谷氨酰胺转氨酶

谷氨酰胺转氨酶（精选七篇）

谷氨酰胺转氨酶 篇1

胶原是一种天然的蛋白质,被视为最热门的生物材料之一,具有生物相容性、可降解性、来源丰富等特点,较其他合成材料有无法比拟的优势,不仅大规模用于皮革生产,也广泛应用于食品、化妆品、医药、卫生等各个领域[1,2]。但胶原在水相中及在较高温度下缺乏机械强度,且在体内易被降解,因此在应用上受到了很大程度的限制。要提高胶原的机械强度和稳定性,就必须进一步稳定胶原结构,而这通常是在胶原分子内部或之间引入共价交联键来实现的[3,4]。目前,最常用的交联方法是化学试剂交联法,如使用戊二醛或甲醛交联,但其具有明显的细胞毒性,增加组织矿化和刚度等缺点[5]。毒性较小且生成无毒降解物的替代试剂如甘油醛、京尼平和碳二亚胺也得以研究,但在用于体内的胶原材料中这些物质的含量必须通过洗涤除去且在生产中不可行。另一方面,如用物理方法产生的交联键相对于化学交联键弱得多,且交联键需要很长的作用时间才能形成,这同时也增加了胶原的降解风险[6]。

作为环境友好的生物质酶具有专一性、高效性、特异性、反应条件温和、无污染和可生物降解等优点。而酶介导的催化交联可能成为稳定胶原材料的一种替代、高效、无毒的方法。谷氨酰胺转氨酶(TGase EC 2.3.2.13)是最近在这方面被受到广泛关注的一种酶,且该酶已广泛应用于食品工业和医学研究中[7,8]。TGase是种胞外酶,其相对分子质量约为40 kDa,它主要催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺基和赖氨酸残基的ε-氨基之间发生酰基转移反应,从而在蛋白质分子间和分子内形成ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸共价键[9](如图1),因此TGase是理应能够催化胶原发生交联的。有研究报道胶原本身就是细胞外基质转移酶的一种重要作用底物,且胶原被作用能同其他非胶原蛋白发生交联,Chau等人发现在体外用TGase处理Ⅰ型胶原加快了其胶原的自组装[10],目前已有许多研究证明TGase能够催化胶原的水解产物—明胶形成强度更高、粘性更大、热变性温度更高的凝胶[11]。

但有文章报道TGase的催化反应对可溶性鼠尾胶原的热变性温度没有太大贡献,这是由于在常规水相条件下TGase并不能使胶原发生充分的交联反应,若通过改变反应条件或添加适当的辅助剂,以期使酶和胶原发生更好的反应[12,13]。1985年,Randolph和Hammond首次报道了多酚氧化酶和碱性磷酸酶在CO2超临界流体中的催化活性[14],此后SCF-CO2介质中酶的催化反应受到了广泛关注,20世纪80年代以来超临界流体技术迅速发展并成为一项高新技术。CO2以其无毒、无味、无残留及溶解能力强等特点被认为是一种良好的反应介质,且SCF-CO2作为一种绿色溶剂在食品、医药、化工等方面都有较广泛的应用[15]。本实验室以SCF-CO2代替水做介质在制革技术方面的研究已较成熟且在酶催化反应方面的研究也取得了较好的成果,尤其在制革准备阶段的酶脱毛方面及酶催化水解蛋白质方面均取得了良好效果[17,18]。

借鉴本实验室前期已经得出的研究成果:酶在SCF-CO2介质中的催化反应效果均比在常规水相条件下的效果要好。因此本试验在实验室前期研究工作基础上,探讨了TGase在SCF-CO2介质中催化胶原交联的反应情况,并与常规水相条件下的TGase酶交联胶原反应结果作出对比。

1 试验部分

1.1 主要材料与仪器

试验材料:纯胶原,实验室自提;谷氨酰胺转氨酶,酶活100 U/g,江苏泰兴一鸣生物制品有限公司;平平加O,工业级,上虞印染助剂厂。

主要仪器:CO2超临界流体实验反应装置,实验室自制;(DSC)200PC差示扫描量热分析仪,德国NETZSCH公司;Freeze 6型冷冻干燥机,美国LABCONCO公司;BS110S电子分析天平,北京赛多利斯天平有限公司。

1.2 试验内容

1.2.1 水相条件下TGase催化胶原交联反应

TGase是由331个氨基酸构成的有活性中心的球状构型单体蛋白质,其等电点为8.9,最适反应温度为40～50 ℃,最适pH范围为6.0～7.0且在pH 5.0～8.0范围内都具有较高活性,催化反应时间一般控制在2～5 h[19]。根据TGase的以上性质特点,将实验室自提牛皮胶原配制成pH 7.0的10 mg/mL胶原溶液,进行以下几组试验。

(1)时间:

在3组胶原溶液中加入40 U/g(Unit/g collagen)TGase,并在40 ℃条件下分别催化交联1 h、2 h、3 h。

(2)温度:

参考TGase的最适反应温度及考虑胶原易受热变性的特点,选定30 ℃、35 ℃、40 ℃作为讨论的3个温度变量,加入40 U/g TGase处理2 h。

(3)酶量:

将5 U/g、10 U/g、20 U/g、40 U/g、60 U/g TGase分别加入到5组胶原溶液中,并根据前期试验结果选取在40 ℃条件下反应2 h。

将各组反应完后的胶原溶液立即放入-20 ℃环境下冻存,并通过真空冷冻干燥得到酶作用后的胶原。

1.2.2 SCF-CO2介质中TGase催化胶原交联反应

CO2的临界温度为31.26 ℃,临界压力为72.9 atm(≈ 7.39 MPa),且CO2超临界流体是中偏酸性pH 6.0～7.0。依据SCF-CO2属性特点及参考前面水相试验中探讨的时间及温度影响结果,设定本次在SCF-CO2中试验条件为反应压力8.0 MPa,反应温度40 ℃。在5组经冷冻干燥的胶原中分别加入5 U /g、10 U/g、20 U/g、40 U/g、60 U/g TGase,并注入含1%平平加O的夹带剂10 μL,反应2 h后将胶原从反应釜中取出并立即放入-20 ℃环境下冻存,最后经过再次冷冻干燥得到超临界条件下酶交联的胶原。

1.2.3 差示扫描量热法(DSC)的测定

称取经冷冻干燥后的胶原样品约3.0 mg,封于铝坩埚中,以空气为参比,在氮气保护下从20 ℃升温到200 ℃,升温速率为5 ℃/min,记录下吸热曲线测定出胶原的热变性温度。

2 结果与讨论

2.1 时间的影响

胶原的热变性温度Td是反映其天然3股螺旋结构稳定性的一项重要指标,DSC则是测定胶原热稳定性的常用方法。胶原分子中形成的共价交联键越多则胶原的强度越好、结构越稳定,因此Td很好的反应了胶原的交联度。图2所示的是未交联胶原以及水相中TGase分别催化交联1 h、2 h、3 h后胶原的DSC曲线。

由图2可见,未交联胶原的Td为70.8 ℃,经酶处理1 h后胶原的Td为82.3 ℃,而经酶处理2 h后胶原的Td提高到了91.4 ℃,但经酶处理3 h后胶原的Td为92.2 ℃并无明显变化。这说明酶处理从1 h到2 h时,随着时间的延长酶催化胶原发生了更多的交联,所以胶原的Td也相应的得到了很大的提高。但当酶处理到2 h后胶原的Td却基本趋于稳定值,这说明随着反应时间的继续延长酶对胶原稳定性的提高不再有更多的贡献。这可能是由于在该反应条件下酶处理2 h后胶原交联基本达到饱和,酶难以催化胶原内部形成更多的共价交联键[20,21]。同样的在SCF-CO2流体介质中,虽然酶反应的介质不同,但酶反应的原理和趋势应该是一致的。参考水相中不同反应时间下TGase催化胶原交联的反应趋势,选定初探在SCF-CO2介质中TGase交联胶原的反应时间也为2 h。

2.2 温度的影响

温度是影响酶催化反应的一个重要因素,本试验既要设定TGase在其最适温度下催化胶原使发生更多交联反应,又要保证该温度下胶原结构处于稳定状态。图3所示的是TGase分别在30 ℃、35 ℃、40 ℃温度下处理胶原2 h后的DSC曲线。

