人肺癌细胞

人肺癌细胞（精选十篇）

人肺癌细胞 篇1

1 材料与方法

1.1 试剂

人肺癌A549细胞株 (美国ATCC) ;多西他赛 (江苏恒瑞医药股份有限公司) ;二甲亚砜 (DMSO) (美国Sigma-Aldrich公司) ;小牛血清FCS、胰蛋白酶、RPMI 1640培养基 (美国Gibco公司) ;青霉素、链霉素、RNase、四甲基偶氮唑盐 (MTT) 、PI (美国Amresco公司) ;TUNEL染色凋亡检测试剂盒 (美国Roche公司) 。其他试剂均为分析纯 (南京化学试剂厂) 。

1.2 细胞传代培养

在37ºC、5%CO2的细胞培养箱内, 采用含10%FCS的RPMI 1640培养基培养A549细胞;倒置显微镜观察细胞形态, 待其生长至80%左右, 移除培养基, 用37ºC的0.25%胰蛋白酶处理细胞1 min, 滴入RPMI1640培养基终止消化, 离心处理后收集沉淀并采用RPMI 1640重悬, 将A549细胞接种到培养瓶中进行常规培养, 细胞密度为5×105/m L。

1.3 细胞增殖的检测

收集对数期生长的A549细胞并通过胰蛋白酶消化、吹打制备单细胞悬液, 接种到96孔培养板, 培养24 h后置于倒置显微镜下观察, 待细胞贴壁后, 进行药物处理 (除对照组外其余均给予多西他赛处理, 浓度分别为0.1、1、10、20、50、100μmol/L) , 培养48 h后, 向每孔加入10μL MTT溶液 (5 mg/mL) , 4 h后终止培养并测量和记录492 nm波长下各孔吸光值A492。根据公式计算不同浓度药物处理A549细胞的增殖抑制率:增殖抑制率 (%) =[ (对照组-空白组) - (药物组-空白组) ]/ (对照组-空白组) ×100%。

1.4 细胞凋亡指数

将小玻片置于培养板底部 (12孔) , 将A549细胞悬液接种于培养板, 待贴壁后加入药物处理24 h (药物的浓度与步骤1.3同) , 制备细胞爬片, 并用4%多聚甲醛固定, PBS冲洗三次后, 进行TUNEL染色 (严格按照试剂盒说明书步骤) 。显微镜下观察细胞形态, 每种处理下随机选取5个高倍镜视野, 分别计数凋亡细胞数和总细胞数并求两者比值, 即为凋亡指数。

1.5 细胞周期检测

将5 mL A549细胞 (1×105/mL) 接种于50 mL培养瓶, 24 h后进行药物处理, 培养24 h后离心弃上清 (1000 rpm×5 min) , 70%冷乙醇重悬细胞沉淀, 4ºC下固定细胞24 h, PBS冲洗后, 加入50μg/mL的RNase处理1 h, 离心后向沉淀中加入的PI溶液 (100μg/mL) , 避光染色30 min, 过滤后用流式细胞仪检测。

1.6 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包进行本研究统计分析, 数据均以“平均数±标准差”的形式表示, 采用成组t检验进行不同浓度多西他赛与对照组的比较, 采用单因素方差分析进行多西他赛不同浓度之间的比较, 两两比较采用SNK法, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多西他赛对人肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

不同浓度的多西他赛处理A549细胞后的增殖抑制率和凋亡指数均高于对照组, 其中除20、50和100μmol/L的增殖抑制率为P<0.01, 50和100μmol/L的凋亡指数为P<0.01, 其余均为P<0.05。多西他赛对A549细胞的增殖抑制率和凋亡指数呈浓度依赖的方式增加, 见表1。

注:与对照组比较:*P<0.05, **P<0.01

2.2 多西他赛对A549细胞周期的影响

除0.1μmol/L的多西他赛外, 其余剂量的处理可导致G2/M期细胞占总细胞的比例增加, G0/G1期细胞占总细胞的比例降低, 呈浓度依赖的方式变化, 其中除1和10μmol/L为P<0.05外, 其余均为P<0.01;多西他赛对S期无影响, 见表2。

3 讨论

癌细胞对化疗药物的敏感性决定治疗效果。癌细胞的增殖和凋亡水平是评价化疗药物疗效的重要指标[3]。本研究发现:多西他赛处理后的增殖抑制率和凋亡指数均高于对照组, 表明多西他赛可促进肿瘤细胞的凋亡, 同时可降低细胞的增殖水平, 主要的原因是多西他赛可干扰细胞分裂必须的微管网络系统, 导致细胞分裂受阻, 而流式细胞仪的结果表明多西他赛处理的A549细胞G2/M期细胞所占的比例增大, 而G0/G1期降低, 影响正常的细胞周期。多西他赛对A549细胞的增殖抑制率、凋亡指数、G2/M期呈剂量依赖的方式增加, G0/G1期呈剂量依赖的方式降低, 以上提示肺癌A549细胞对多西他赛的敏感性较好, 可作为一种理想的治疗手段。此外, 研究发现多西他赛可影响癌细胞的EGFR和ERK的磷酸化水平[7], 这也可能使其影响细胞周期的另一个原因。

