高压诱变啤酒酵母及突变株SDS-PAGE电泳分析

高压技术在微生物方面上应用起步虽晚, 但成果显著。人们进行了 (超) 高压对微生物的影响及其诱变效应的探讨[1]。本文探讨高压对啤酒酵母致死率的影响, 选择最佳处理参数诱变酵母并获得突变株[2], 以SDS-PAGE技术从蛋白质水平上探讨其变异性, 研究其作为一种新的诱变育种方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

吉林大学生命科学学院实验中心保存菌种 (Saccharomyces cerevisiae) 。

1.1.2 试剂

β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、蛋白Marker等, 北京鼎国生物技术有限公司;常规试剂为国产分析纯。

1.1.3 仪器

高压压力机, 上海大隆机器厂;高速离心机, Eppendorf;电泳仪, 北京六一等。

1.1.4 培养基

固体培养基:麦芽汁培养基, 12°Bx麦芽汁, 加2%琼脂。液体培养基:12°Bx麦芽汁。

1.2 方法

1.2.1 高压处理

取对数生长期菌液5m L, 转入灭菌包装袋内进行高压处理。采用4个压力梯度100MPa、200MPa、300MPa、400MPa保压时间20min;300MPa下保压时间5min、10min、15min、20min、25min、30min。取高压处理后菌液1m L以10倍梯度稀释, 0.1m L图布于麦芽汁平板上 (每种处理条件做3个平行) , 与稀释度相同但未经高压处理的菌体对比计算致死率。

1.2.2 筛选变异菌株

取300MPa, 保压时间15min高压处理菌液, 高温筛选变异菌株, 连续7次传代、检测, 得到变异株MS-3。

1.2.3 啤酒酵菌蛋白提取

啤酒酵母菌种一环于三角瓶中28℃静置培养, 至OD600=2.0;在冰浴上取OD600=2.0的培养酵母液5m L转移到一装有2m L, 50mmol/L, Tris-HCl (p H7.5) 、10mmol/L叠氮化钠溶液的离心管中, 离心机离心沉淀菌体;弃上清, 用30u L, ESB缓冲液 (2%SDS, 80mmol/LTrisHCl, p H6.8, 10%甘油, 1.5%二巯基苏糖醇DTT, 0.1mg/m L溴酚蓝) 悬浮菌体;快速转入1.5m L离心管中, 在100℃下保温3min, 蛋白酶失活后, 样品存放于-20℃;加入0.1g的玻璃珠, 或装入玻璃珠至液体刚好浸没, 剧烈振荡混合2min;加入70u L ESB缓冲液, 稍加振荡, 置100℃保温1min;取5~20u L抽提液上样进行SDS凝胶电泳[3]。

1.2.4 SDS-PAGE分析

将所提取的啤酒酵母蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 垂直电泳装置配胶, 15%分离胶, 5%浓缩胶, 样品100℃加热3min使蛋白变性, 加样后在凝胶上加8V/cm电压, 待前沿进入分离胶后电压提高到15V/cm继续电泳, 用时约4h电泳完毕, 取下凝胶做好标记, 考马斯亮蓝R-250染色过夜, 脱色液脱色至条带清晰, 对凝胶拍照, 凝胶用20%甘油保存。

2 结果分析

2.1 高压致死曲线绘制

高压处理啤酒酵母, 结果见图1与2。

结果可知, 在保压时间为20min下, 随着压力的增高, 菌体致死率逐渐增高, 当压力达到4 0 0 M P a时, 菌体几乎全部致死。在300MPa压力下, 随着保压时间的增长, 菌体致死率逐渐增高, 当保压时间达到30min时, 菌体几乎全部死亡。

故选择压力300MPa, 保压时间为15min为最优诱变参数。诱变筛选出变异株MS-3。

2.2 啤酒酵母对照株与突变株蛋白S D S-PAGE分析

提取啤酒酵母蛋白质, 并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 分别配制15%和10%两个浓度的分离胶电泳。

10%分离胶时, MS-3较对照株多出一条大小大约为50KD的条带, 15%分离胶时, 变异株MS-3比对照株多出两条条带, 大小分别是大约50KD和40KD。此结果的可能原因是压力处理啤酒酵母后, 诱导了某些基因的表达, 促进了某些蛋白例如压力诱导蛋白的合成 (PIPs) , 使得筛选出的变异酵母菌株MS-3具有一定的耐高压耐高温特性, 在生理生化上与对照株相比表现出某些特性。

3 结语

分析压力诱导啤酒酵母变异的机理, 研究不同大小压力和相同压力不同保压时间对啤酒酵母致死率和诱变率之间的关系, 结合所选酵母菌的生长特性, 确定最佳的高压处理酵母菌条件为高压300MPa, 时间15min, 为高压诱变育种工作奠定一定的理论基础。筛选出突变菌株MS-3并对其与出发株做对比, SDS-PAGE分析结果揭示了高压对酵母的影响, 在蛋白表达上的一些变化。结果显示变异株比出发株多出50KD和40KD大小条带。高压处理使酵母基因组DNA发生了插入、缺失、碱基突变等, 高压力诱导了某些基因的表达, 促使某些蛋白例如压力诱导蛋白的合成[4]。本研究证明高压可以作为啤酒酵母一种诱变手段, 为工业菌种的诱变选育开辟一种新途径。

摘要：本文运用现代高压生物技术, 选育优良啤酒酵母菌种。分析了高压处理对啤酒酵母的生长影响, 研究不同压力, 不同保压时间对啤酒酵母致死率的影响, 考察高压与啤酒酵母变异之间的关系。确定300MPa, 保压时间为15min时, 啤酒酵母具有较高的突变率, 以此条件处理啤酒酵母, 并以高温筛选, 获得耐高压耐高温变异菌株MS-3。并对变异菌株蛋白质进行SDS-PAGE分析。

关键词：高压,啤酒酵母,菌种选育,SDS-PAGE

参考文献

[1] 王岁楼, 等.超高压在工业微生物诱变选育中的应用初探[J].中国生物工程杂志, 2005, 25 (6) .

[2] 王治权, 陈远河, 尚水英.啤酒酵母使用技术 (第11版) [M].上海科学普及出版社, 1990, 5.

[3] 陈思耘, 萧熙佩.酵母生物化学 (第11版) [M].山东科学技术出版社, 1990, 1.

[4] SHEN Sile, WANG Zhenwei.Alter-ations in DNA methylation and ge-nome structure in two rice mutant lines induced by high pressure[J].中国科学C辑 (英文版) , 2006 (2) .