可见30 ℃温度下TGase交联2 h后胶原的Td为82.6 ℃,35 ℃温度下交联2 h后胶原的Td提高到了87.3 ℃,而40 ℃温度下交联2 h后胶原的Td达到了91.8 ℃,且相比30 ℃下交联的胶原的Td提高了约9 ℃。由此可知随着反应温度的升高,酶作用加强,交联键增多,Td也得到相应的提高。同样的,无论在SCF-CO2流体介质中还是在水相介质中,温度40 ℃均是处于TGase最适反应温度范围内,在该反应温度下TGase能发挥更好的催化交联作用且此温度下胶原结构也能保持稳定。若继续升高温度,酶作用或许会更强,能催化胶原内形成更多的交联键,但反应温度的升高,对酶构象的稳定性有影响且会引起酶活衰减速度加快,另一重要方面是在较高温度环境下胶原容易发生变性,其天然构象易被破坏[22,23]。因此选定40 ℃为初探在SCF-CO2介质中TGase交联胶原的反应温度,且该温度也达到了CO2的临界温度值,符合形成SCF-CO2流体温度条件。

综合以上结果,确定TGase在pH 7.0左右中性环境下催化胶原交联反应的较适宜的反应时间为40 ℃以及反应温度为2 h。以下试验在此结果基础上继续探讨在两种不同的环境介质中不同加酶量对胶原交联反应的影响。

2.3 SCF-CO2介质与水相介质中TGase催化胶原的交联结果及对比

图4显示的是水相环境中不同浓度的酶在40 ℃下处理胶原2 h后测得的DSC曲线,其中0号表示没有经过酶处理的胶原的DSC曲线,1～5号分别表示TGase:5 U/g、10 U/g、20 U/g、40 U/g、60 U/g处理后的胶原的DSC曲线。

图5所示1～5号表示的是在反应温度为40 ℃、反应压力为8.0 MPa的SCF-CO2流体介质中,酶用量分别为5 U/g、10 U/g、20 U/g、40 U/g、60 U/g的TGase处理胶原2 h后测定的DSC曲线,其中0号表示未经酶处理的胶原的DSC曲线。

图4、5中可以看出,在水相介质中随着酶用量的增加,胶原的Td不断升高,当40 U/g酶处理胶原后的Td提高到了92.1 ℃。同样在SCF-CO2流体介质中酶用量的加大,酶处理后胶原的Td也是不断提高。这主要是由于酶浓度的提高有助于酶与底物胶原更好地渗透结合,酶能催化胶原分子中更多的谷氨酰胺γ-甲酰胺基和赖氨酸ε-氨基之间发生共价交联,从而使胶原更加稳定。但从图4、5中还可看出,在水相环境中当酶用量增加到20 U/g后,胶原的Td提高幅度明显减小,继续增加酶用量,胶原的Td基本趋于稳定。且在SCF-CO2环境中TGase酶用量分别为40 U/g和60 U/g处理后胶原的Td的差值也在缩小。根据酶反应动力学原理,在底物浓度不变的情况下,酶-底物中间复合物的浓度会随酶浓度的增加而增加,但当酶浓度达到一定值时,由于可反应的底物浓度相对减少而不能充分参与酶催化反应,所以继续增加酶浓度不能有效提高酶反应的速度。所以原因可能是在该反应条件下胶原空间网络中可参与交联的氨基酸残基数目有一定的饱和性,TGase的添加量超过一定的数值,便不会催化胶原内再形成更多的共价交联键[24,25]。

此外图5中显示:SCF-CO2流体介质中TGase催化胶原交联反应后胶原的Td最大能达到115.4 ℃,且TGase酶用量分别为20 U/g和40 U/g时,胶原的Td也分别提高到了103.8 ℃和111.6 ℃,这与水相介质中酶处理胶原后的Td相比均有所提高。表1则显示的是两种不同介质中不同酶量的TGase催化交联胶原后测得的Td值的比较。

由表1可知,相同的酶用量在SCF-CO2介质中处理后胶原的Td比在水相介质中处理后胶原的Td提高了10～20 ℃。这个增长是显著的,说明在SCF-CO2介质中TGase不仅能催化胶原发生交联反应,而且与水相介质相比TGase的催化效果更好,胶原内发生了更多的共价交联,胶原的稳定性得到了更大的提高。交联度的对比结果表示在水相条件下TGase可能没有催化胶原内部发生充分的交联反应,由于胶原呈三股螺旋的稳定结构,有部分的活性谷氨酰胺和赖氨酸残基位于胶原致密的三股螺旋区域中可能与酶很难接触到[26]。TGase较容易催化胶原表面发生共价交联,酶不太容易渗透进入到胶原内部而且即使进入到胶原内部的酶其中有部分酶的催化位点也不能够完全接触到氨基酸残基。通过改变反应条件或添加合适的辅助剂,以加强酶向胶原内部的渗透作用,增加胶原内的共价交联[27]。

由于SCF-CO2流体介质具有以下独特性质:SCF-CO2流体密度接近液体的密度,而黏度近似气体的数值,扩散系数介于气液之间比液体大数百倍。这样,酶能在SCF-CO2中的扩散性更好,在液相中受扩散控制的反应在SCF-CO2相中必然会加速;SCF-CO2具有独特的溶解性,室温条件下在一种流体中很难溶解的物质在SCF-CO2中变得容易溶解。由于溶解度的提高必然导致反应底物浓度增加,从而加速了催化反应;SCF-CO2提供单一均相体系,不存在相间传递阻力,加快酶催化速率。因此,在SCF-CO2介质中TGase可能更易渗透到胶原内,能更有效的催化胶原内的活性谷氨酰胺和赖氨酸残基发生共价交联。

3 结论

(1)TGase在SCF-CO2介质中催化胶原的交联反应是可以发生的。

(2)在SCF-CO2介质中不仅TGase催化胶原发生交联的效果显著,而且比在水相中TGase处理的胶原的交联度更高。TGase在SCF-CO2介质中处理胶原后其Td达到了115 ℃。且在SCF-CO2介质中用相同酶量处理的胶原的Td比在水相介质中处理的胶原的Td均提高了10～20 ℃。

(3)本试验得出在SCF-CO2流体介质中TGase催化胶原交联较为适宜的反应条件为:反应时间为2 h、反应温度为40 ℃、TGase酶用量为40～60 U/g、pH 6.0～7.0、反应压力为8.0 MPa。

摘要：探讨了CO2超临界流体(SFC-CO2)介质中谷氨酰胺转氨酶(TGase)对胶原的交联作用,且采用差示扫描量热法(DSC)表征胶原交联效果,并与常规水相介质条件下的酶催化胶原交联反应作出对比分析。结果表明:在SCF-CO2介质中TGase催化胶原的交联反应是能发生的,酶处理后胶原的热稳定性得到了显著的提高,且与水相介质条件下酶处理的胶原相比,其热变性温度提高了10～20℃。本试验得出TGase在SCF-CO2介质中催化胶原交联反应较适宜的条件为:时间2 h、温度40℃、酶用量40～60 U/g、pH值6.0～7.0、压力8.0 MPa。

谷氨酰胺对肠道免疫的影响 篇2

1. 谷氨酰胺的结构与生化特性

谷氨酰胺是L-谷氨酸-γ-羧基酰化的一种氨基酸, 其结构式为NH2OC-CH2-CH2-CH (NH2) COOH, 在生理p H条件下, 属于中性氨基酸, 与其他氨基酸相比Gln遇热不稳定, 对酸性环境敏感。谷氨酰胺含有一个α-氨基和一个酰胺基, 在组织间氨的转移和氨气的转运过程中起着重要的载体作用。其结构决定了它既能为其他氨基酸、蛋白质和核酸的合成提供氮源, 也可以像葡萄糖一样提供碳链氧化后释放能量。

2. 谷氨酰胺的代谢

谷氨酰胺合成酶能催化谷氨酸和氨很成谷氨酰胺, 谷氨酰胺酶能够催化谷氨酰胺水解为谷氨酸和氨。因此其代谢主要受谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶两者的共同调节。小肠是谷氨酰胺降解利用的主要场所。肝脏和肾脏对谷氨酰胺的利用有着重要的调节作用。从功能的角度看, Gln在肠道被利用主要有两个方向:一是通过氧化作用为肠道提供所需的能量;二是通过对碳和氮的处理转化成其他的氨基酸及其他活性物质, 或者转化成肝脏合成尿素和糖异生作用的前体。

3. 谷氨酰胺对肠道结构和功能的影响

(1) 谷氨酰胺对肠道黏膜的保护作用谷氨酰胺是肠道细胞重要的能源物质, 并且是合成细胞分化所必须的嘌呤和嘧啶核苷酸的前体物质。创伤、感染等应激状态下机体血浆及肌肉中谷氨酰胺浓度明显下降, 而病理状态下谷氨酰胺是维持肠道黏膜代谢、结构及功能的必需营养成分。