注:与对照组比较:*P<0.05, **P<0.01

综上所述, 多西他赛可促进A549增殖和凋亡, 同时可将A549细胞阻断在G2/M期。

参考文献

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人肺癌细胞 篇2

【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞亚群（dc1/dc2）和机体nk细胞含量之间的关系及其临床意义。方法 采用流式细胞术检测40例肺癌患者外周血dc亚群（cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc／dc2）、nk细胞含量及血浆il12的浓度， 并以10例健康受试者作为对照。结果 肺癌患者外周血cd11c+dc百分率为（0.66±0.24）％，比对照组（1.38±0.18）％明显降低（p<0.01），cd123+ dc百分率（0.28±0.17）％与对照组（0.27±0.11）％相比， 差异无统计学意义（p＞0.05）；肺癌患者与健康人比较，nk细胞含量及il12的浓度均降低（p<0.05）。nsclc 患者nk细胞的含量与cd11c+百分数及血浆il12 浓度均呈正相关（p<0.05），与cd123+百分数呈负相关（p<0.01）。dc各亚型百分率同患者的卡氏评分、化疗史有关联（p<0.01），nk细胞的含量与年龄相关（p<0.05）。结论 非小细胞肺癌患者dc1功能低下，il12分泌能力障碍，从而影响了nk细胞的活性。dc亚型与nk细胞含量之间以及它们与临床生物学行为之间都有一定关系。

【关键词】 肺癌 树突状细胞亚群 自然杀伤细胞

树突状细胞（dendritic cell，dc）是一种专职的抗原提呈细胞， 依据 dc起源和功能，将人外周血 dc 分为两个亚群[14]。www.133229.CoM自然杀伤（nature killer，nk）细胞在机体免疫中地位重要，外周血nk细胞的变化是反映机体细胞免疫状态的重要指标[5]。晚期非小细胞肺癌患者dc亚群的表达水平如何，它同患者机体nk细胞的关系如何，以及此二者同步检测的临床意义究竟如何，目前尚无定论。本研究对40例晚期非小细胞肺癌患者的dc亚群和机体免疫状态进行了同步检测和分析，现总结报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择

收集符合纳入标准的非小细胞肺癌患者40例，对照组10例，均为健康受试者。

1.1.1 纳入标准 （1）有明确病理诊断的iii～iv期非小细胞肺癌患者；（2）心、肝、肾和造血系统功能基本正常；（3）预计生存期在6个月以上；（4）karnofsky评分≥60分。

1.1.2 排除标准 （1）无明确病理诊断者；（2）预期生存期<6个月者；（3）合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病；（4）儿童、孕妇和精神病患者。

1.2 一般资料

按照上述条件共纳入40名患者，均为我科8月～月期间的住院病人。其中男27例，女13例；年龄38～82岁，中位年龄63岁； iii期15例，iv期25例；病理类型：腺癌23例，鳞癌17例。

1.3 试剂与仪器

免疫荧光三标记 dc 检测试剂盒（3color dendritic value bundle）购自美国 becton dickson 公司，内有fitc标记的 lineage cocktail 1 （lin1），由cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56系列抗原混合单抗组成， cd11cpe、cd123（抗il3r）pe，抗hladrpercp及 阴 性 同 型 对照小鼠igg1pe/igg2pe；fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体，facs calibur流式细胞仪（美国 becton dickson公司生产），离心机等。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 外周血 dc1/dc2 亚型的检测 参考文献[6]，取肝素抗凝外周血500μl，分装4管， 每管100μl全血， 加入lin1、抗hladrpercp、cd123（抗il3r）pe、cd11cpe及阴性对照igg1pe/igg2pe单抗，振荡混匀，室温暗处反应15min，加入2ml溶血素，混匀、裂解10min，离心弃上清，洗涤1次，加入300μl的1％多聚甲醛溶液，用facs calibur流式细胞仪每管收集50000个细胞，fsc设阈值，排除碎片干扰，用cell quest 软件获取及分析hladr／lin1点图中的hladr阳性、lin 1弱阳性和阴性的细胞群体，以cd11c和cd123荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。

1.4.2 nk细胞的检测 参考文献[7]，用fitc或pe标记鼠抗人cd3-并cd16/cd56+单克隆抗体，由流式细胞仪测定外周血中nk细胞含量。

1.4.3 血浆il12浓度检测 按照il12试剂盒的操作说明进行： 于96孔酶标板中每孔加入assay diluent rdif 50μl，各孔中分别加入已配制的il12标准液或已经室温融化并离心的血浆样本200μl，室温静置2h，弃上清液并用washer buffer洗涤3次，各孔中加入200μl il12结合物，室温静置2h，弃上清液并用washer buffer洗涤3次，加入200μ1底物溶液，室温避光静置20min，加入50μl终止液，静置25min后上酶标仪(450nm)读取od值，绘制标准曲线并求出各标本的血浆il12浓度。

