因具有简单易操作、载量大、选择性高等优点, 我们有理由相信亲和层析方法在未来的蛋白的分离纯化中仍将扮演非常重要的角色。

摘要：亲和层析方法是一种简单而重要的生物大分子纯化方法, 该方法在生物学研究中得到广泛的应用, 例如, 抗体、抗原、酶、DNA、RNA等生物大分子的纯化;同时, 亲和层析方法在鉴定有机小分子作用的靶标蛋白也得到很好的应用。本文主要介绍了亲和层析在近几年蛋白质纯化中的应用, 最后展望了该方法在未来的应用前景。

关键词：亲和层析,蛋白质,纯化,应用