谷氨酸钠悬浊体系的拉曼光谱定量分析

1.引言

工业结晶是药物、有机化合物等产品分离、纯化与精制的关键技术。在结晶的过程中,在固体物质溶解的同时,溶液中还进行着一个相反的过程,即已溶解的溶质粒子撞击到固体溶质表面时,又重新变成固体而从溶剂中析出。那么当悬浮液进入冷却阶段后,体系中同时存在着溶液相与固体相,在对此体系进行定量分析时,其中的固体颗粒便会对其分析结果产生影响、造成误差。固在此种情况下,需要发展一种可以消除干扰的准确光谱定量分析方法亦是一种优良的校正模型。

传统的多元统计方法：主元分析法(Principal Component Analysi,PCA)、偏最小二乘法(Partial Least Square,PLS)、Fisher判据分析(Fisher Discriminant Analysis[1],FDA)、因子分析法(Factorial Analysis[2],FA)和主成分回归分析(Principal Component Regression,PCR)等模型并没有明确地阐明固体量的变化与样本光谱强度变化之间的定量关系，因而不能有效地消除样本固体量的差异对光谱定量分析结果的影响。

目前，人们通常使用Extended Inverse Scatter Correction-EISC、Multiplicative Signal Correction-MSC、Standard Normal Variate-SNV以及Extended Multiplicative Signal Correction-EMSC等光谱预处理方法来试图消除非目标因素变化对样本拉曼光谱产生的影响。但是以上光谱预处理方法均对待测体系有着极其苛刻的要求，例如：EISC、MSC和SNV要求不同样本间化学成分变化很小，光谱形状具有高度相似性;而EMSC的使用则要求首先获得复杂样本中每一个组分的纯光谱。实际应用中，这些要求都是很难满足的。针对这一问题，本文将研究一种可高效、准确地对悬浊体系进行拉曼光谱定量分析的方法，它是基于陈增萍等开发出的光程估计与校正方法(Optical Path Length Estimation and Correction,OPLEC)[3]发展而来的一种乘子效应模型。该方法的出现解决了复杂体系样本物理性质以及光谱仪器光学系统参数等非化学组分因素变化对校正样本光谱信号的乘子效应的估计问题，使得在不对样品进行任何处理的情况下，直接使用光谱仪器对固体、粉末或悬浮体系的定量分析成为可能;而且该方法使用简单、性能优良，非常适合实际复杂体系(如：悬浮体系)原位实时光谱定量分析。本文将应用此方法对一模型悬浮体系(谷氨酸钠溶液与固体颗粒混合物)进行拉曼光谱定量分析，探索出悬浊体系的拉曼光谱准确定量分析方法。

2.实验原理

(1)拉曼光谱测量悬浮介质的乘子效应模型(Mul-tiplicative Effects Model,MEM)

对于K混浊样品,其总拉曼强度可以近似表示为溶液相成分和固态散射体作用的线性组合[4]。

其中,Ik是测得的样本k的拉曼光谱;Io,k是记录样本k的拉曼光谱时的激发辐射强度。nk,i是由光源照射及由光谱仪观察出的,样本k的溶液相中第i个待测物的分子数。nk,j 是由光源照射及由光谱仪观察出的,样本k的固相中第j个待测物的分子数。rs,i是一个复合项,它代表了整体光谱仪的响应以及溶液相中第i个待测物的自吸收和分子散射特性。而rp,j是固态相中第j个待测物的相应项。ms和mp分别表示溶液相和固态散射体的成分数。引入型号参数bk和dk分别用以说明固态散射体对于溶液相和固态成分的拉曼作用的乘子效应。

假设Vk表示被光源照亮及通过光谱仪观察的样品k的体积,ck,i表示第i个待测物在样品k溶液相的浓度。公式(1)转换为:

公式(2)清楚地表明,由于存在固态散射体而引起的乘子效应,混浊样品的拉曼光谱与溶液相化学成分的浓度、激发辐射的强度可能的多样性和由光谱仪分析出的实际样品的体积均不呈线性关系。乘子效应校正的关键是实现准确测定混浊介质的溶液相中的待测物。