1.5 统计学方法

应用spss13.0统计分析软件对实验数据进行统计，采用两样本均数差别的秩和检验、双变量相关分析及偏相关分析。

2 结果

2.1 外周血中树突状细胞亚型的检测

肺癌患者外周血髓系树突状细胞（mdc，cd11c+）的表达与正常对照组比较显著降低（p<0.01），淋巴系树突状细胞(ldc，cd123+)的表达与正常对照组比较差异无统计学意义（p>0.05），见图1、表1。表1 肺癌患者与健康对照组外周血树突状细胞亚型的检测结果

2.2 外周血中nk细胞活性及血浆il12浓度的检测

检测结果显示，nsclc 患者血浆il12 浓度为（3.19±0.30）pg/ml， 显著低于正常人（8.21±1.80）pg/ml (p=0.000)。nsclc患者与健康人比较，nk细胞的杀伤能力减弱，其含量为（15.51±2.15）％，低于健康对照组的（22.53±15.25）％（p=0.018），见图2、表2。

2.3 nsclc患者树突状细胞亚型、il12及nk细胞的`含量之间相关性分析

对nsclc患者外周血中cd11c+、cd123+百

在fsc vs ssc散点图中划出单个核细胞区r1，然后将lin1表达阴性细胞设为r2（排除t、b、nk等细胞），再将hla-dr+cd11c+或hla-dr+cd123+设为r3（mdc或pdc）

图1 dc亚型流式细胞图

在fsc vs ssc散点图中划出淋巴细胞区r1，其中cd3-/cd16＋cd56+者即为nk细胞

图2 nk细胞流式细胞图

分数与il12、nk细胞的含量进行相关性分析，见表3。结果显示，nsclc 患者血浆il12 浓度同cd11c+百分数呈正相关（p<0.05）；nk细胞的含量与cd11c+百分数呈正相关（p<0.05），而与cd123+百分数呈负相关（p<0.01）。而nsclc 患者血浆il12 浓度同nk细胞的含量之间亦有关联性，即两者呈正相关（p<0.01）。表2 肺癌患者与健康对照组外周血中 nk细胞含量及t细胞亚群的检测结果表3 40例肺癌患者树突状细胞亚型与外周血il12、nk细胞含量之间的相关性表4 40例肺癌患者树突状细胞亚型与临床病理特征的关系

2.4 肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征分析的关系

肺癌患者树突状细胞亚型、nk细胞含量与临床病理特征的关系，见表4。按照卡氏评分（<80vs≥80）、化疗史（有vs无）分组，cd11c+dc百分数有极其显著性差异（p<0.01），cd123+dc百分数有显著性差异（p<0.05）；按照病理类型（腺癌vs鳞癌）分组cd11c+dc百分数差异有统计学意义（p<0.05）；其余分组（性别、年龄、临床分期）之间的各dc亚型百分数比较差异均无统计学意义。而nk细胞的含量仅与年龄相关（p<0.05），同其他临床特征无明显关联（p>0.05）。

3 讨论

3.1 肺癌患者dc亚型的特征

树突状细胞（dc）是一种专职的抗原提呈细胞， 依据 dc起源和功能，将人外周血 dc 分为两个亚群：dc1亚群为髓样细胞来源（myeloid dc），它以 cd11c+dc 前体形式存在于外周血中，在炎症刺激时分化为成熟的 cd11c+ dc， 产生白细胞介素il12， 促进 th1 应答； dc2亚群为淋巴样细胞来源（lymphoid dc）， 由其 cd123+dc 前体细胞加 il3 诱导后分化为成熟的淋巴样 dc，不产生 il12，诱导 th2 应答。新鲜分离的外周血 dc 缺乏树枝状的形态学特征，其表面均弱表达或不表达单核细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞及天然杀伤细胞的标记抗原， 但高表达hladr 抗原。因此，将 淋 巴 细 胞 系 列 抗 原 （lin1：cd3、cd14、cd16、cd19、cd20、cd56的混合体） 表达阴性或弱阳性，hladr表达阳性来初步界定dc群， 再根据 cd11c 和 cd123的表达来确定分别为 cd11c+dc/dc1和 cd123+ dc/dc2。

本次的实验结果表明：肺癌患者外周血cd11c+dc/dc1在白细胞中所占比例低于正常人（p=0.000），而cd123+ dc/dc2在白细胞中所占比例与正常人无显著差异（p=0.829），且cd11c+dc/dc1在数量上比cd123+ dc/dc2占优势，说明肺癌患者dc递呈抗原水平低于正常人，提示肺癌患者机体免疫功能受损，难以促使未成熟dc向mdc分化，不能有效地通过细胞免疫途径杀伤体内的肺癌细胞；而ldc无明显增多，即th2型反应无明显增强，说明体内针对肺癌细胞的体液免疫应答无明显增强。

3.2 肺癌患者dc亚型与nk细胞的关系

树突状细胞（dc）和自然杀伤（nk）细胞是自身免疫系统的两种独特成分，在免疫调节和适应性免疫反应的建立过程中起关键性作用。nk细胞主要通过细胞毒性效应以及产生细胞因子起作用，而dc则识别病原体并向适应性免疫系统发出警报。nk细胞是自体免疫系统中主要的淋巴细胞，通过其细胞因子产物溶解细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用，具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。

