初学细菌平板划线法常见问题分析

2023-02-14

菌种的复壮活化、纯种分离均需要通过平板划线技术才能获得纯菌落。其主要原理是, 划线操作时, 细菌细胞在琼脂平板表面形成浓度梯度, 浓度低的地方, 单个的细菌细胞就会在平板的表面形成肉眼可见的完全分离开的单个菌落。因此, 这是一项微生物学课堂中必须要掌握重要操作技术, 也为后续的微生物检验课程的鉴别菌种、发酵课程的菌种纯化及保藏等打下坚实基础。本文就微生物基础课程中, 学生初学细菌平板划线法技术常见问题进行呈现归纳[1]。

一、接种环操作问题及解决办法

(1) 拿取接种环姿势错误。初学者在拿取接种环时, 最常见的错误是横握接种环柄。正确的拿法是:使用右手拇指、食指和中指三个手指拿捏接种环柄, 并且像握毛笔一样竖着, 这需要放松手腕, 才可以灵巧地控制接种环进行划线。

(2) 接种环在进行平板划线时与平板表面夹角错误。初学者常会使接种环在划线操作时与平板表面的夹角过大, 甚至是垂直于琼脂平板表面, 这会使得操作者在进行Z形连续划线时划破培养基表面。正确操作是接种环划线时与平板夹角控制在45度以内, 环与平板表面接触面积多, 手法要轻, 要控制住不划破培养基, 像溜冰一样操作接种环划过培养基表面。

(3) 拿取接种环后手肘悬空操作。当手肘悬空操作时, 由于手臂在桌面上没有支撑固定点, 容易造成操作时手不停地抖动, 使得划线不平稳。也会由于抖动不能很好地控制接种环的前端, 容易在进入培养皿内触碰到皿口边缘或外壁, 同样也会在伸入菌种管内触碰管口边缘及外壁, 这些操作均会增加污染的可能。

(4) 灼烧灭菌接种环后没有冷却后就使用。灼烧后的接种环没有充分等待冷却, 就开始挑取菌种划线, 造成细菌被烫死。解决办法是, 可以将灼烧后的接种环置于平板空白处冷却, 直到听不到嘶嘶声后再等待15s, 此时接种环基本冷却, 才可以操作使用。

(5) 第1区划线后没有灼烧接种环。初学者常会在第一个区域划线结束后, 忘记灼烧接种环以去除环上剩余菌体细胞, 这样操作的结果会使得连续划线到培养平板的末区也分离不到单菌落。如何让学生理解并记住1区划线结束后, 2区开始前需要灼烧。教师可以在教学语言中增加一个词语即可帮助学生解决这个问题。即:归零。当教师告诉学生1区到2区接种环需要“归零”, 并在黑板板书绘图处标出1区与2区的位置写下“灼烧归零”即可巧妙地帮助学生理解为什么要灼烧接种环。接种环归零就是需要接种环上的微生物细胞归零, 没有菌体, 是干净无菌的。要归零就要灼烧灭菌接种环, 才能清除掉环上剩余的所有菌体细胞。

(6) 划线的方向出现纵向的M形。一副培养基平板的表面积是极为有限的。因此需要划线所走的路线够长, 才能使得环上的菌体拖到平板上充分降低浓度, 才容易成功地在路线的末端分离到单菌落。而当平板出现M形划线路线, 往往是由于划线方向与分区线垂直了。这样的操作会使得路线变短, 平板面积得不到充分利用, 不易得到单菌落, 划线结果观察起来也不美观。学生只要确保操作是Z形划线路线与分区线平行, 而不是与分曲线垂直就能避免M形短线的产生。

二、平板制作与分区问题及解决办法

(1) 不会单手开盖培养皿。为了防止污染, 培养皿的打开操作是不允许完全将皿盖打开。初学者由于不会控制单手的手指结合手掌的力量, 常常不自觉地将培养皿盖完全打开并放到桌面上, 或者因为手指和手掌僵硬使得单手开盖的开口过小。因此可在正式操作前1-2周先进行空皿单手开盖练习, 活动伸展开左手各手指、手掌及手腕, 这样在正式操作时学生就可以灵活地运用单手开盖培养皿了。