谷氨酰胺能够通过在全胃肠外营养中的应用来保护小肠黏膜。全胃肠外营养 (TPN) 是指从静脉供应所需的全部营养要素, 包括足够的能量、必需氨基酸、非必需氨基酸、维生素、电解质及微量元素等, 使病人或病畜在不进食的情况下仍可维持良好的营养状况。长期TPN时可导致肠腔细菌和毒素的易位, 从而诱发一些器官功能的损坏或衰竭, 而添加Gln能有效的增加肠黏膜质量和黏膜DNA含量, 增加绒毛高度和数量, 有效的缓解或改善这些负面影响。

谷氨酰胺还能通过对肠道黏膜上皮细胞的基因表达进行调控来保护小肠肠道黏膜。碱性亮氨酸拉链转录因子AP-1是Jun蛋白和Fos蛋白形成的二聚体复合物, Fos和Jun蛋白分别是由原癌基因C-Fos和C-Jun表达的。AP-1转录因子的启动细胞相应的增殖周期蛋白基因的表达, 使细胞由G1期进入S期, 从而促进细胞的增殖。在体外培养细胞时发现L型谷氨酰胺可增强小肠黏膜细胞C-Fos、C-Jun的m RNA的转录, 外源性添加谷氨酰胺能够显著提高小肠黏膜上皮细胞C-Fos和C-Jun的m RNA的表达量。因此谷氨酰胺能够增强小肠黏膜上皮细胞C-Fos和C-Jun的基因表达, 从而能够有效的促进肠道黏膜细胞的增殖和分裂, 能有效的防治肠道黏膜萎缩的发生。

谷氨酰胺还能够通过降低应激时的高代谢反应和维持氮平衡来保护小肠黏膜。在严重创伤、烧伤或手术等应激状态时, 动物持续进行高分解代谢, 血液中谷氨酰胺利用率升高, 导致体内细胞中的谷氨酰胺浓度急剧下降。此时, 若营养供给不足, 会发生肠道黏膜饥饿, 引起肠道黏膜萎缩, 加重应激代谢反应。若在这些应激状态下添加外源性的谷氨酰胺则能够维持肠道黏膜结构和功能, 减少骨骼肌蛋白质的分解和代谢, 维持氮平衡, 从而有效的降低应激代谢反应。

(2) 减少肠道细菌的移位大量实验及临床观察表明, 肠道细菌的易位是由于肠道黏膜屏障功能损伤、肠道通透性增加所致。肠道是细菌及内毒素的贮存库, 但在正常生理状态下并不损害机体健康, 但这完全依赖于机体完整的肠道黏膜屏障功能, 若机体应激时消化液碱性反流、胃内酸度下降等情况下, 肠道内细菌或其产物 (内毒素) 突破肠道黏膜屏障进入肠系膜淋巴结活门静脉系统, 进一步到达远离肠道的其他器官, 导致微生态环境破坏, 呈病理状态, 称肠道细菌易位 (Bacterial Translocation BT) 。肠道细菌易位的发生, 主要是由于肠道黏膜直接或间接损伤所致, 如放射治疗、口服广谱类抗生素。肠梗阻等, 若抗体免疫功能受损, 长期服用激素药物等均可导致肠道易位的发生。

在接受TPN动物肠道免疫功能变化的研究中, 发现没有添加谷氨酰胺的动物胆汁中S-Ig A (分泌性免疫球蛋白A) 的分泌下降了50%, 细菌大量黏附于黏膜表面, 有明显的细菌易位现象;而在TPN中加入谷氨酰胺的动物胆汁中S-Ig A的水平明显增高, 细菌易位的发生率明显下降。谷氨酰胺能够有效的减少细菌移位的现象, 保护肠道黏膜屏障, 同时也改善了肠道免疫功能, 并促进了S-Ig A的分泌和合成。

(3) 维持免疫细胞的正常功能 (1) 谷氨酰胺对红细胞的影响。红细胞不仅仅只具有运输氧气和二氧化碳的功能, 它与白细胞一样具有重要的免疫作用。红细胞具有识别和储存抗原、清除循环免疫复合物、加强吞噬细胞的吞噬功能和递呈抗原的作用, 增强T细胞依赖反应。谷氨酰胺能够增加红细胞的数量, 谷氨酰胺具有抗氧化的功效, 能够清除自由基, 能够通过影响红细胞的数量形态和功能来影响机体的免疫力。

(2) 谷氨酰胺对淋巴细胞的影响。谷氨酰胺对于维持淋巴细胞的正常功能具有重要的作用。淋巴细胞中富含高活性的谷氨酰胺酶, 当受到免疫刺激时, 谷氨酰胺酶的活性会增加。若培养基中缺乏谷氨酰胺会抑制淋巴细胞对丝裂原刺激的应答能力。在动物整体免疫机能研究中, 发现机体谷氨酰胺水平下降, 会伴随淋巴细胞转化率和自然杀伤细胞活性的降低, 间接表明了谷氨酰胺有维持机体免疫功能。多数谷氨酰胺通过不完全氧化为细胞生物合成提供充足的氮和碳原料, 谷氨酰胺对淋巴细胞的增殖和转化有明显的促进作用。补充谷氨酰胺后淋巴细胞自然增殖和刺激增殖都增强, 分泌抗体的能力也加强了, 给予外源性谷氨酰胺能明显改善细胞免疫功能。

(3) 谷氨酰胺对巨噬细胞的影响。谷氨酰胺是免疫细胞内的重要能源物质, 巨噬细胞内含有多种谷氨酰胺代谢酶, 谷氨酰胺是催化谷氨酰胺分解成谷氨酸和氨的起始酶, 在调节细胞内谷氨酰胺代谢中发挥着重要作用。用125I标记的酵母细胞, 在体外观察小鼠腹腔巨噬细胞摄取125I标记的酵母细胞能力, 当培养液中谷氨酰胺的浓度大于0.03 mmol/L时, 吞噬能力明显增强, 谷氨酰胺的浓度超过1 mmol/L (相当小鼠血浆浓度) 时吞噬能力趋于饱和。鼠供给2%谷氨酰胺, 可提高多形核嗜中性粒细胞 (PMN) 的吞噬活力, 改善细胞渗出和PMN的吞噬活力。对大鼠巨噬细胞的研究表明, 吞噬细胞能够大量利用谷氨酰胺, 是由于其具有高活性的谷氨酰胺酶, 其谷氨酰胺酶的活性是淋巴细胞的4倍, 说明谷氨酰胺对吞噬细胞有着重要作用。

4. 谷氨酰胺的前景展望

谷氨酰胺转氨酶 篇3

关键词：免疫应激,谷氨酰胺,生产性能,仔猪

在畜禽生产中, 畜禽免疫系统由于受细菌、病毒和内毒素等的攻击而处于激活状态。免疫系统激活导致畜禽采食量、增重和瘦肉沉积下降, 这种现象称为“免疫应激”。目前, 在动物营养免疫学研究中, 经常采用注射细菌脂多糖的方式建立动物免疫应激模型。虽然脂多糖模型不能完全模拟在实际猪场条件下的免疫应激, 但脂多糖确实能激活猪的免疫抵抗机制, 这为深入了解免疫应激导致感染和炎症的机制提供了依据。

近年来, 谷氨酰胺 (glutamine, Gln) 在动物营养中的作用日益受到关注。谷氨酰胺被定义为条件性必需氨基酸, 即在某种疾病和应激情况下是必需的。试验以注射脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS) 构建免疫应激模型, 研究谷氨酰胺对免疫应激仔猪生产性能的影响, 探讨谷氨酰胺对免疫应激仔猪的保护作用, 为营养调控畜禽的免疫反应、缓解免疫应激提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验日粮

选用96头平均体重为 (7.24±0.36) kg的长白×约克夏仔猪, (28±2) d 断奶后按体重相近的原则随机分为4个组, 1组为对照组, 饲喂基础日粮, 在断奶后第7天按体重注射100 μg/kg生理盐水;2组为免疫应激组, 在断奶后第7天按体重注射100 μg/kg脂多糖;3组为谷氨酰胺组, 饲喂谷氨酰胺浓度为1.2%的日粮, 在断奶后第7天按体重注射100 μg/kg生理盐水;4组为谷氨酰胺+免疫应激组, 饲喂含谷氨酰胺浓度为1.2%的日粮, 在断奶后第7天按体重注射100 μg/kg脂多糖。每组4个重复, 每个重复6头猪。基础日粮按照NRC (1998年) 标准配制, 配方见表1。