研究表明，dcnk细胞相互作用可导致细胞激活、成熟甚至死亡。fernandez等[8]的早期研究通过证明dc激活nk细胞抗肿瘤活性，首先证实了体内dcnk细胞的相互作用。体外研究表明，nk细胞和成熟dc的接触导致两种细胞的激活和细胞因子的产生，包括nk细胞增殖和dc成熟[911]。dc可以通过各种机制提高nk细胞的生存率，增加nk细胞活性和分化。其中重要的机制之一就是dc分泌的细胞因子，如il12。il12曾一度被称为自然杀伤细胞刺激因子或细胞毒性淋巴细胞分化因子，人体内的dc1可通过分泌il12，促进thl反应，诱导细胞免疫，而il12又可促进dc1的分化、成熟。事实上，人体内的dc能更好地支持nk细胞的存活[12]。成熟的dc还是il12的主要来源，il12可以增加nk细胞介导的细胞毒性和ifn拨貌生[13]。

本研究结果显示nsclc患者外周血mdc含量及血浆il12降低，说明nsclc状态下外周血mdc存在il12分泌能力的障碍，从而影响了nk细胞的活性。提示nsclc患者体内不仅存在mdc数量的减少，而且存在nk细胞功能上的缺陷。nsclc患者体内dc产生和功能上的缺陷是肿瘤细胞逃脱机体监视的重要机制之一。另外，检测结果显示，随着cd123+ dc/dc2的百分含量下降，肺癌患者nk细胞含量增高（p=0.018），两者呈显著负相关。本试验证实，dcnk之间的相互作用和通讯，构成了一个正反馈环路，一旦2种细胞中的任何一种细胞感受到了“危险”或组织损伤发生，这一环路将被激活。dcnk细胞之间的相互作用是接触依赖型的，但也同时包括细胞因子之间的交互作用。

3.3 dc亚型与nk细胞之间关系分析的临床意义

由此可见，dc亚型分布情况、nk细胞含量在判断非小细胞肺癌患者病情发展上有一定的临床意义，它们同卡氏评分、是否化疗等临床特征之间均有十分密切的关系。所以，当肺癌发生时，宿主的dc亚群及nk细胞的功能低下、比例失调，导致机体免疫平衡失调。

随着肿瘤患者病情的发展，肿瘤某些生物学特征（机体免疫状态和其他一些生物学指标等）同时发生一些变化，进而提示这些指标之间有一定的相关性。本组研究表明，晚期非小细胞肺癌患者在接受化疗过程中，随着卡氏评分的逐渐降低，机体免疫功能逐渐下降，与此同时，dc各亚型的百分比也明显下降；提示肺癌患者外周血dc亚型与机体免疫状态之间有一种间接的相关性。

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人肺癌细胞 篇3

【关键词】蜈蚣提取物；顺铂；肺癌；移植瘤

顺铂和蜈蚣[1]是肺癌常用的中药和西药。二者结合使用是否可以达到较好抗肿瘤作用了。我课题组对此进行了研究。

1材料和方法

1.1材料及仪器少棘蜈蚣、顺铂购于本院，人肺癌A549细胞株购于湘雅医学院。高糖DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、MTT、分析纯。纯系雄性裸小鼠本校SPF级动物实验室饲养。

1.2蜈蚣提取物制备[2]蜈蚣生药制成超微粉，采用液氮快速冻融联合丙酮沉淀法制备提取物备用。

1.3细胞培养A549细胞培养于高糖DMEM培养液中，置于培养箱中培养，2-3d更换1次，常规传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.4移植瘤的制备与观察制备移植瘤模型：浓度107/ml的A549肺癌细胞用1ml注射器于裸小鼠背部皮肤皮下注射0.2ml。术后分为4组。分别为DDP组（3mg/kg）、DDP+30mg/kgECP组、DDP+60mg/kgECP组和对照组（生理盐水）。第15d开始进行药物干预，腹腔注射0.4ml/次/天，连续21d，第36d处死动物。在用药后第0d、7d、14d、21d测量肿瘤的最长径（A）和最宽径（B），根据公式[5]V=A×B2/2计算肿瘤体积。

1.5肺癌A549细胞体外的实验与观察

1.5.1MTT法测定ECP及DDP的毒性作用细胞接种于96孔板内，培养24h。根据预实验结果设置药物干预浓度，设置5个层次的DDP及ECP浓度，对照组加入培养液及同剂量的生理盐水。继续培养48h后，弃药液，加入MTT液和培养液，培养箱内孵育4h，用PBS液清洗两次，弃MTT液，加入二甲基亚砜，旋涡振荡器振荡10min充分溶解结晶。LOGIT法计算作用A549细胞48h后蜈蚣提取物对肺癌A549细胞的IC50值及IC10值。

