论耳聋基因突变位点检测筛查的方法分析

据统计结果显示[1], 我国聋哑人占全国残疾人总数的1/3, 全国一共有两千多万聋哑人, 是目前我国一个较为特殊的群体[1]。耳聋是临床上比较常见的遗传病, 也是影响人类生活及其健康比较常见的疾病。因为自身的疾病, 在现实中聋哑人极少能和健康人结婚生活, 但是在聋哑人这个群体当中, 因为相同的文化背景和共同的语言, 逐渐的形成了“聋与聋”的婚配形式, 这样的话也能增加遗传的几率, 令我国聋人的出生率直线上升[2]。那么应该怎样降低或者是预防这些聋儿的出生率, 成为目前社会应该重视的问题, 为了探讨和分析运用基因芯片法检测耳聋患者人群中的突变基因, 并分析器耳聋预防与阻断中的临床应用价值, 现选取2012年3月—2013年2月来该院检查治疗的58例聋哑人为研究对象, 报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究选取来医院检查治疗的聋哑人共58例, 其中聋人夫妇患者共有8对, 来自于耳聋学校的学生患者共有42例。其中, 女30例, 男28例。

1.2 检测方法

1.2.1 检测仪器与试剂

采用E-Cycler TM96PCR检测仪和Bio Mixer TMⅡ芯片杂交仪以及Slide Washer TM8芯片洗干仪器, 全血基因组DNA提取试剂盒由上海华舜生物工程公司制造。

1.2.2 DNA的提取

采用内含EDTA抗凝剂的真空采血管来对于受检者的外周静脉血进行2 m L的采集, 通过小剂量的全血基因组DNA提取的试剂盒来提取其DNA, 然后通过BECKMAN-DU800紫外分光光度计来开展定量与纯度的检测。

1.2.3 基因芯片的检测方法

对于PCR扩增方法依照被检测的样品数目的2倍准备200μL离心管, 然后在离心管上标记下样品编号, 该两套管应当对应。按照PCR反应试剂盒说明来配置其反应体系, 主要包括PCR扩增引物混合物A112.5μL和基因组DNA3.0μl以及PCR扩增试剂混合物A24.5μL, 合计为20.0μL。杂交方法是把PCR产物加热到95℃变性5 min, 然后立即浸入到冰水混合物中再冰浴3 min。自两个不同的扩展体系管内各抽取2.5μL的PCR产物, 并加入至10μL的杂交缓冲液管内。把混合液加至芯片的点样区域, 之后加盖玻片, 然后再封闭杂交仓, 并放入到温度为50℃的杂交仪内孵育1 h。在取出芯片后, 放进洗干机内进行洗涤并快速甩干。最后一步是扫描, 运用晶芯扫描仪与之对应的遗传性耳聋基因检测芯片的判别系统实施信号的读取和判断确认。

2 结果

经过对耳聋患者通过基因芯片数据检测, 结果显示共有25例患者存在致聋基因突变, 占比例为43.10%。属于野生型共31例, 占到53.44%。属于GJB2基因突变的共11例 (18.97%) , 其中包括235del C位点纯合突变型共2例 (3.45%) , 属于235del C位点杂合突变型的共5例, 属于235del C和176del16位点复合杂合突变型的共2例 (3.45%) , 属于299del AT位点杂合突变型的共5例 (8.6%) ;属于SLC26A4基因突变的共21例 (36.21%) , 其中包括2168A>G位点杂合突变型的共2例 (3.45%) 和IVS7-2A>G位点纯合突变型的共5例 (8.62%) 以及IVS7-2A大于G位点杂合突变型的共14例 (24.13%) 。

3 讨论

聋病史是当前社会造成人类残疾与影响人类健康的常见疾病。统计结果显示[3], 倘若有一千个新生儿, 那么在这其间就有1~3个是聋儿, 而有一半以上的聋儿是遗传因素导致的。我国在2006年12月公布了对残疾人的调查结果, 结果显示, 听力有障碍的大概有2004万人, 占所有残疾人比重的首位。导致耳聋的原因多种多样, 研究结果显示[4]:有60%的聋儿是因为遗传的缘故, 而剩余的40%耳聋的人则是受生活环境的影响。截至到目前, 发现导致耳聋的原因很多, 但是经过流行病学的分析研究[5], 发现例如SLC264以及GJB2等少数基因在耳聋人群中占有的比例比较高。所以相对而言, 急于需要一种准确性较高而且既简单又快速的基因检测方式。

