芥菜类蔬菜的组织培养技术应用研究进展

芥菜类蔬菜属于十字花科芸薹属芥菜种的一、二年生草本植物栽培变种群[1], 分为根芥、茎芥、叶芥、薹芥四种类型[2]。通常作为蔬菜、油料和调料作物栽培[1]。芥菜是我国重要的原产蔬菜种类, 栽培历史悠久, 分布广泛, 种质资源丰富。

植物离体培养具有占用空间小、繁殖速度快、培养物脱毒等特点, 是现代农作物育种、生产上常用的技术手段。在芥菜育种的研究中, 离体培养技术可以作为实验室育种的常规技术, 保存难以获得种子的材料, 为今后芥菜细胞培养、遗传研究、基因工程技术搭建技术平台。本文综述芥菜类蔬菜组织培养技术的研究进展。

1 植物材料基因型

植物材料的基因类型直接影响着离体培养的效果, 不同材料再生能力不同[3]。陈石头[4]以五个不同品种榨菜子叶为外植体时, 不定芽诱导率不明显, 而以子叶柄为外植体时, 五个品种间不定芽的诱导率有明显差异。余小林等[1]认为不同的基因型严重影响着第一代愈伤组织的分化。沈进娟等[5]认为不同榨菜品种之间外植体不定芽的分化率差异明显, “蔺市草腰子”和“郫县榨菜”容易诱导不定芽, 而“永安小叶”不容易被诱导, 其外植体的分化率均比较低。吴慧敏等[3]在叶用芥菜小孢子培养中, 最终认为不同基因型材料间胚状体产量差异显著。陈材林等[6]认为芥菜类作物在自然选择和人工选择的共同影响下形成了一系列变异类型。付杰等[7]认为在所有栽培作物中, 芥菜变异的程度之大是少见的, 是芸薹属植物在进化上的一个典型种类。芥菜在组织培养中基因型差异严重影响了愈伤组织的诱导及愈伤组织的分化。何晓明[8]在菜薹研究中指出, 所用6个菜薹品种在相同的培养基上不同品种间不定芽的分化能力有着明显差异。

2 植物外植体

2.1 外植体类型

植物不同的外植体再生能力有很大的差异性, 因此选择合适的外植体进行离体培养是提高植株再生频率的有效手段。目前在芸薹属植物上采用的外植体主要有子叶、带柄子叶及下胚轴[9,10,11,12,13,14,15]。陈石头等[4]在榨菜组织培养的研究中发现, 榨菜子叶和带柄子叶在不定芽诱导条件下, “浙桐1号”子叶再生芽分化频率达到91.3%, 带柄子叶的不定芽再生率高达100%。沈进娟等[5]也对此做了相关的研究, 指出不同的外植体类型诱导不定芽的分化差异较大, 其中子叶和带柄子叶分化率较高, 带柄子叶分化率最高, 下胚轴在不同分化培养基中不定芽的分化率均偏低。张艳梅等[16]通过研究发现, 榨菜下胚轴愈伤组织的诱导率达90.0%, 不定芽诱导率达92.2%。黄欣等[17]在拟南芥再生体系的研究中指出, 用真叶诱导愈伤时, 处于花期的真叶出愈能力稍快于处于营养期的真叶。余小林等[1]在提高榨菜离体植株再生频率的研究表明, 不同外植体在适宜的培养基中的再生频率差异明显, 其中下胚轴的不定芽再生频率为最高, 达到50%;子叶柄不定芽再生频率为34.43%, 带柄子叶的不定芽再生频率为16.67%, 不定芽再生频率最低的外植体是子叶, 仅为33.33%。但就愈伤组织诱导频率而言, 诱导频率最高的外植体却为子叶柄, 诱导频率可达96.67%。