1.5.2ECP联合DDP对体外A549细胞的作用按上述方法常规培养24h，分为两组，一组为不同浓度的ECP加入IC10浓度的DDP，一组为不同浓度的DDP加入IC10浓度的ECP。MTT法检测ECP及DDP的IC50值，合并指数（CI）根据公式计算[4]：CI=联合用药时A药IC50/A药单用时IC50+联合用药时B药IC50/B药单用时IC50。CI>1.05时具有拮抗作用；CI<0.95时表示两种药物具有协同作用；0.96

1.6统计学处理计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS16.0统计软件，组间比较采用t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1裸鼠移植瘤体积的比较DDP+30mg/kgECP组裸鼠移植瘤给药后第0d、7d、14d、21d体积分别为98.7±9.1、123.7±8.9、154.5±9.1、193.8±13.5；DDP+60mg/kgECP组分别为103.5±12.4、114.7±9.6、138.8±12.1、169.3±11.4；DDP组分别为100.2±10.6、156.0±11.2、191.5±13.3、249.0±20.8；对照组分别为101.7±8.6、220.0±24.6、286.5±31.1、352.5±56.4。DDP组与DDP+ECP组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2ECP及DDP对人肺癌A549细胞的作用MTT结果显示，ECP及DDP均以剂量依赖的方式抑制人肺癌A549细胞，ECP的IC50值为1989.61μg/mL，IC10值为195.89μg/mL；DDP的IC50值为24.05μg/mL，IC10值为2.20μg/mL。DDP联用IC10浓度的ECP的IC50值为9.26μg/mL；ECP联用IC10濃度的DDP的IC50值为1100.43μg/mL，分别增效1.80倍和2.60倍，CI为0.93，CI<0.95，两种药物联用有协同作用。

3讨论

众多实验研究表明，蜈蚣提取物有多种作用[3]，课题采用人肺癌A549的细胞株作为本次实验的受试细胞。本研究体外实验表明，DDP与ECP联用具有协同作用。动物体内试验研究也显示DDP联合ECP可以抑制移植瘤生长速度。蜈蚣中存在抗癌活性的组分[4]；蜈蚣多种提取物有抗肿瘤的作用：蜈蚣多糖可Hela细胞阻滞于G2/M期，并诱导凋亡[5]。但研究只局限于整体水平，其具体有效成份仍不清楚，这也是今后需要继续努力研究的方向之一。

总之，本研究表明在体外及活体环境下蜈蚣提取物与顺铂联合运用对人肺癌A549有较明显的抑制作用，其联合用药的效果优于单用蜈蚣提取物或单用顺铂。

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人肺癌细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株:肺癌细胞系A549细胞,购于中国科学院上海细胞库。主要试剂:PAB购于哈尔滨弘博生物科技有限公司, 细胞周期检测试剂盒和Annexin V/PI凋亡试剂 盒购于BENDER公司 ; 胎牛血清 、RPMI1640培养液购于碧云天生物技术研究所 ; 四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒、辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠Ig G均购自武汉博士德生物科技有限公司;Caspase-3活性检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司;PTEN、Akt、p-Akt(Ser473)及内参β-actin抗体均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养A549细胞培养于含10% 胎牛血清RPMI 1640培养基 ,置于细胞培养箱中培养 ,对于贴壁细胞培养方法,大约每2天换培养基1次,大约3 d传代1次,每次均取生长状态良好的并处于对数期的细胞进行实验。

1.2.2细胞增殖实验检测细胞活力将对数生长期的细胞配制成1×104个/m L的细胞混悬液, 将混悬液按每孔100μL加入96孔培养板,在孵箱中孵育培养约24 h后取出 , 弃上清 , 每孔加200μL RPMI-1640培养液再培养24 h后取出,弃上清。实验组换PAB终浓度为2、4、8、16、32μmol/L培养液 , 对照组未 加PAB(0μmol/L),每组5个复孔。然后放置培养箱中继续孵育24、48、72 h, 于实验结束前4 h弃孔内液体,每孔加入100μL MTT(浓度为0.5 mg/m L),培养4 h,弃孔内液体,加入100μL DMSO。振荡15 min后酶标仪测吸光度(A490),根据公式计算细胞抑制率:细胞抑制率(%)=1-(实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡将对数生长期的细胞配制成1×106个/m L的细胞混悬液, 将悬液接种于6孔板中,在孵箱中孵育培养约24 h后取出,弃上清。实验组换PAB终浓度为2、4、8、16、32μmol/L培养液,对照组未加PAB(0μmol/L),放置培养箱中继续孵育48 h后收集细胞,预冷PBS洗涤细胞2次,并将细胞重悬于Binding Buffer中。加入5μL Annexin VFITC室温、避光反应10 min, 加入5μL PI混匀 ,室温、避光反应5 min。筛网过滤后,上流式细胞仪机检测细胞凋亡率。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期细胞接种及分组同上,收集细胞,洗涤、离心后加入75%预冷乙醇固定过夜,弃掉乙醇,加入RNase和PI室温避光染色,筛网过滤后,送上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5分光光度法检测Caspase-3活性变化细胞接种及分组同上, 收集细胞, 加入100μL裂解液+1.742μL PMSF蛋白酶抑制剂重悬细胞 ,用移液器吹打细胞置混匀,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上裂解约45 min。后12 000 r/min,4℃离心30 min,后吸取上清,并放置于冰上,用BCA法测定蛋白浓度,根据Caspase-3活性检测试剂盒操作方法操作,其原理是基于Caspase-3可催化底物Ac-DEVD-p NA并产生黄色的对硝基苯胺(p-nitroaniline,p NA),后者可产生吸光度,间接反映细胞内Caspase-3活性。根据结果调好蛋白浓度(2~4 g/L),再加入缓冲液20μL多次吹打均匀后加入Caspase-3反应底物Ac-LEHDp NA 5μL,再放置培养箱中避光孵育4 h, 之后酶标仪测定405 nm处吸光值(OD405)。