(2) 制作的培养基平板冷凝水多。制作平板时, 熔化的培养基温度过高, 这样会使得培养基平板凝固后, 培养皿盖内侧形成大量冷凝水。冷凝水滴落到平板表面容易造成划线培养后, 所划的路线形成水膜, 不容易得到单菌落, 另外还容易造成污染。所以培养基铺倒平板时的温度很重要。固体培养基中是添加了琼脂的, 琼脂的熔点是在96℃, 凝固点是在40℃。所以要求复熔后的培养基冷却至45℃铺倒平板较为适宜, 特别是在混菌铺板时, 过高的温度会在铺倒培养基混合平板时烫死细菌, 温度低了, 培养基又会发生结块、凝固而不能铺倒。经过实践经验发现, 可以等待灭菌后复熔的培养基冷却到55-60℃开始铺倒平板, 因为盛装培养基的容器一旦打开盖子后冷却的速度会加快。同时培养皿可以在50℃烘箱中保温, 使用时才拿出来, 这样的处理, 由于培养皿和培养基的温度相差温度不大, 产生的冷凝水会大幅减少。如果已经产生了大量的冷凝水在皿盖上方内侧, 那么可以在酒精灯火焰近旁, 先倒扣凝固好的培养皿, 保证皿底在上, 缓慢脱开皿盖, 并在操作台外快速甩掉盖内产生的冷凝水, 然后迅速扣回仍保持在火焰旁培养基面向下的培养皿底。

(3) 四区划线分区时在培养皿底没有合理分配各区面积。常见起始的1区和2区占据了培养皿过半面积。划线从1, 2, 3, 4顺序操作, 分配的面积应该保障4区>3区>2区>1区。因为4区和3区是最有可能获得单菌落的区域[2,3]。具体的操作办法是:在培养皿的底部外侧用油性记号笔划三线分四区。笔者在教学时要求初学者在刚开始的学习以及前期训练中必须在培养皿的底部外侧用记号笔划线分区, 在实践操作中发现, 当学生训练平板划线法技能训练累积达到600个培养皿左右的数量时, 就基本拥有很强的分区感, 此时就可以不用在培养皿底部外侧用记号笔划线分区提示了。但是刚开始学习时需要老老实实在培养皿底外侧用记号笔事先画好三条分区线, 线与线之间的夹角约120度, 将皿底面积分为4个区域, 依次面积变大。但是学生很难把握好各区的面积, 应该注意提醒学生第一条线的位置极为重要。规定以培养皿直径线为基准, 直径线上方的1/2半径高度处平行描出第一条分区线。然后以逆时针方向, 从第一条分区线的中点向左下角画出第二分区线, 该线右侧与第一线形成约120度的夹角为宜。同理依据此法从第二条线中点起始逆时针方向画出第三分区线。这样就把皿底从外侧看是逆时针的1、2、3, 4区。当把培养皿翻过来成为皿底下, 皿盖上时, 学生就能清楚看见粗细适中的记号笔在皿底留下的黑色线条, 分区面积合理且顺时针排列了。

三、无菌操作问题及解决办法

(1) 灼烧不彻底。学生常见接种环灼烧不彻底, 即灼烧时间不够, 灼烧灭菌完毕不小心触碰他物没有复烧。因此应该要求学生灼烧至接种环丝部位发红, 接种环丝与柄的接口旋转灼烧5s, 柄的金属部分在酒精灯火焰外焰中旋转灼烧5s。这样有具体的标准和时间要求, 学生能准确地理解灼烧灭菌要求“彻底”的程度。灼烧灭菌后若不小心触碰他物应该立即重新灼烧等待冷却再使用。

(2) 不在燃烧的酒精灯火焰旁操作。发生这种现象是由于学生对于无菌区域没有理解。应该保持在酒精灯火焰旁操作。 (2) 菌种管拔塞子以及培养皿开盖操作太快引起空气大的对流, 易造成污染。 (3) 菌种管拔出的塞子没有悬空握住, 而是放置桌面上。这种情况的发生是由于学生右手的手部 (手指、手掌、手腕) 不灵活照成的。学生在使用拇指、食指、中指拿捏接种环柄时, 余下的无名指和小指应该灵活的配合手掌的小鱼际部分轻松地拿捏菌种管塞子。由于学生没有经过专门的手部训练, 手指和手掌都是不够柔软灵活的。

针对这样的情况, 教师应该在操作一个月前, 教会学生手部的灵活训练组合。学生通过利用一个月的碎片化时间进行教师教授的手部灵活柔韧训练组合, 左右手的手指和手掌都会变得柔韧灵活。一个月后会发现左手单手打开培养皿、左手执放物品、右手执拿接种环, 右手旋开试剂瓶盖等操作时变得灵活而稳定。无菌操作时, 可以安排小组成员交替在旁观察监督及时制止纠正错误操作。开盖、拔塞等操作一定要缓慢避免引起大的空气流动造成污染。