2.2 外植体生理状态

外植体的生理状态对芥菜类蔬菜离体再生及分化频率也有很大影响, 不同生长期的无菌苗明显影响外植体不定芽再生能力。一般情况下, 幼嫩组织比老化组织具有较高的形态发生能力[18]。刘乐承等[19]在对芸薹属植物的研究中报道, 以无菌苗的子叶、带柄子叶和下胚轴等为外植体时, 苗龄显著影响芽再生频率。陈石头等[4]研究发现, 子叶外植体的苗龄为4 d时分化能力最强, 达到91.3%, 随着苗龄的增加, 不定芽的分化频率明显降低;带柄子叶则以5~6 d苗龄分化最佳, 其中6 d苗龄的带柄子叶, 分化频率高达100%。张艳梅等[16]在对榨菜下胚轴的再生体系的建立研究中指出, 不同苗龄榨菜愈伤组织的诱导效果有显著的差异, 3 d苗龄榨菜幼苗的愈伤组织诱导率最低, 4 d苗龄诱导率最高, 达到90%, 但其后随着榨菜苗龄的增加, 诱导率逐渐下降。

2.3 外植体极性与接种方式

离体培养中外植体的极性影响在芥菜类蔬菜中的研究报道较少。金波[20]认为以下胚轴和花茎为外植体时, 极性是影响芽再生的重要因素。一般认为, 近根端容易产生根, 近芽端容易产生芽[19]。但李树贤等[21]在结球甘蓝上发现下胚轴不定芽的发生没有明显极性。

外植体的接种方式对芽的再生也有一定的影响。许多研究表明, 插植较平放芽再生率要高[22,23]。朱丽华等[24]对大白菜下胚轴接种方式的研究表明, 以近根端插入培养基的正插方式明显有利于不定芽的再生。张艳梅等[16]在对榨菜下胚轴的研究中全部采用平放, 在不同生长调节剂浓度的配比中, 不定芽的最高诱导率为92.2%, 不定根的最高诱导率为97.8%。

3 培养基及生长调节剂组合浓度

3.1 培养基

芥菜离体培养中常用的基本培养基为MS、B5。黄欣[17]在拟南芥的研究中选用B5培养基, 在不同生长调节剂配比下外植体均有愈伤组织形成。沈进娟[5]选用B5和MS为基本培养基, 探讨不同基因型在不同培养基中诱导不定芽分化的差异, 以B5培养基为分化培养基时, 不同榨菜品种之间外植体不定芽分化率差异不大;以MS培养基为分化培养基时, 不同榨菜品种之间外植体不定芽的分化率差异明显, “蔺市草腰子”和“郫县榨菜”容易诱导不定芽, 其中“蔺市草腰子”的带柄子叶不定芽分化率达到94.4%, “郫县榨菜”的子叶不定芽分化率达到80.0%, 而“永安小叶”不容易被诱导, 其外植体的分化率较低。余小林等[1]以MS培养基为基本培养基, 采用不同生长调节剂组合来研究榨菜间接不定芽发生情况, 建立了高效的榨菜离体培养再生体系。张艳梅等[16]的研究中选用MS培养基, 其愈伤组织的诱导率达到了47.8%。孙全等[25]的研究中, 也以MS培养基为主, 在不同生长调节剂组合中, 外植体最大分化率达97%, 成苗率最大值为73%以上。陈石头等[4]研究中表明, 以MS培养基为基本培养基, 诱导榨菜子叶和带柄子叶不定芽, 浙桐1号榨菜子叶再生芽分化频率达91.3%, 带柄子叶的不定芽再生率高达100%。