(2)混浊体系中液相组分的测定

正如公式(2)所示,模型参数bk*代表固态散射体对于样本拉曼光谱的乘子效应。不同的样本,其模型参数bk*通常是不同的。为了从混浊样的拉曼光谱中获取液相待测组分的定量信息,首先需要获得每一混浊样品参数bk*的信息。让我们任意假设溶液相的第一个化学成分是目标待测物。当样本中某种组分(它可以是一个真实的或抽象组分)的含量在所有样本中是不变的(如,ckj=cconstand,k=1,2…,K且i≠1)或(k=1,2…,K),那么可以证明Ik和bk*之间以及Ik和bk*·ck,1之间存在线性关系。K个校正样本的乘子参数bk*(k=1,2…,K)可以用改良光程估算与校正(OPLECm)方法来估计。获得K个校正样本的乘子参数矢量b*(b*=[b*1; b*2;…;b*k])后,可以采用多元线性校正方法(如PLS)建立以下两个校正模型。

其中,Xcal=[I1;I2;…;IK];c1=[c1,1;c2,1;…;cK,1]; diag(b*)为一个对角矩阵,其对角元素为b*中的响应元素。1是一个列向量,其各元素均等于1。在估算出α1,α2,β1和β2后,根据公式(4)可有效消除固态散射体对测试样本拉曼光谱信号(Itest)的乘子效应,从而获得测试样本中液相目标分析物的浓度。

3.实验过程

(1)实验仪器与试剂

仪器:激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪(invia-re-flex,英国Renishaw),蠕动泵驱动器,8411型电动振筛机(配有各种标准筛网),研钵,电子天平,实验室超纯水系统(ACD-2001-U,艾科浦),磁力搅拌器(DC-系列多功能搅拌器),玻璃毛细管。

试剂:L-谷氨酸钠固体颗粒(分析纯级)购于上海国药集团化学试剂有限公司。

(2)参数设置

激光波长为785nm,物镜为50倍长焦物镜,曝光时间为20s,扫描次数为3次,扫描波长为800-1600cm-1。

(3)实验方法

首先,使用研钵将谷氨酸钠固体颗粒研磨成粉末,再将研磨后的粉末通过160目标准筛网,筛选出粒径小于96µm的谷氨酸钠颗粒。接着,称取适量的谷氨酸钠固体颗粒溶于500ml纯水中,配制成谷氨酸钠饱和溶液(3.65mol/l)。分别取不同量的饱和谷氨酸钠和超纯水于25ml小烧杯中,配置7种不同浓度的谷氨酸钠溶液(如表1所示)。然后分别称量5种不同量的已筛选出的谷氨酸钠固体颗粒,加入含有相同饱和谷氨酸钠溶液的小烧杯中,磁力搅拌使其混合均匀形成5个悬浊体系样本(如表2所示)。以上每种样本分别配制3个试样,一共可得到36个试样。

将毛细管与硅胶管组成一条通道,连接到蠕动泵驱动器上,再将毛细管部分放在激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪的载物台上,打开蠕动泵驱动器分别通入以上各样品形成流动相,用激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪检测各试样的拉曼信号,一共可得到36条光谱。

4.数据分析

本实验以谷氨酸钠悬浊液为模型悬浊体系,验证上述提到悬浊体系的乘子效应模型的预测性能。实验中将所获得拉曼光谱数据划分为21个校正集样本(样品编号:1～3,7～9,13～15,19～24和31～36)和15个预测集样本(样品编号:4～6,10～12,16～18和25～30)。分别用乘子效应模型和PLS以及光谱预处理方法(EISC、MSC和SNV)与偏最小二乘回归法(PLS)相结合所建立的光谱校正模型对样本的拉曼光谱数据进行分析。实验中为了便于表达,我们分别用PLS-EISC、PLS-MSC、PLS-SNV来表示光谱预处理方法与PLS相结合所建立的校正模型。各校正模型的最优潜变量数均通过Leave-One-Out交互检验法确定。