1.2.6 Western blot检测PTEN、Akt和p -Akt(Ser473) 蛋白表达细胞接种及分组同上 , 收集细胞 , 加入100μL裂解液+1.742μL苯甲基磺 酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂重悬细胞 ,用移液器吹打细胞置混匀,使裂解液和细胞充分接触。置于冰上裂解约45 min。12 000 r/min,4℃离心30 min,后吸取上清,将样品分装至预冷的EP管中,-80℃保存。BCA法测定蛋白质浓度, 加入1/5体积的5×上样缓冲液至提取的细胞蛋白样品中,沸水煮沸5 min,-20℃保存。将细胞蛋白样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(上样量20μg/孔 ), 电泳结束后转膜至PVDF膜 , 再加入5%脱脂奶粉,室温封闭1 h,根据条带蛋白分布不同加入1∶1000稀释的兔抗或鼠抗人PTEN、Akt、p-Akt(Ser473)抗体,4℃冰箱内过夜,其中β-actin为内参,次日洗膜缓冲液(TBST)洗膜后,根据一抗来源不同分别加入1∶1000稀释的辣根酶标记的山羊抗或山羊抗鼠二抗 ,室温放置2 h, 再次TBST洗膜后加入ECL发光液显色,暗室内显影并观察各条带深浅变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAB 对 A549 细胞活力的影响

如表1所示,PAB对A549细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性,药物浓度越高、作用时间越长,其发挥抗肿瘤作用效果亦越好。

2.2 土荆皮酸对 A549 细胞凋亡的影响

A549细胞经PAB处理48 h后,流式细胞仪凋亡检测结果显示,PAB各实验组的细胞凋亡率较对照组(0μmol/L)的凋亡率 (0.6%)明显升高 ,从14.8%上升至37.7%,较对照组的凋亡率(0.6%)明显升高(P <0.05)。表明PAB能诱导细胞凋亡。见图1。

注:与对照组相同时间比较aP < 0.05;与实验组相同浓度 PAB 24 h 比较 ,bP < 0.05;与实验组相同浓度 PAB 48 h 比较 ,c P < 0.05;PAB:土荆皮酸

2.3 PAB 对 A549 细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期数据显示,PAB能抑制A549细胞的G1期行进和G1/S转换,S期细胞比例降低,表示PAB能够阻滞细胞周期。见图2。

2.4 土荆皮酸对 A549 细胞 Caspase-3 活性的影响

Caspase-3活性检测结果显示,PAB(4、8、16μmol/L)处理后 ,A549细胞Caspase-3相对活性 较对照组(0μmol/L)明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图3。

2.5 土荆皮酸对 A549 细胞 PTEN、Akt、p-Akt 表达的影响

PAB(4、8、16μmol/L)作用A549细胞48 h后,Westernblot检测PTEN、Akt、p-Akt, 如图4所示 , 细胞PTEN表达增加,总的Akt表达量没有变化,而p-Akt表达减少,呈浓度依赖 性 ,灰度值分 析显示 ,PAB(4、8、16μmol/L)与对照组 (0μmol/L)比较 ,差异均有统计学意义(P < 0.05)。表明PAB能上调PTEN,抑制Akt磷酸化。

3 讨论

细胞凋亡机制在维持机体内环境稳定中扮演着重要角色,是重要的生理调控机制[5],细胞无限增殖及细胞凋亡相对或绝对数不足在肿瘤发生发展中具有重要意义[6],诱导细胞凋亡可能是抗肿瘤治疗最有效的途径之一,因此,针对诱导细胞凋亡机制的药物,特别是天然化合物的研究已经成为国内外抗肿瘤研究的热点。本实验结果发现,PAB对A549细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性,药物浓度越高、作用时间越长,其发挥抗肿瘤作用效果亦越好。本研究还检测了PAB处理A549细胞后细胞周期改变,结果显示,PAB能阻滞A549细胞的G1期行进和G1/S转换 ,导致S期细胞比例降低, 提示PAB可能通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖。此外, 本研究进一步探讨了PAB对是否通过诱导细胞凋亡发挥抑制细胞的增殖作用。结果显示,PAB处理A549细胞后,细胞凋亡率随着药物浓度的升高而明显升高。上述表明PAB能抑制肺癌细胞增殖,同时促进细胞凋亡。