3.2 生长调节剂类型及组合浓度

芥菜组织培养很难得到完全脱分化的愈伤组织, 在没有添加生长调节剂的MS培养基中, 其外植体只能生根而不能形成愈伤组织[26]。生长调节剂在植物组织培养中有着至关重要的作用, 是诱导愈伤及植株再生的决定性因素, 因此寻求适当的生长调节剂类型及配比浓度是提高愈伤及芽再生频率的重要途径[19]。在芥菜的组织培养中最常用的生长调节剂有NAA、6-BA、2, 4-D等。不同基因型品种以及外植体对生长调节剂组成的要求有显著差异。余小林等[1]在榨菜的研究中报道, 在2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2, 4-D的MS培养基中, 榨菜愈伤组织诱导频率和不定芽再生频率均为最高, 下胚轴、子叶柄、带柄子叶、子叶等不同外植体在上述培养基中的再生频率差异很大, 分别为50%、34.43%、16.67%、33.33%。同时, 在此生长调节剂浓度组合下, 愈伤组织诱导频率最高的外植体为子叶柄, 诱导率达96.67%。使用1.5 mg/L CPPU+0.2 mg/L 2, 4-D浓度配比的组合结果表明, 不论是愈伤组织诱导还是不定芽的分化, 均好于6-BA与2, 4-D的组合, 也最适合不定芽的分化, 但不同的外植体类型在此组合中的再生频率是不一样的, 其中带柄子叶外植体的再生频率最高, 达66.67%, 子叶、子叶柄和下胚轴在以上组合中的不定芽再生频率分别为36.67%、5%和1.67%。陈石头等[4]使用6-BA与NAA的生长调节剂组合研究榨菜子叶及带柄子叶的再生体系, 认为2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA为子叶的最佳分化浓度。带柄子叶的优化培养基则为MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +5.0 mg/L Ag NO3。张艳梅等[16]研究发现, 6-BA与NAA、6-BA与2, 4-D的配比组合, 愈伤组织诱导的最佳生长调节剂配比为0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA, 不定芽诱导的最佳生长调节剂配比为2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA, 不定根诱导的最佳生长调节剂配比为0.2 mg/L NAA。沈进娟[5]等的研究表明, 分化培养基中添加2 mg/L 6-BA、0.2~0.4 mg/L NAA时, 不定芽分化率最高。

4 硝酸银

Chi等[27,28]首先发现培养基中添加硝酸银显著促进大白菜、白菜和菜心的子叶再生率。硝酸银作为一种乙烯抑制剂, 能通过促进多胺的合成提高体细胞胚胎和芽发生的频率[29]。因此Ag NO3在芸薹属植物组织培养中被广泛运用, 浓度在4~10 mg/L可显著增加不定芽的分化率[30,31,32,33,34,35,36,37]。陈石头[4]认为, 添加5 mg/L Ag NO3能促进带柄子叶的分化。沈进娟[5]在分化培养基中也添加了5 mg/L Ag NO3, 认为添加适宜的Ag NO3更有利于不定芽分化。

5 结束语

影响芥菜类蔬菜作物离体再生的各种因素是相互作用的, 通过选择适宜的外植体类型和最佳生理时期, 改良培养基及优化生长调节剂配比, 优化培养条件及使用培养基添加物, 综合所有的因素进行优化, 才能获得高效的芥菜类蔬菜离体培养再生体系。从总体研究来看, 芥菜类蔬菜离体再生系统仍不完善, 再生频率普遍不高, 有关提高芥菜类蔬菜离体再生频率的研究仍需进一步加强, 以便为今后芥菜类蔬菜新品种选育、遗传转化研究打下坚实的基础。

摘要：组织培养技术对于芥菜类蔬菜育种材料的保存与繁殖、遗传转化、种质资源创制有着十分重要的意义。主要对芥菜类蔬菜器官离体培养的现状进行综述, 包括:外植体类型 (子叶、带柄子叶及下胚轴) , 外植体生理状态 (苗龄等) , 外植体极性 (近根端、近芽端) 与接种方式 (正插、平放等) ;培养基类型及生长调节剂组合浓度等。分析认为, 影响芥菜类蔬菜作物离体再生的各种因素是相互作用的, 通过选择适宜的外植体类型和最佳生理时期, 改良培养基及优化生长调节剂配比, 优化培养条件及使用培养基添加物, 综合所有的因素进行优化, 才能获得高效的芥菜类蔬菜离体培养再生体系。

关键词：蔬菜,芥菜类,组织培养,培养基,生长调节剂

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