1.2 脂多糖溶液配制

精确称取脂多糖, 脂多糖的大肠杆菌血清型为055∶B5 (Sigma公司产品) , 用灭菌生理盐水配成浓度为500 μg/mL的溶液, 超滤除菌, 冻存。

1.3 试验设计

采用2×2 析因设计因子试验设计, 即日粮类型 (1.2% 谷氨酰胺日粮或基础日粮) 和免疫应激处理 (注射脂多糖或生理盐水) 。在试验第7 天, 2, 4组仔猪按体重注射100 μg/kg脂多糖, 1, 3组仔猪注射等量的生理盐水作对照。试验期14 d。

1.4 饲养管理

试验在沈阳农业大学科研猪场进行, 采用全封闭式猪舍, 漏缝金属地板, 不锈钢可调式料槽, 乳头式饮水器。仔猪饲喂粉料, 自由采食和饮水。按猪场常规管理程序进行驱虫和免疫。

1.5 测定指标

测定试验猪的日增重、采食量和料重比。

1.6 统计分析

所有试验数据采用SPSS12.0软件进行统计。对谷氨酰胺和脂多糖的效应进行方差分析, 多重比较用邓肯氏法。

2 结果 (见表2) 与分析

注:同列数据肩注字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 相同表示差异不显著 (P>0.05) ;*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) , ns表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表2可知:与2组相比, 谷氨酰胺显著提高了3, 4组仔猪日增重 (P<0.05) 和采食量 (P<0.05) 。脂多糖应激组 (2组) 显著降低了仔猪日增重 (P<0.05) 和采食量 (P<0.01) , 提高了料重比 (P<0.01) 。而日粮与应激的交互作用对日增重、料重比、采食量的影响均不显著 (P>0.05) 。

3 讨论

在免疫应激状况下, 动物生产性能明显下降。VanHeugten E等[1]和Dritz S S等[2]在试验中都发现了免疫应激抑制仔猪食欲的现象。在免疫应激状况下, 动物食欲的降低主要由白细胞介素-1 (IL-1) 和肿瘤坏死因子-α (TNF) 介导, 而IL-1对食欲的影响比TNF更大。另外, IL-1还可通过刺激小肠肽如胆囊收缩素 (CCK) 的分泌而引起食欲降低[3]。采食量降低的同时, 动物生长减慢, 饲料利用率也降低。注射脂多糖的猪, 其日增重和饲料利用率比没有注射脂多糖的猪分别降低了17.1%和17.0%。而仔猪受脂多糖刺激后, 其日增重和饲料利用率也显著下降[1]。此外, 免疫应激降低了猪的肌肉组织、体蛋白的生长或沉积速度, 降低了脂肪的生长或沉积速度[4]。这主要是因为免疫应激直接作用于中枢神经系统 (central nervous system, CNS) 或引发CNS细胞中细胞因子的合成, 从而改变了神经内分泌系统, 减少了生长激素和胰岛素样生长因子 (IGF-1) 的分泌[5], 增加了血浆类固醇激素水平, 同时也促进了儿茶酚胺的分泌, 而肾上腺素与糖皮质激素不仅对免疫系统产生负反馈作用, 同时也改变了胃肠道机能, 促进脂肪的分解与肌肉蛋白质的降解。

谷氨酰胺是一种免疫营养素, 可以缓解免疫应激现象。谷氨酰胺是哺乳类动物血液和组织中最丰富的一种游离氨基酸, 相对分子质量为146, 含2个氨基和5个碳原子, 其结构决定了它既能为其他氨基酸、蛋白质和核酸的合成提供氮源, 也可以像葡萄糖一样提供碳链, 氧化后释放能量:谷氨酰胺是蛋白质、氨基酸、嘌呤、嘧啶、核酸等生物分子合成的重要前体, 是体内许多生化代谢途径的中间体。谷氨酰胺分解后, 有62%的氮转变为其他氨基酸, 如瓜氨酸、脯氨酸[6]、鸟氨酸等。这为蛋白质合成提供了氮源。特别是当动物处于应激、快速生长期或病理状态时, 肠道对谷氨酰胺的吸收显著增加, 内源合成的谷氨酰胺不能满足需要, 如果不补充外源性谷氨酰胺, 则动物体内循环的谷氨酰胺量会显著下降, 影响动物生长及健康发育。研究显示, 及时、适量地补充谷氨酸胺能有效地防止肌肉蛋白的分解, 并可通过细胞的水合作用增加细胞的体积, 促进肌肉增长。谷氨酰胺还是少数几种能促进生长激素释放的氨基酸之一。刘涛报道, 在仔猪日粮中添加1%谷氨酰胺可以改善肌肉中RNA水平, 提高蛋白质的翻译效率, 缓解断奶对仔猪的影响, 继而改善生产性能。

4 结论

免疫应激使动物生产性能下降, 而添加谷氨酰胺使免疫应激仔猪日增重、日采食量提高, 料重比下降;日粮加应激交互作用对仔猪日增重、采食量、料重比的影响均不显著 (P>0.05) 。

参考文献

[1]VanHEUGTEN E, COFFEY M T, SPEARS J W.Effects of immune challenge, dietary energy density, and source of energy in perfor-mance and immunity in weanling pigs[J].J Anim Sci, 1996, 74:2431-2440.

[2]DRITZ S S, OWEN K Q, GOODBAND R D.Influence of lipopo-lysaccharide-induced immune chanllenge and diet complexity on growth performance and acute-phase protein production in segrega-ted early-weaned pigs[J].J Anim Sci, 1996, 74:1620-1628.

[3]DAUN J M, MCCARTHY D O.The role of cholecystokinin in inter-leukin-1-induced anorexia[J].1993, Physiol Behav, 1993, 54:237-241.

[4]WILLIAMS N H, STAHLY T S, ZIMMERMAN D R.Effects of chronic immune system activation on the rate, efficiency, and com-position of growth and lysine ceeds of pigs fed from6to7kg[J].J Anim Sci, 1997, 75:2463-2471.

[5]LANG C H, POLLARD V, FAN J, et al.Acute alterations in growth hormone-insulin-like growth factor axis in humans injected with endotoxin[J].Am J Physiol, 1997, 273:371-378.

L-丙胺酰-L-谷氨酰胺的合成 篇4

谷氨酰胺是体内含量最为丰富的氨基酸之一。作为机体必需氨基酸, 对多种器官及组织细胞具有重要而独特的代谢功能。但是, 由于谷氨酰胺的水溶性 (36g/L) 并不好, 故直接将谷氨酰胺用作肠外营养剂效果并不好。而谷氨酰胺与丙氨酸缩合形成的二肽产物--丙氨酰-谷氨酰胺具有较好的水溶性 (586g/L) 。同时, 又因为在谷氨酰胺在溶液中不稳定, 在加热灭菌时可生成有毒的谷氨酸和氨。故, 人们选用丙氨酰-谷氨酰胺作为肠外营养的一个重要组成部分, 丙氨酰-谷氨酰胺在进入人体内可以很好的分解为丙氨酸和谷氨酰胺, 且没有任何副作用。丙氨酰-谷氨酰胺作为一种肠外营养剂在治疗和辅助治疗许多疾病发挥出了许多显著的功效。

丙氨酰-谷氨酰胺作为目前公认的肠外营养的一个十分重要的组成部分。国内外都已公布了一些合成丙氨酰-谷氨酰胺的方法, 但是这些方法要么步骤繁琐, 要么要用到剧毒物质, 不利于管理;要么成本过高, 都不适合在国内进行工业生产。

基于以上原因, 本课题研究内容包括:

(1) 设计一条合理简单可行的丙氨酰-谷氨酰胺的合成路线;

(2) 分离纯化丙氨酰谷-氨酰胺。

2 实验路线的设计与选择

N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺常用的合成路线有以下三种。

(1) 线路一。线路一以L-丙氨酸为原料;采用二碳酸二叔丁酯保护丙氨酸得到Boc-丙氨酸;Boc-丙氨酸的羧基用不同试剂活化生成不同的活性中间体;接着与L-谷氨酰胺在碱性条件下缩合生成BOC-丙氨酰-谷氨酰胺;然后用TFA水解脱去保护基得到N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。该线路步骤较多, 合成繁琐, 所以总产率很低。

(2) 线路二。线路二以L-丙氨酸为原料, 与COCl2反应生成N-羧酸酐, 然后与L-谷氨酰胺在水中反应, pH值保持在10左右, 得到N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。该方法反应步骤少而简单, 但该反应使用到的光气为剧毒物质, 不利于管理, 且对从业人员的操作规范要求极高, 万一泄露会造成极大的危险和财产损失。