关于细胞凋亡的途径及信号通路,目前研究发现的细胞凋亡途径主要包括内部线粒体途径、外部死亡受体途径及内质网应激途径。Caspase作为半胱氨酸蛋白酶类,其家族在内部线粒体凋亡途径中起着重要作用, 可特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键,是导致凋亡的直接效应物。其中Caspase-3是效应凋亡蛋白酶,其被切割活化后,细胞凋亡则进入不可逆转阶段[7]。Caspase-3在起始凋亡蛋白酶切割激活活化后,可通过裂解细胞凋亡抑制蛋白、细胞DNA修复相关分子、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白等机制,最终促进细胞凋亡。本研究发现,PAB处理后,A549细胞内Caspase-3活性显著升高,提示PAB可能通过线粒体途径诱导肺癌A549细胞凋亡。

本研究进一步探讨了PAB引起凋亡的机制。磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted inchromosome,PTEN) 是1997年发现并命名的一种具有双重特异性磷酸酶活性抑癌基因,因其在多种进展期肿瘤中均发生突变,又被称为多发性进展期肿瘤突变基因 (mutated in multiple advanced cancer -1,MMAC-1)。研究发现,PTEN基因在多种肿瘤细胞包括大肠癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、肺癌中突变,表达下调甚至缺失[8,9,10,11]。已经证实,PTEN发挥抑癌作用主要依靠其磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PI3P,进而阻断PI3K/AKT信号通路,即PTENPI3K/AKT信号通路 [12,13]。PTEN基因的失 活导致PI3K/AKT信号通路异常活化 ,异常活化的AKT继而产生促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,增强肿瘤细胞黏附、侵袭及转移能力,促进血管生成等多种生物学效应[14],在肿瘤发生发展过程中具有极其重要意义。本研究发现,PAB处理A549细胞后,细胞PTEN表达上调,同时,细胞总的Akt表达量没有变化,而p-Akt表达减少, 两者表达呈负相关, 表明PAB能上调PTEN从而抑制Akt信号通路。

人肺癌细胞 篇5

大理州人民医院检验科

钟国梁

[摘要]目的 探讨纤维支气管镜刷片和支气管肺泡灌洗液细胞学检查在肺癌诊断中的意义。方法 收集100例疑似肺癌同时做纤维支气管镜刷片和灌洗液细胞学检查的患者标本进行镜检。结果 单独纤维支气管镜刷片镜检癌细胞检出率为36%，支气管肺泡灌洗液镜检癌细胞检出率为64%，两种方法联合镜检使40例纤维支气管镜刷片中没有检到癌细胞的患者检出癌细胞，阳性率提高了40%。仅有12例支气管肺泡灌洗液中未检出癌细胞而纤维支气管镜刷片中得以检出，弥补了12%支气管肺泡灌洗液中的漏检率。结论 两种方法联合检查可使癌细胞的检出率较支气管肺泡灌洗液提高12%，具有较高的临床诊断价值。[关键词] 纤维支气管镜刷片；灌洗液 ；肺癌

近50年来，全世界肺癌发病率明显增高，据统计，在我国大城市中，肺癌的发病率已居男性各种肿瘤的首位。及时、准确、早期诊断肺癌的方法对延长患者生命具有重要意义。本文就我院100例纤维支气管镜刷片和灌洗液细胞学检查的结果进行分析，报道如下： 标本采集 收集临床表现和影像学检查疑似肺癌同时做纤维支气管镜刷片和支气管肺泡灌洗液细胞学检查的100例患者标本做传统细胞学检查。其中男性64例，女性36例，中位年龄58岁（32－78岁）。2 方法 由临床医师采集纤维支气管镜刷片和支气管肺泡灌洗液标本送检。灌洗液经离心瑞氏染色、刷片用巴氏染色后进行传统镜检。3 结果

[1]纤维支气管镜刷片和支气管肺泡灌洗液细胞学检查结果（例，%）

检测方法

癌细胞检出率（n=100）

纤维支气管镜刷片

36（36）

支气管灌洗液

64（64）

纤维支气管镜刷片＋支气管灌洗液

76（76）讨论

目前临床上细胞学诊断肺癌常用的标本有痰和纤维支气管镜刷片两种。痰细胞学检查是肺癌诊断中最便捷、最经济的诊断方法特别适合不能耐受纤维支气管镜检查的患者但痰细胞学检查受肿瘤分期、分型及送检次数等诸多因素影响癌细胞检出率较低为33.8%，联合纤维支气管镜刷片检查可使肺癌的诊断率增加7.7%。纤维支气管镜检查的优点是：能在直视下取到病变组织进行刷片细胞学检验，检出率为58.7%

[3]

[2]