基因芯片技术的根本原理为核算杂交, 也就是说, 采用合成后点样或者是原位合成等方法把一些特定的DNA探针固化在支持物的表面, 与我国比较传统的基因检测方式, 对设备要求不高, 而且简单方便, 通量高, 也能确保准确性, 是我国目前医学临床上检测DNA的金标准[6]。

关于对这类人群开展咨询工作时, 应以以下几点为主。

①有效地控制聋儿的出生率, 减少聋病的发生概率。

②在我们检测的人群中, 有一对育龄夫妻双方均携带SLC26A4单杂合突变基因, 那么这对夫妻生育聋儿的可能性高达25%, 所以, 在生育之前, 需要对孕妇进行产前检查和诊断, 进而来预防和降低聋儿的出生概率[7]。因为聋人的情况在现实中都比较特殊, 所在他们在生育之前需要做基因检测, 最好是认识到自己耳聋的病因, 彻底的认识这种病症, 最好是不要和遗传性耳聋的人进行婚配。

③从遗传学的角度出发, 找出导致耳聋的病因。

④最好是不要和遗传性耳聋的人进行婚配。比如说聋人夫妻中四条等位基因都发生了GJB2突变, 那么毫无意外的他们后代将遗传到两条GJB2等位基因, 那么遗传耳聋的概率基本上为100%[8]。所以说应该在婚育到医院进行诊断, 最大程度上降低我国聋儿出生的概率。

综上所述, 随着对中国人遗传性耳聋认识的深入了解以及科学的进步, 阻断并预防遗传性耳聋已经不是难以攻破的难题, 而一些在妇幼保健所工作的人员更应该利用诊断耳聋基因的环境以及优势, 避免聋儿出生或者是减少聋病的发生概率。

摘要：目的 探讨和分析运用基因芯片法检测耳聋患者人群中的突变基因, 并分析器耳聋预防与阻断中的临床应用价值。方法 运用基因芯片的方法来进行突变位点的具体检测, 通过采集聋哑人58例患者的外周静脉血, 然后提取受检者基因组的DNA进行PCR扩增和杂交以及扫描检测, 运用该种方法能够同时检测四种比较常见的耳聋相关基因当中的9种热点的突变状况。结果 经过对耳聋患者通过基因芯片数据检测, 结果显示共有25例患者存在致聋基因突变, 占比例为43.10%。属于野生型共31例, 占到53.44%。属于GJB2基因突变的共11例 (18.97%) , 其中包括235delC位点纯合突变型共2例 (3.45%) , 属于235delC位点杂合突变型的共5例, 属于235delC和176del16位点复合杂合突变型的共2例 (3.45%) , 属于299delAT位点杂合突变型的共5例 (8.6%) ;属于SLC26A4基因突变的共21例 (36.21%) , 其中包括2168A大于G位点杂合突变型的共2例 (3.45%) 和IVS7-2A大于G位点纯合突变型的共5例 (8.62%) 以及IVS7-2A大于G位点杂合突变型的共14例 (24.13%) 。结论 基因芯片属于目前基因检测的有效方法 , 能够在预防患者“聋-聋”的垂直传递, 并降低聋儿的出生率方面发挥十分重要的作用。

关键词：耳聋基因突变,基因检测,基因芯片

参考文献

[1] 袁永一, 戴朴, 黄德亮, 等.内蒙古赤峰市聋校聋儿SLC26A4基因分析[J].中国耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2007, 5 (14) :251.

[2] 韩冰, 戴朴, 王国建.相同表型不同基因型耳聋夫妇家庭的遗传咨询与指导[J].中华耳鼻喉头颈外科杂志, 2007 (42) :499.

[3] 金鹏, 于姝媛, 祝威, 等.应用基因芯片技术对一近亲婚配耳聋家系致聋机制的分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2011, 52 (4) :368.

[4] 张伟, 龚树生, 黄丽辉, 等.聋病分子遗传学快速诊断技术在临床上的应用[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2011, 23 (13) :144-145.

[5] 谢兰, 郭永, 黄国亮, 等.疾病个性化诊断相关的转化医学尝试[J].转化医学研究 (电子版) , 2011, 56 (1) :309.

[6] HutchinT, Coy NN, Conlon H.et al.Assessment of the genet-ic cause so frece ssive child hood syndromic deafness in the UK-implications for genetic testing[J].ClGenet, 2005, 68 (6) :506.

[7] 张华, 刘宇清, 王幼勤, 等.遗传性耳聋基因芯片检测及其临床意义[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009, 13 (22) :175.

[8] 王国建, 戴朴, 韩东一, 等.基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究[J].中华耳科学杂志, 2008, 42 (1) :499.