聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法

聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法（通用3篇）

篇1：聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法

聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法

品种纯度在种子生产、加工、贮藏及经营贸易中具有重要意义和应用价值,纯度的高低在农业生产中对作物产量和品质都有很大影响.

作 者：丁向荣 赵玉平作者单位：乌兰察布市种子管理站,内蒙古,集宁,01刊 名：内蒙古农业科技英文刊名：INNER MONGOLIA AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY年，卷(期)：“”(2)分类号：Q814关键词：

篇2：聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法

一、凝胶片从玻璃板上取不下来

㈠原因主要有玻璃板清洗不干净, 电泳槽两边电解液加入量太少, 胶板受热不匀。

㈡解决办法玻璃板用洗洁精清洗干净, 不挂水珠, 用1次～2次后可用疏水硅烷洗擦玻璃板表面, 调整电泳槽两边电解液体积, 确保胶板温度均匀。

二、分离胶胶面倾斜、不平或产生气泡

㈠原因主要是人为操作失误, 玻璃板没装水平造成倾斜, 用正丁醇分界时注射器直对胶面急剧推注, 造成胶面不平, 灌胶时太急太快混入气泡。

㈡解决办法应保持一定的速度连续加注, 万一产生气泡, 可震动电泳槽或用长号针头挑出气泡。

三、凝胶不聚合或聚合太慢

㈠原因试剂配比不正确, 试剂纯度不够, 成胶太稀, 试剂放置过久而失效, 室温偏低, 凝胶聚合变慢。

㈡解决办法严格按规定的试剂比配制试剂, 对达不到要求纯度的试剂进行纯化。溶液应贮存于棕色试剂瓶于4℃冰箱保存, 一般不超过一周。室温低于15℃时可通过加电暖气、空调等调节。

四、酶谱谱带不清晰或缺失

㈠原因制样方法不当, 样品提取液配制时间过长, 样品浸提后在室温下放置太久, 使酶活性降低, 点样量太少或浮出, 样品浸提液不澄清, 造成脱尾, 电解液重复使用次数过多, PH值及离子浓度改变造成扩散。

㈡解决办法按要求制样, 避免逸撒、更换提取液, 及时将样品置于冰箱保存。点样要快速适量、均匀一致。样品提取后要按要求离心静置, 电解液以使用1次～2次为宜, 如不连续使用而间隔较长时, 应及时更换。

五、电泳时指示剂移动不整齐或缓慢

㈠原因制胶不均匀, 点样不匀, 电极接触不好, 电解液渗漏造成断路, 凝胶缓冲液、电解液PH梯度不合要求。

㈡解决办法制胶时溶液要充分混匀;点样量力求保持一致;检查电路接触;检查电解液是否渗漏, 及时补加电解液;按要求配置缓冲液和电解液并测定调节PH值。

六、染色后胶片底色太深或太浅不便鉴定

㈠原因染色液配比不当, 染色时间过长, 底色太重;染色时间太短或样品提取液酶活性降低, 造成着色太浅。

篇3：聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定种子纯度故障处理及预防办法

然而开设聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳实验一般需要八个学时, 然而原则上要求本科医学生生物化学实验在四学内完成, 产生了教学要求与现实条件的矛盾冲突, 为了解决这一难题, 针对聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳实验, 我院采用“倒叙实验法”, 成功完成了该实验的教学。

聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳实验按照正常的操作顺序:1、制备分离胶;2、制备浓缩胶;3、准备电泳槽;4、上样;5、电泳;6、拨胶;7、固定、染色、漂洗;8、观察结果。“倒叙实验法”就是将该实验分段后同时进行, 具体操作如下:

本实验室每周开设一个学生实验, 每个实验半天 (即四学时) 一轮, 第一轮实验所需要的凝胶由实验室教师准备就绪, 往后每一轮实验所需的凝胶由上一轮实验的学生制备。

一、试剂准备

1、单体丙烯酰胺 (Acrylamide, Acr) 和甲叉双丙烯酰胺 (N, N’-Methylene-bisacrylamide, Bis) :

分析纯的Acr利Bis, 在水溶液中, Acr可与交联剂Bis通过自由基引发, 发生聚合反应产生聚丙烯酰胺凝胶。Acr和Bis是神经性毒剂, 操作时应在通风柜中进行, 避免吸入尘埃。Acr和Bis贮存液易于水解生成丙烯酸和NH3而失效, 贮存于4℃冰箱可延缓水解, 但也只能保存1～2个月。

2、TEMED-四甲基乙二胺:

做为加速剂, 加快引发剂释放自由基的速度;应避免冰箱保存。

3、过硫酸铵:

做为引发剂, 提供原始自由基, 通过自由基传递, 使单体成为自由基, 引发聚合反应;过硫酸铵液贮存冰箱一周内有效。

4、1～6号贮存液及电泳缓冲液

5、染色液:0.1%溴酚兰液

6、洗脱液:7%醋酸

7、新鲜血清

8、蒸馏水

二、“倒叙实验法”操作

1、准备电泳槽

已制备好的胶管用滤纸条吸去上层覆盖水, 并用滤纸吸去胶管底部的蔗糖液。用滴管吸取缓冲液将胶管上端和底部的空气排净, 同时洗去胶管底部残留的蔗糖溶液。电泳槽的上槽要保证密封, 不能漏液。上槽和下槽的缓冲液必须淹没胶管和导线塔。

2、上样

用微量加样器加样10～30ul。在接近浓缩胶的位置 (切勿戳破浓缩胶) 靠玻璃管壁缓慢挤入样品, 注意抽出tip头后再松微量加样器, 否则会导致样品被回吸。上样后, 不可移动电泳槽, 否则会导致样品漂浮。

3、电泳

上槽为负极, 下槽为正极。首先要用低电流预电泳三分钟, 约1.5mA/管, 三分钟后约3mA/管, 电泳约1小时。电流不能过大, 否则会产热造成升温, 使分离失败。在电泳1小时的过程中制备凝胶。

4、制备分离胶

小橡胶塞内必须滴入1滴40%蔗糖, 隔离凝胶与橡胶塞 (与橡皮接触部分凝胶不易聚合) , 并使凝胶底面保持平整。用毛细滴管吸取分离胶的过程中, 不可带入气泡, 灌胶过程中要沿管壁从底部缓慢加入凝胶, 亦不能带入气泡, 灌胶约8cm高。胶面上加少许蒸馏水可压平胶面, 同时隔绝空气, 防止过硫酸铵氧化。加水时要缓慢, 切忌滴状坠入。然后将胶管垂直静置, 使之进行聚合反应, 聚合过程中, 原来加入水层出现的折射界面逐渐消失, 15分钟左右以后重新出现折射界面时, 表明凝胶已经聚合, 再静置约10分钟使之聚合完全。

5、浓缩胶制备

灌胶前要用滤纸条吸干上层覆盖水, 如分离胶制备类似缓慢加入凝胶后加入少许蒸馏水, 浓缩胶大约1cm高, 垂直静置约15分钟左右, 浓缩胶呈乳状时表明凝胶已经聚合。完成凝胶制备后收集起来, 留待下一轮实验用。

与此同时, 电泳槽中示踪染料已迁移至凝胶柱的下端附近或已迁至胶管长达3/4距离时, 即可停止电泳, 关闭电源, 取出胶管。上槽缓冲液可保留作为下一轮实验的下槽液再行使用, 下槽液不再使用, 且上下槽缓冲液不能混合或互换, 因下槽中混有催化剂及氯离子, 若换作上槽液, 将影响电泳结果。

6、剥胶

一般剥胶是从浓缩胶端开始, 因为浓缩胶端没有蛋白质区带分布。剥胶时的要点是不要损伤凝胶柱表面。用一长针头注射器 (针头长约6cm) , 吸满蒸馏水为润滑剂, 把针头插入玻璃管内壁和凝胶柱表面之间, 缓缓旋转玻管, 注意要一边注入蒸馏水, 一边使针头慢慢呈螺旋式推进, 靠水流压力和润滑力将玻管内壁和凝胶分开。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力, 将凝胶柱完整的压出玻璃管。

7、固定与染色

为了防止凝胶内分离成份扩散需进行固定, 将剥出的凝胶柱浸泡在7%乙酸或1.5%三氯醋酸溶液中约3分钟即可 (也可在染色的同时进行固定) , 用0.1%溴酚兰碱性液直接染色3分钟, 注意将染色液回收。用洗脱液 (7%醋酸) 漂洗脱色, 去除凝胶中非特异性吸附的染料, 让背景呈浅色或无色, 使区带清晰, 也便于进一步的定量分析 (光密度计扫描测定) 。

8、观察结果

仔细观察, 描出血清电泳区带图谱, 确定清蛋白有无异常。聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳实验运用“倒叙实验法”在我院已通过了四年的实践, 在顺利完成本实验的全面教学的同时, 由原来所需的八个学时缩短成为四个学时, 既满足的人才培养的教学需要, 又克服了学时不足的现实条件, 为培养出能承担医学发展重任的高素质创新型医学人才奠定良好基础。

摘要：面向我院本科医学生开设聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳实验是创新人才发展的需求, 受到了学时不足的限制, 开设难度大, 为了解决这一难题, 我院运用了“倒叙实验法”合理缩短了学时, 科学的开设这一综合性实验。本文就“倒叙实验法”进行了全面的阐述。

关键词：聚丙烯酰胺凝胶,盘状电泳

参考文献

[1]查锡良.生物化学第7版[M].北京:人民卫生出版社, 2008.

[2]潘文干, 何旭辉, 万恂恂.生物化学第6版[M].北京:人民卫生出版社, 2009.