(3) 线路三。以高光学纯度的手性试剂氯丙酸为起始原料;与氯化亚砜反应生成氯丙酰氯;然后与L-谷氨酰胺在碱性条件下反应得到;最后在浓氨水中氨解得N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。国外申请的专利大多为此种方法。该工艺步骤少, 合成简单, 但是所用原料为手性试剂, 极为昂贵, 不适合用于大规模工业生产。同时在合成酰氯的步骤中所需温度较高, 会产生较多副反应, 在最后一步中可能产生内消旋体, 对分离造成困难。

鉴于以上N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺合成路线的缺陷, 我们设计了以下合成路线。整个合成路线简洁, 操作简单, 所用试剂安全性相对高、毒性小, 成本低, 试剂管理简单, 使得该法具有很高的工业应用前景。

该线路以L-丙氨酸为原料, 采用二碳酸二叔丁酯保护丙氨酸氨基得到Boc-L-丙氨酸;Boc-L-丙氨酸在氯化亚砜中酰化成环, 得到N-羧基酸酐;最后在碱性环境下与谷氨酰胺缩合得到N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

3 实验部分

3.1 Boc-L-丙氨酸的合成

250ml的单口烧瓶中加入100ml水和10ml四氢呋喃, 加入L-丙氨酸0.7423g (0.0084mol) 。0℃下加入碳酸钠1.7681g (0.01668mol) 和二碳酸二叔丁酯2.0056g (0.0092mol) , 室温 (16℃-18℃) 反应12小时。用稀盐酸调pH至2, 用乙酸乙酯 (100ml) 萃取3次, 用饱和食盐水洗3次, 加入干燥剂干燥8小时。过滤, 35℃下负压 (-0.9MPa) 悬蒸, 得到Boc-L-丙氨酸, 0.7072g, 0.00795mol, 94.6%。m.p.74.2℃-75.9℃。

3.2 N-羧基酸酐 (NCA) 的合成

100ml的单口烧瓶称取氯化亚砜8.925g (5.45ml, 0.075mol) , 0℃下加入2.835g (0.015mol) Boc-L-丙氨酸。0℃下反应90分钟。室温下负压 (-0.9MPa) 悬蒸浓缩至20ml左右。加入正己烷 (约80ml) , 静置10分钟, 用布氏漏斗抽滤。取滤出固体用四氢呋喃溶解, 过滤。取滤液在25℃下负压 (-0.9MPa) 悬蒸浓缩至20ml左右。加入正己烷 (约80ml) , 静置10分钟, 用布氏漏斗抽滤, 滤出固体即N-羧基酸酐, 0.9356g, 64.8%。m.p.81.2℃-84.9℃;1H-NMR (CDCl3) , δ:4.442 (s, 1H) , 1.586 (s, 3H) ;GC-MSm/z:115。

3.3 N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成

250ml的单口烧瓶中加入50ml纯水, 依次加入1.46g的谷氨酰胺 (10mmol) , 0.4g氢氧化钠固体 (10mmol) , 1.06g无水碳酸钠 (10mmol) , 混匀。加入50ml四氢呋喃。取1.38g N-羧基酸酐 (NCA) (12mmol) , 用10ml四氢呋喃溶解, 在0℃下逐滴加入。室温 (15℃-20℃) 下反应60min。分液, 用四氢呋喃 (约40ml) 洗3次, 取水层。用离子交换树脂分离即为N- (2) -L-丙氨酰-L-谷氨酰胺, 1.807g, 83.3%。m.p.213.8℃-214.9℃;1H-NMR (D2O) , δ:4.096 (s, 1H) , 3.686 (s, 1H) , 2.234 (s, 2H) , 1.229 (s, 4H) ;LC-MS[M-1]-, m/z:216。

4 结论

丙氨酰-谷氨酰胺是肠外营养的一个极其重要的组成部分。我们以廉价的L-丙氨酸为原料, 经过二碳酸二叔丁酯保护氨基得到Boc-丙氨酸, 再经过氯化亚砜酰化反应得到NCA, 再与L-谷氨酰胺反应得到丙氨-酰谷氨酰胺, 最后用弱碱性离子交换树脂分离纯化产物。此路线步骤简单, 分离出的产物纯度高, 使用原料价格低廉, 所用反应物毒害低、污染小, 很有利于工业化生产的进行。

摘要：丙氨酰-谷氨酰胺是肠外营养的一个重要的组成部分。人们已经证明了丙氨酰-谷氨酰胺具有调节机体蛋白质合成、维持机体氮平衡、维护肠道完整性、增强机体免疫力以及保护肝脏的功能。丙氨酰-谷氨酰胺已经在国外进入了工业生产阶段, 而国内现阶段研究的合成方法步骤繁琐而造成最终产率较低, 不利于工业生产。基于此, 本课题以L-丙氨酸为起始原料设计了一个新的合成路线, 成功合成了L-丙氨酰-L-谷氨酰胺, 经离子交换树脂分离纯化得到了纯产品。整个合成路线简洁, 操作简单, 所用试剂毒性低, 便于管理。产品丙氨酰-谷氨酰胺经核磁、质谱、熔点检测, 各项指标均相符。丙氨酰-谷氨酰胺新的合成方法开发成功。

谷氨酰胺转氨酶 篇5

1 L-Gln的性质

1.1 L-Gln的理化性质

L-谷氨酰胺(L-Glutamine),又名左旋麸氨酰胺(L-2-Aminoglutatamic acid),分子量:146.14,是L-谷氨酸的r-羧基酰化的一种蛋白质氨基酸。结构式:

L-谷氨酰胺是一种白色斜方晶系晶体或结晶性粉末,无臭无毒,有微甜香味。熔点:184～185℃,结晶状态下稳定,对酸、碱、热水不稳定,可水解成L-谷氨酸[2],溶于水(4.25 g、100 mL,25℃下),难溶于乙醇、乙醚等有机溶剂,比旋光度 (C=10.2NHCl) [2,3]

1.2 L-谷氨酰胺的生理特性

L-谷氨酰胺是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一,作为血液中和体内游离氨基酸池中含量最丰富的条件氨基酸,主要储存在脑、骨骼肌和血液中,具有很广泛的生理作用:(1)维持机体免疫功能。现有资料表明谷氨酰胺不仅是淋巴细胞和巨噬细胞的重要能量物质,甚至可能是各种免疫细胞的主要能源物质。小肠作为人体重要的最大免疫器官,是利用L-谷氨酰胺的主要器官,它的吸收细胞以很高的速率利用谷氨酰胺,说明谷氨酰胺在机体免疫中发挥着十分重要的作用。(2)调节蛋白质的合成和分解。谷氨酰胺是蛋白质合成的重要调节剂,在运动中可以调节蛋白质合成和降低肌肉蛋白质的分解,从而维持机体的生理功能。(3)谷氨酰胺是机体内氮和碳的重要运载工具。(4)维持体内酸碱平衡。谷氨酰胺可以作为肾脏生成的氨的载体,直接参与氨的代谢,从而起到维持酸碱平衡的重要作用。(5)调节糖代谢。谷氨酰胺可以通过糖异生作用生成葡萄糖,维持血糖浓度平衡。(6)细胞燃料。谷氨酰胺为快速生长和分化的细胞(如血管内皮细胞、淋巴细胞、肠粘膜上皮细胞等)提供能量来源。每1 mol·L-1的谷氨酰胺直接经三羧酸循环可以产生30 mol·L-1的ATP。故谷氨酰胺产能对谷氨酰胺依赖性细胞(特别是小肠粘膜细胞,对谷氨酰胺具有很高的摄取率和利用率)具有更加重要的意义。此外,谷氨酰胺还有作为氨流动的重要载体,大分子的合成前体,胃肠管腔细胞的基本营养来源,在血液中暂时解除氨毒的作用等[4,5,6]。

2 L-谷氨酰胺用途

2.1 L-谷氨酰胺在食品上的用途

L-谷氨酰胺是一种特殊的氨基酸,为快速繁殖细胞优先选择的呼吸燃料,大量的证据表明谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸,在应激情况下,机体对谷氨酰胺的需要超过其合成能力。因此,可以通过肠外营养或饲料中添加谷氨酰胺以营养调控的方式加速动物体的康复。另外,谷氨酰胺将在食品增香方面展示其独具的特色,见表1。