5.结果与讨论

使用拉曼光谱仪器对复杂悬浊体系(如:药物结晶过程)进行检测分析时,体系中的固体颗粒不仅会对入射光产生散射作用,而且其自身还可能会产生拉曼响应信号,从而严重影响样本的拉曼光谱。实验中我们首先考察了固体谷氨酸钠对样本的拉曼光谱信号的影响,如图1所示。

图1表明,当固体谷氨酸钠颗粒的量从1g增加到1.2g又增加到1.4g时,其固体量呈正比例线性变化,但其光谱强度却毫无线性关系、不成比例,在1g-1.2g两条光谱曲线之间很接近,而1.2g-1.4g两条曲线的光谱强度却存在着巨大的差异。这充分说明悬浊体系中固体颗粒量的变化会对样本拉曼光谱信号产生显著影响无法准确定量分析。

因此,悬浊样本中固体谷氨酸钠的存在会不同程度地干扰到液相中目标物质定量分析的准确性,对样本拉曼光谱强度以及定量分析结果有显著影响。那么,就需要一种有效的方法、一种校正模型,也就是本文讨论的乘子效应模型来消除样本悬浊液中固体物质带来的干扰与误差。以下将讨论如何通过实验发展这种优良的乘子效应模型。

本实验包含了两个部分,第一部分是样本在溶液状态下改变溶液浓度测出其拉曼光谱数据;第二部分当溶液饱和之后固体颗粒不再溶解,则会出现溶液相与固相共存的状态,测出不同谷氨酸钠固体含量的拉曼光谱数据。如此即可比较出固体颗粒量的变化对谷氨酸钠溶液的拉曼光谱定量分析数据是否存在影响以及影响的程度。

根据测出的拉曼光谱数据,分别用OPLEC和PLS、PLS-EISC、PLS-MSC、PLS-SNV方法对其进行分析校正,将这五种分析结果进行比较。实验结果显示,后四者传统方法的结果明显不能令人满意。由下图可以看出,OPLEC的分析结果明显优于PLS、PLS-EISC、PLS-MSC、PLS-SNV。

由图2可观察到,a、b、c、d图中校正集与预测集各点分别很大程度地偏离了直线y=x,预测值与真实值的拟合度、相关性甚小。样本拉曼光谱强度受到样本固体颗粒量变化的乘子效应影响,使分析结果产生偏差。这证明了传统的多元统计方法会被样本的固体颗粒量变化的因素干扰,且干扰程度都不容忽视。传统方法无法消除样本固体颗粒量的变化对光谱定量分析结果的影响,这严重影响了定量分析的准确度。

而e图中校正集与预测集各点近乎拟合在直线y=x上,即预测值与真实值非常接近,它们有很好的相关性。根据校正结果,e图证明了乘子效应模型(MEM)在不需要预处理这些复杂的前置步骤的前提下,依然具有非常好的的准确性、简洁性、稳定性以及无损性,尤其适合实际复杂体系(如:悬浊体系)的原位实时光谱定量分析。悬浊体系样本固体颗粒量的变化所引起的乘子效应对光谱校正模型定量分析结果有着严重的影响,而MEM可以有效地对这种影响进行消除,将样本中待测组分含量变化的拉曼光谱强度贡献与样本固体颗粒量的变化的拉曼光谱强度贡献分离开来,从而成功实现了对悬浊体系样本中目标组分的拉曼光谱准确定量分析。

再者可以进一步比较以上五种校正模型的分析误差,看出传统分析方法模型存在很大误差,不能够对样本光谱数据进行准确的定量分析,从而确定乘子校正模型的优越性。

由表3看出乘子校正模型的分析误差包括平均相对误差、预测误差等明显低于其他方法,即该方法对悬浊样本的固体颗粒量的变化的干扰有着非常好的消除作用,并且可校正样本光谱信号的乘子效应的估计问题,使得在不对样品进行任何处理的情况下,直接使用光谱仪器对悬浮体系的定量分析效果十分准确。