2.2 L-谷氨酰胺在药物方面的用途

谷氨酰胺作为一种极有发展前途的新药,正成为营养学、生理学、免疫学等学科领域的研究热点。L-谷氨酰胺的缺乏会引发多种疾病,及时补充对机体各种机能有着广泛而重要的影响。1979年日本首先将其作为抗溃疡药物投放市场,如日本寿制药株式会社生产的“麦滋林”,为L-谷氨酰胺/萸磺酸钠颗粒剂,能治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡,疗效和经济效益十分显著,该胃药制剂现已进入我国市场。近年来国外临床研究证明谷氨酰胺可以治疗腹部溃疡、节段性回肠炎、过敏性肠炎和溃疡,医学研究表明,L-谷氨酰胺还可用于治疗运动员的运动综合症、恢复高强度劳动或运动后的疲劳,并有重建免疫系统、辅助治疗肝病等功能,它还有减少癌症治疗中放疗和化疗的副作用。此外还有用作改善脑功能、增进脑神经机能和用于治疗酒精中毒等,在发达国家,谷氨酰胺被认为是运动员提高成绩之营养配方中的基本的成分。目前,L-谷氨酰胺已大量用于治疗运动员的运动综合症或运动后的恢复。因此谷氨酰胺的开发对我国的氨基酸事业及医疗保健事业将是一个很大的贡献,其社会效益明显[7,8]。

2.3 L-谷氨酰胺在饲料中的运用

含谷氨酰胺的饲料可以增加肠道对谷氨酰胺的摄取,激活谷氨酰胺转运载体,刺激肠粘膜细胞谷氨酰胺酶的活力。饲料中补充谷氨酰胺可以明显改善由于断奶应激所造成的损害,防止肠绒毛的萎缩,维持肠道正常的形态和结构,改善幼仔的生产性能。经研究确认,在饲料中添加1.0%的谷氨酰胺,在幼仔断奶后第一周可防止空肠绒毛萎缩,第二周可提高饲料利用率[9]。

2.4 L-谷氨酰胺在运动保健品中的应用

在体育界,血浆L-谷氨酰胺水平作为评价过度训练的一个指标备受关注。测定血液中的L-谷氨酰胺可作为过度训练的检测、评价指标。健美爱好者及竞技运动员在进行高强度的力量训练时,体内L-谷氨酰胺的水平可下降50%,此时及时补充L-谷氨酰胺能有效地防止肌肉蛋白的分解。口服L-谷氨酰胺能使生长激素的水平提高4倍,并使胰岛素分泌增加,促进肌肉的生长和身体的增高、增强。L-谷氨酰胺正成为运动员、健美人士不可缺少的重要营养补充剂。国内康比特的国L-谷氨酰胺胶囊和颗粒以及力邦的力康舒都以谷氨酰胺为原料,有着较好的市场;欧普特蒙、宝莱、肌崩科技、韦德营养等欧美谷氨酰胺产品在全球都取得了非同寻常的业绩。

3 L-谷氨酰胺的生产方法

谷氨酰胺的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶法:

3.1 化学合成法

化学合成法是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制备氨基酸的方法。L-谷氨酰胺的化学合成有六条工艺途径,以下介绍两种主要的合成方法:

(1)国外在四、五十年代提出了在硫酸的催化作用下,L-谷氨酸为原料经酯化、综合、加成、水解合成L-谷氨酰胺是工业合成的传统方法。国内目前也大多采用这种方法[10]。工艺路线如下:

该法首先将L-谷氨酸与甲醇成酯,然后加入二硫化碳,使其与氨基反应生成氨基二硫代甲酸铵保护氨基,通入氨气直到饱和,放置4～5 d,然后减压浓缩除去氨,加入冰醋酸脱除二硫化碳,减压蒸出溶剂即得L-谷氨酰胺。此法已用于工业生产。这条工艺路线以目前已大量生产的廉价的L-谷氨酸为原料,操作简单、条件温和、易于控制。但这种方法工艺路线长,产出率低。生成的酯化液需用氨中和,生成大量的硫氨副产物。

(2)首先制得L-谷氨酸-r-甲酯,然后直接与水合肼反应,得到L-谷氨酰肼,最后用Raney镍还原,即得L-谷氨酰胺[11]。

由合成法的流程图可见各步均使用了浓硫酸作为必需的试剂且需大量二硫化碳,条件比较苛刻不易控制,而且步骤多收率低。第二种方法虽有所改进,但仍很复杂,而且要求使用催化剂,对工艺条件提出了新的要求,工艺仍很复杂。

合成法使用了大量的化学试剂,在产品中不同程度的会有所残留,谷氨酰胺作为一种口服药,其纯度有较高的要求,使用合成法就限制了产品的质量以及使用范围。而且采用合成法还会对环境造成不良的影响,增加了产品的成本。

3.2 发酵法

(1)用谷氨酸产生菌野生菌株通过改变发酵条件产生Gln

1961年木下一干等人首次发现,在谷氨酸发酵液中,除了谷氨酸以外,还有谷氨酰胺。1979年,中西透等人经进一步实验证实,改变发酵条件可以使谷氨酸产生菌,从发酵液制谷氨酸转向发酵制谷氨酰胺。转化机理如图4。

由图可以看出通过改变发酵过程中氮源的供给量,控制发酵的pH值以及添加有利于提高产量的金属离子等条件,创造了有利于合成Gln的环境:谷氨酸产生菌的Gln合成酶活力增加,而催化Gln分解为谷氨酸的谷氨酰胺酶活力受到抑制,从而Gln大量积累生成,谷氨酸的生成量减少。另一方面,由于细胞外环境的影响,Gln易从细胞中分泌出来,积累在发酵液中。而谷氨酸渗透性减小,滞留在细胞内,从而使发酵转化得以实现。

(2)用谷氨酸产生菌变异株生产Gln

以葡萄糖、乙酸或乙醇为碳源采用黄色短杆菌,谷氨酸棒杆菌等生产Gln。国内上海科技大学王福源等人,1984年用黄色短杆菌ATCCl4067发酵生产L-Gln,产量为30 g·L-1;徐建华等人于1986年用钝齿状杆菌Hu7251诱变得一高产菌株,其水平达到33～35 g·L-1;1991年张克旭等人用天津短杆菌经诱变得一高产菌株,其发酵水平为31.2 g·L-1[12,13]。

使用发酵法反应条件温和,操作简便,生产原料丰富而且成本低,无公害。通过比较可以看出,发酵法比合成法更有优势。

3.3 酶法合成Gln

酶法生产的主要反应为:

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用NH3及谷氨酸作为原料经合成酶催化生成Gln时,腺三磷(ATP)是必需的,然而因为ATP价格昂贵,难以在工业上应用;同时,酶反应底物NH4+、副产物二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制Gln的生成,反应终了时仅有少量的生成。因此此法不具工业意义。

1974年Tochikura等提出将酵母酒精发酵与纯化酶结合生产谷氨酰胺的方法后,酶法生产谷氨酰胺得到了人们的重视。木村光等人利用微生物发酵产生的化学能使ADP转换成ATP,同时控制糖和无机磷的浓度,由氨及谷氨酸来合成Gln获得成功。果糖-1,6-二磷酸发酵产生的化学能通过ADP←→ATP相互转化反应,能连续被用于从谷氨酸合成Gln的反应中,因此不需再大量加入ATP,同时因为没有副产物ADP的生成,所以Gln不受抑制而能顺利积累。在上述反应条件下,氨对生成Gln的抑制作用变得不明显。另外,酶法合成谷氨酰胺与发酵法相比具有许多优点,如反应步骤简单、副反应少、易分离、容易实现自动化等。由于具有上述优点,所以此法有可能用于工业生产[14,15]。

4 展望

谷氨酰胺转氨酶 篇6

机体内合成Gln的碳源主要来源于肌糖原、血糖和三羧酸循环的中间产物, 骨骼肌是内源性Gln合成和代谢的主要场所[2]。骨骼肌合成的Gln一方面通过血液循环运送到肾、肠和免疫系统的一些细胞 (如淋巴细胞、巨噬细胞) 所利用[3,4], 另一方面储存在骨骼肌中, 当血浆Gln下降时, 骨骼肌内的Gln就会释放入血, 以维持血浆Gln浓度[5]。由于Gln是肠黏膜细胞及某些免疫细胞的重要燃料[6,7], 骨骼肌在维持Gln的动态平衡中的重要性提示骨骼肌的活动很可能直接影响相关组织对Gln的利用, 并且与机体的运动能力有着密切关系[8]。