6.结论

悬浊体系的拉曼光谱强度不仅与待分析物含量有关,而且还受悬浊体系中固体颗粒的影响。体系中的固体颗粒会对样本的拉曼光谱产生乘子效应[5],为光谱定量分析增加了难度。传统的多元线性回归方法(如PLS等)虽具有建模速度快[6]、泛化能力好[7]的优点,但是不具备非线性矫正的能力[8],如若不适当地处理光谱数据,无法准确地从悬浊体系样本中准确获取目标组分的含量信息,甚至即使对其进行预处理后,依然无法得到准确的、有效的光谱定量分析数据。

本文研究了一种悬浊体系的拉曼光谱准确定量分析的方法-乘子效应模型(MEM),该校正模型中通过引入乘子效应参数把悬浊样本固体颗粒对其拉曼光谱贡献与样本的总的拉曼光谱信号中分离出来,成功实现了对悬浊体系样本中目标组分的准确定量分析。通过对谷氨酸钠悬浊液进行拉曼光谱定量分析,所获得的实验结果表明:建立在光程估计与矫正方法(OPLEC)基础上的校正模型——乘子效应模型(MEM)可有效地消除悬浊体系中固体颗粒对样本拉曼光谱信号的影响,明确地阐明了样本固体颗粒变化所带来的光谱信号的贡献与样本总拉曼光谱信号之间的定量关系,获得了较理想的预测结果。其预测能力明显优于传统的其他方法,可应用于实际复杂悬浊体系样本的原位实时拉曼光谱定量分析,其展示出了广阔的应用前景。

摘要：拉曼光谱技术具有高效、快速、试样制备简单、与光纤技术相结合可实现原位实时在线分析等特点,然而当被分析对象为悬浊体系时,体系中存在的固体颗粒不仅会对光子产生散射作用,而且其自身也会产生拉曼响应信号,严重影响样本的拉曼光谱的强度和形状,从而破坏传统校正模型对分析物质的预测性能。因此为了实现对悬浊体系的拉曼光谱准确定量分析,需要发展一种能有效消除样本中固体物质对样本拉曼光谱定量分析结果的影响的新型拉曼光谱校正方法。本文研究讨论了一种新型的悬浊样本拉曼光谱准确定量分析校正模型,并将该校正模型用于对谷氨酸钠悬浊体系的液相组分谷氨酸钠浓度的拉曼光谱定量分析,且获得了令人满意的结果。

关键词：定量分析,化学计量学,拉曼光谱,乘子效应,悬浊体系

参考文献

[1] Chiang L H,Russell E L,Braatz R D.Fault diagnosis in chemical processes using Fisher discriminant analysis,discriminant partial least squares,and principal component analysis[J].Chemometrics and Intelligent Laboratory Sys-tems,2000,50(2):243-252.

[2] Li Q,Cheung W H,Chow K L,et al.Factorial analysis of adaptable properties of self-assembling peptide matrix on cellular proliferation and neuronal differentiation of pluripotent embryonic carcinoma[J].Nanomedicine:Nanotechn-ology,Biology and Medicine,2012,8(5):748-756.

[3] Chen Z P,Morris J,Martin E.Extracting chemical information from spectral data with multiplicative light scattering effects by optical path-length estimation and correction[J].Analytical chemistry,2006,78(22):7674-7681.

[4] Yang J,Chen Z P Zhang J,et al.Quantitative Raman Spectrometry:The Accurate Determination of Analytes in Solution Phase of Turbid Media[J].Chemometrics and Intell-igent Laboratory Systems,2013.

[5] 史永刚,粟斌,李华峰,等.拉曼光谱及其在石油产品分析中的应用[J].现代仪器,2010(6):9-13.

[6] 骆中华,刘瑞兰,苏宏业,等.基于PLS快速剪枝法的RBF神经网络软测量模型建模方法和应用[J].化工自动化及仪表,2005,32 (3):19-21.

[7] 殷正远,王豪.基于PLS的工业现场数据建模方法[J].控制工程,2010,2.

[8] Martens H.Reliable and relevant modelling of real world data:a personal account of the development of PLS regression[J].Chemometrics and intelligent laboratory syst-ems,2001,58(2):85-95.