1 谷氨酰胺的主要生理作用

Gln的主要生理作用有以下几方面: (1) 氨载体功能:Gln结构上的氨基是各组织器官间氨转运的重要载体, 在肾脏作为氨的载体, 直接参与氨的代谢, 可以起到维持酸碱平衡的重要作用[9,10]; (2) 调节蛋白质的合成和分解:Gln所含的酰胺氮对所有细胞的生物合成是绝对必需的, 体内细胞可利用其合成嘌呤、嘧啶、氨基酸、蛋白质和核酸等生物大分子, 因此, Gln是蛋白质代谢的重要调节因子, 在运动中可以调节蛋白质合成和降低肌肉蛋白质的分解, 从而维持机体的生理功能[11,12]; (3) 维持机体免疫功能:Gln作为肠黏膜上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的重要能源底物, 如果Gln供应不足可以影响淋巴细胞、巨噬细胞的免疫功能应答, 而使机体的细胞免疫受抑制[11], 说明Gln在机体免疫中发挥着十分重要的作用; (4) 调节糖代谢:Gln是一种生糖氨基酸, 是肝糖原异生的重要底物, 维持血糖浓度平衡[13]; (5) 抗疲劳作用:Gln将运动时由于代谢加强而产生的大量的氨运送到肝、肾解毒, 从而维持血氨浓度的稳定, 防止氨对脑组织的毒性作用, 延迟中枢疲劳的出现; (6) Gln在保持小肠黏膜上皮结构和功能, 维持肠道黏膜的完整性上发挥着非常重要的作用[9]; (7) Gln是合成体内还原性谷胱甘肽的重要前提物质, 通过维持细胞内谷胱甘肽水平进而发挥细胞保护作用的[14]。

2 短时间大强度运动后血浆Gln的变化及其机制分析

2.1 短时间大强度运动后血浆Gln的变化

大量研究表明, 人在进行短时间 (<1h) 大强度的运动后血浆Gln浓度升高。Parry-Billings发现[15], 10×6s的短时间大强度的疾速跑能使血浆Gln浓度从556μmol/L上升到616μmol/L。Katz等[16]报道8名健康的男性受试者进行自行车运动, 运动强度为50%和97%VO2max, 分别用了10min和5.2min至疲劳, 运动后血浆Gln浓度明显增加。Bergstrom等[17]让4名健康受试者进行自行车运动, 运动强度为70%VO2max, 在运动的第10min和第20min进行采血检测, 发现血浆Gln浓度增加。Eriksson等[18]也研究发现机体以80%VO2max的运动强度运动后45min血浆Gln浓度从538μmol/L上升到666μmol/L。另外, Babij等[19]和Katz等[16]研究发现, 以100%VO2max的强度运动后血浆Gln浓度明显升高。Babij等[19]同时指出血浆Gln的升高与运动中机体的功率输出呈线性关系。

2.2 短时间大强度运动后血浆Gln变化的机制分析

Hood等[20]研究认为, 在运动中血浆Gln浓度增加, 表明在运动中NH3生成增多时, 谷氨酸充当NH3的缓冲剂合成Gln。在短时间大强度运动时, 一方面ATP供能增加, 嘌呤核苷酸降解, 即在ATP-AMP-IMP过程中释放NH3增多, 有助于骨骼肌合成Gln, 释放入血, 而使血浆Gln浓度上升;另一方面骨骼肌蛋白分解代谢增强, 释放Gln入血, 由于内脏器官本身存在的惰性, 短时间内对Gln的摄取利用并没有增强, 导致血浆Gln浓度增加。与此同时在短时间大强度运动后, 血液浓缩可能也是引起血浆Gln水平升高的重要因素[21]。对于骨骼肌中的Gln如何释放入血浆的机制尚不清楚, 是否具有浓度依赖性, 还有待进一步研究。

3 长时间耐力性运动后血浆Gln的变化及机制分析

3.1 长时间耐力性运动后血浆Gln的变化

大量研究结果显示, 在超过2h的持续耐力运动后, 血浆Gln浓度会比安静水平明显下降, 且这些降低会一直持续到运动后2～4h甚至更长时间;长时间运动, 运动强度对血浆Gln含量变化的影响较大。

R e n n i e等[2]监测了人3.5h的自行车运动, 运动强度为50%VO2max, 运动后血浆Gln浓度的变化。结果发现, 运动后即刻血浆Gln浓度下降至391μmol/L, 而运动4.5h后上升至482μmol/L。Robson等[23]研究18名健康男子3h的自行车运动, 运动强度为55%VO2max, 血浆Gln的浓度运动前为580μmol/L, 运动后1h下降至447μmol/L。然而, 18名健康男子以80%VO2max的强度运动至力竭, 血浆Gln浓度没有显著性改变。

Parry-Billings等[15]研究24名俱乐部运动员在进行马拉松比赛后, 血浆Gln的浓度呈显著下降。然而, 30km跑台运动和73%VO2max的自行车运动至力竭对血浆Gln的浓度无显著变化。Castell等[12]发现马拉松跑后1h血浆Gln含量下降大约20%。另外, 研究8名铁人三项的运动员, 在2.5km的游泳、81km的自行车运动和19km的跑步后, 比赛前血浆Gln含量为468μmol/L, 而比赛后2h下降至318μmol/L[24]。

3.2 长时间耐力性运动后血浆Gln变化的机制分析

金其贯 (2003) 等[25]指出, 长时间运动后血浆Gln水平下降主要表现为以下几个方面: (1) 人体血浆中Gln是一种主要的糖异生的前体, 由Gln异生为葡萄糖的过程与丙氨酸转化为糖的过程相似, 当肝糖原耗竭时, 血糖含量下降, 肝脏利用血液中的前体—Gln、丙氨酸和甘油合成葡萄糖的速率增加; (2) 运动引起生长激素的含量升高, 刺激肠和肾脏对血浆Gln的摄取; (3) 胰高血糖素和皮质醇的升高可以增加肝脏对血浆Gln的摄入, 增加血浆Gln的利用用于糖异生和急性反应蛋白的合成。

运动过程中血浆Gln主要来源于骨骼肌, 综合上述文献报道, 不难发现, 一般低于1h的运动血浆Gln含量升高, 长于2h的运动血浆Gln含量降低。然而介于1～2h的运动血浆Gln含量报道却有降低、不变和升高的变化。

在骨骼肌中, Gln是通过立体特异的, 可饱和的机制 (Nm系统) 来运输的, 这种机制快于其他氨基酸的转运机制, 它是Na+依赖性的, 运动应激使肌细胞内Na+含量升高, 促使骨骼肌内Gln转运释放入血液[22,26,27]。Sahlin等[28]研究在进行75%VO2max自行车运动中, 大腿肌肉释放的Gln增加2倍, 有力地支持了这一观点。另外, Rennie等[22]报道机体进行3.75h的50%VO2max自行车运动后, 肌肉Gln水平从21.6mmol/kg湿重下降至14.3mmol/kg湿重。说明, 长时间运动血浆中Gln水平变化主要取决于骨骼肌的合成与利用, 并具有时间依赖性变化。

我们可把长时间 (<3h) 运动过程粗略分为初期、中期和后期。初期, 血浆皮质醇升高促进蛋白质分解, 其中, BCAA氧化分解结合葡萄糖-丙氨酸循环是长时间运动中蛋白质分解增加的主要机制[29], 而且BCAA中的氮是合成Gln所必需的, 因此运动中BCAA分解加速通常伴随着骨骼肌释放Gln的增加[30], 从而使血浆Gln水平升高。后期, 一方面由于运动降低了Gln合成酶的最大活性 (Gln合成酶反应是ATP依赖性) , 加上BCAA转氨反应消耗了三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸, 从而可能破坏三羧酸循环的正常进行, 骨骼肌合成Gln所需碳链减少, 导致Gln合成减少;另一方面糖原储备耗竭, 血糖浓度降低, 促进血浆Gln转运入肝脏, 进行糖异生作用加强, 合成血糖, 为运动持续进行提供能量及维持血糖恒定[31,32];综合这两方面运动后期导致血浆Gln利用的恶性循环, 致使血浆Gln水平降低。基于上述分析, 不难理解中期为初期和后期的过渡时期, 介于1～2h的运动血浆Gln水平报道有降低、不变和升高, 其主要原因可能是运动负荷量的不同及采血时间的不同导致血浆Gln浓度变化的不同。

另外, 我们不容忽视对于一些超长时间 (>3h) 运动的研究。比如Lehman M[33]对7.5km游泳+360km自行车+85km跑的研究, 发现运动后血浆Gln浓度无明显变化。William等[34]运用示踪法研究了在静止状态和180min小于45%VO2max跑台运动丙氨酸 (Ala) 和Gln的动力学, 结果显示, 从休息到运动状态, Ala浓度升高, 而Gln浓度并未因运动而显著改变。其可能原因是超长时间运动中, 机体适应, 并且糖原一般可以得到及时补充, 故而Gln消耗和生成接近平衡, 因此表现为运动后血浆Gln浓度无明显变化。

4 过度训练后血浆Gln的变化及机制分析

4.1 过度训练后血浆Gln的变化

运动员长时间训练导致的身体疲劳和机能下降不能在短时间内恢复, 使其疲劳症状不断增加或积累且运动成绩下降, 这种训练称为过度训练。现研究显示, 过度训练的运动员表现出安静时的血浆Gln浓度低于普通水平, 过度训练后的血浆Gln含量显著性降低, 达到训练前血浆Gln含量的恢复时间明显滞后。

Rowbottom等[35]通过检测血浆Gln含量时发现, 过度训练的运动员血浆Gln浓度为703μmol/L, 低于一般对照组和同年龄的运动员 (分别为1030μmol/L和1179μmol/L) 。Bishop等[36]研究运动员在过度训练后血浆Gln含量可下降约30%。Parry-Billing等[15]研究报道, 健康的运动员为 (550±14) μmol/L, 而过度训练的运动员血浆中Gln含量为 (503±12) μmol/L, 两者相差9%。另外, 有人对参加1992年奥运会的优秀运动员进行监测, 发现在比赛后过渡训练组血浆Gln浓度显著下降, 比赛后进行小强度的恢复性训练恢复时间明显延长[37]。Kargotich S等[38]监控6周的渐增耐力训练稳定的增加血浆Gln含量, 与以前的过渡训练运动员血浆Gln含量下降形成鲜明对比, 可能表明监控训练应答时是有益的。

Kargotich等[39]研究建立良好的训练游泳运动员血浆Gln恢复和时间变化过程的模式。研究1:16名优秀男性游泳运动员进行15×100m运动练习, 分为2组, 分别要求进行100m游泳达到最快自由泳速度的70%和95%, 安静状态下的静脉血浆Gln水平作为对照。在运动前、运动后即刻、运动后30min、60min、120min、150min采集静脉血样本。研究2:70%组不运动作为对照。95%组重复进行运动, 在运动前、运动后即刻、运动后2h、4h、6h、8h采集静脉血样本。研究1中, 与安静时血浆Gln浓度比较, 70%组没有差异, 但是95%组在恢复期中非常显著性下降。研究2中, 70%组不运动没有变化, 95%组重复运动后再次下降。提示, 血浆Gln作为过渡训练的信号, 在训练计划中做好测量血浆Gln的合适时间。另外, Smith DJ等[40]研究认为血浆Gln可以作为早期诊断过度训练的指标, 并建立了运用Gln与谷氨酸 (Glu) 的比值来判定过度训练的参考模式。

4.2 过度训练后血浆Gln变化的机制分析

过度训练后导致血浆Gln浓度下降的机制可能与下列因素有关: (1) 过度训练导致机体内环境稳态失衡, 能量代谢产生障碍, 促使Gln糖异生作用增强; (2) 长时间运动, 肌肉不断的收缩与舒张, 影响了骨骼肌Gln释放入血的速率, 从而影响了血浆Gln的水平; (3) 过度训练降低了Gln合成酶的活性[31], 使Gln合成减少; (4) 运动训练后期, 随着糖原逐渐消耗, 支链氨基酸代谢逐渐增加, 因此, 三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸消耗增加, 而使合成Gln所需要的碳链大幅度减少, 最终导致Gln合成减少。

5 小结

谷氨酰胺转氨酶 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009年3月至2011年1月在广州医学院第一附属医院医院普外科接受胃癌根治术的患者126例纳入本研究。入选标准: (1) 年龄30岁以上; (2) 无明显手术禁忌; (3) 患者知情同意; (4) 甘油三酯或胆固醇不超过正常值上限的2倍; (5) 无肝肾功能不全.

1.2 方法:

将126例患者随机分为研究组和对照组, 每组63例。研究组和对照组患者分别于术后连续9d静脉输注中/长链脂肪乳注射液 (华瑞制药有限公司生产) 等, 研究组另加给予丙氨酰谷氨酰胺20g/d (多蒙特, 四川科伦药业股份有限公司生产) , 术前和术后第1天、第8天取患者清晨空腹外周静脉血10mL作为检测样本。

1.3 观测指标:

1.3.1 肝功能指标

包括总胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶。

1.3.2 血浆蛋白

检测血浆总蛋白、白蛋白。

1.3.3 免疫功能

测定IgA、IgM、IgG, CD3、CD4、CD8百分比及CD4/CD8比值。

1.4 统计学分析

采用SPSS10.0统计软件, 数据以均数±标准差表示, 组间比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝功能指标比较

注:P1:两组术前指标间比较;P2:两组术后第1天指标间比较;P3:两组术后第8天指标间比较;P4:两组术后第1天与术后第8天指标间差值比较

研究结果显示两组在肝功能多项参数方面差异均无统计学意义, 表明两组对中∕长链脂肪乳和丙氨酰谷氨酰胺的耐受性和安全性均令人满意。

2.2 两组血浆蛋白指标比较

本研究结果显示, 研究组血浆1gA、1gG明显高于术前和对照组, 提示体液免疫功能得到改善。研究组CD3、CD4百分比及CD4/CD8比值均明显高于对照组, 则显示出细胞免疫也相应得到改善。而细胞免疫功能的稳定有赖于辅助性T细胞和抑制性T细胞两亚群间的平衡, 可间接通过CD4CD8比值来反映。本研究结果表明, 谷氨酰胺是通过对T细胞亚群数量和功能两方面的作用来改善免疫功能的。

注:与治疗前相比, a:P<0.05, b:P<0.01;与对照组相比, c:P<0.05, d:P<0.01

3 讨论

谷氨酰胺是人体含量最为丰富的游离氨基酸, 其血浓度为0.5-0.9mmol/L, 约占所释放氨基酸总量的三分之一, 在机体各部位发挥重要作用, 是蛋白质合成的调节因子, 能促进蛋白质合成, 减少骨骼肌的分解。谷氨酰胺水溶解度差, 在溶液中不稳定, 所以普通氨基酸输液中不含有谷氨酰胺。水溶性高的丙氨酰谷氨酰胺的出现使通过静脉补充谷氨酰胺成为可能。丙氨酰谷氨酰胺是一个双肽, 进入体内分解为丙氨酸和谷氨酰胺二种氨基酸。谷氨酰胺还是免疫细胞的重要能源物质, 并能为其他氨基酸和蛋白质的合成提供氮源, 当谷氨酰胺量减少时, 淋巴细胞就不能正常分裂, 巨噬细胞功能将受到严重影响[3]。

本研究结果显示, 丙氨酰谷氨酰胺能明显提高患者胃癌术后体液免疫和细胞免疫功能并有助于血浆总蛋白和白蛋白改善。

综上, 对于胃癌术后患者在常规治疗的基础上加用丙氨酰谷氨酰胺能提高患者免疫功能, 改善血浆蛋白, 达到促进康复, 改善预后的作用, 且使用安全, 经济, 具有很好的临床应用价值。

摘要：目的 研究丙氨酰谷氨酰胺在胃癌术后应用对肝功能、血浆蛋白和免疫功能的影响。方法 研究组和对照组胃癌术后均连续给予9d肠外营养支持, 其中研究组另加给予丙氨酰谷氨酰胺20g/d, 比较两组患者治疗前后肝功能、总蛋白、白蛋白、IgA、IgG、IgM、CD3、CD4及CD4/CD8比值。结果 研究组术后第8天血浆总蛋白和白蛋白值较对照组高, 但差异无统计学意义;肝功能指标两组间差异不明显;研究组IgA、IgG、IgM含量和CD3、CD4百分比及CD4/CD8比值均明显高于对照组 (P<0.05) 。结论 丙氨酰谷氨酰胺在胃癌术后患者使用是安全有效的, 能明显提高胃癌术后患者的免疫功能, 有助于改善胃癌术后患者血浆总蛋白和白蛋白的含量, 但对肝功能的影响较小。

关键词：丙氨酰谷氨酰胺,胃癌,免疫功能,肠外营养

参考文献

[1]Hanna Mk, Kudsk KA.Nutrition and pharmacological enhancement ofgut-associated lymphoid tissue[J].Can J Gastroenterol, 2000, 14 (SupplD) :145D-151D.

[2]klimberg, V komhluth, J Cao, Y, et al.Glutamine suppresses PGE2synthesis and breast cancer growth[J].J Surg Res, 1996, 63 (1) :293-297.