；纤维支气管镜检查还对支气管内膜结核诊断有特异性。近年来在纤维支气管镜应用的基础上发展起来的支气管肺泡灌洗技术（BAL）为呼吸系统病变的诊断和疗效观察开辟了一条新途径。特别是对于周边型肺癌由于纤维支气管镜下很难看到肿瘤征象使刷片的癌细胞检出率受到限制的情况，支气管肺胞灌洗技术无疑起到了很好的补充作用。用于呼吸系统疾病诊断的支气管肺泡灌洗液标本通过肺段、亚肺段灌洗术取得，可获得纤维支气管镜所不能探及的细胞学标本提高癌细胞的检出率。但由于受支气管肺泡灌洗液取材、离心、送检时间、制片等因素的影响使本文中12例患者漏检，通过联合纤维支气管镜刷片得以检出癌细胞，原因还可能该12例患者中部分肺癌类型属中央型利于镜下直接取材所致。综上所述，纤维支气管镜刷片联合支气管肺泡灌洗液细胞学检查能提高肺癌细胞的检出率，有利于提高临床对肺癌的诊断水平。

参考文献

[1] 吴吉明，胡剑鹏、吴建华等.不同胸腔灌洗液对肺癌脱落细胞的影

48例非小细胞肺癌手术临床分析 篇6

【关键词】 手术；非小细胞肺癌；TNM分级

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌是肺癌的常见类型^[1]，近年来，其发病率明显上升。手术治疗仍是首选的治疗方案，为探讨手术治疗非小细胞肺癌的临床疗效本文收集我院2006年5月——2007年3月手术治疗的48例非小细胞肺癌患者进行随访和疗效观察，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 集我院2006年5月——2007年3月手术治疗的48例非小细胞肺癌患者其中男37例，占77.1%，女11例，占22.9%，男女之比为3.6：1，年龄29-81岁，平均67.5岁。根据TNM分期进行划分：ⅠA期20例，占41.7%，ⅠB期18例，占37.5%，IIA期3例，占6.25%，IIB期3例，占6.25%，IIIA2例，占4.2%，IIIB期2例占4.2%。

1.2 方法 依据患者的病理分期采取不同的手术方式进行治疗，其中全肺切除术及淋巴结清扫术18例，占37.5%，肺葉切除术及淋巴结清扫术21例，占43.75%，扩大切除术及淋巴结清扫术5例，占10.4%，袖式切除术及淋巴结清扫术4例，占8.3%。

2 结 果

2.1 48例患者手术时间为（120.2±13.5）min，术中出血（195.3±44.1）ml，术后引流管留置时间为（2.6±1.2）d，术后镇痛时间为（3.1±1.2）d，住院时间为（12.1±2.1）d，发生并发症6例，并发症发生率为12.5%。

2.2 随访情况：经过5年的随访，其中1年生存36例，1年生存率为75.0%，3年生存26例，3年生存率为55.7%，5年生存11例，5年生存率为22.9%。

3 讨 论

非小细胞肺癌的Ⅰ期Ⅱ期及Ⅲa期的患者仍然以肿瘤切除术加区域淋巴结清扫术为主，手术方式有部分肺叶切除，双侧肺叶切除全肺切除术和袖珍肺叶切除等，不同的手术方案具有其各自的特点及适应症，手术方式的选择需要根据患者的病理分期来决定肺叶切除对于一般患者来说都能够耐受，是指将肿瘤组织的肺叶及其引流的支气管周围的淋巴结一同切除，双侧肺叶切除主要用于周围型肺癌癌肿跨叶裂侵犯者必需要将双肺叶切除才能将肿瘤组织完全切除，当肺叶切除无法将肿瘤组织切除干净时，可考虑行全肺切除术，但是该术式的手术并发症及死亡率较其他手术明显增加，袖珍式肺叶切除术是指将患侧肺叶与相连的一段主支气管或肺动脉切除，然后再将支气管或血管进行端端吻合，该术式既可以保证将肿瘤组织尽可能的完全切除，又能最大限度的保留肺组织，较全肺切除术的并发症下而在肺癌的治疗中得到广泛的应用，尤其适合于老年心肺功能较差，不能耐受全肺切除的患者^[2]，但是术中应该遵循以下原则，即：尽量将肿瘤组织以及肿瘤所侵犯的部位切除干净以保证切缘阴性，同时应该尽量保留肺部的正常组织，术中操作应轻柔，避免造成肿瘤组织的破坏和医源性肿瘤的播散，从而达到清除病灶，最大限度的减少对肺功能的影响，争取临床缓解，减少肿瘤转移，提高患者的生存率及生活质量术后根据患者的手术情况组织病理学分期，淋巴结受累情况来决定下一步是否在继续加用化疗或放疗。

本组资料结果显示：48例患者手术时间为（120.2±13.5）min，术中出血（195.3±44.1）ml，术后引流管留置时间为（2.6±1.2）d，术后镇痛时间为（3.1±1.2）d，住院时间为（12.1±2.1）d，发生并发症6例，并发症发生率为12.5%，经过5年的随访，其中1年生存36例，1年生存率为75.0%，3年生存26例，3年生存率为55.7%，5年生存11例，5年生存率为22.9%。

综上所述，外科手术是治疗非小细胞肺癌的首选方案，该技术以日渐成熟，随着医学模式的改变，对于非小细胞肺癌的治疗已逐渐再向以外科为主，多学科综合治疗的方向发展应该根据患者的各种因素综合分析来决定患者术后的进一步综合治疗，科学合理的手术。

参考文献

[1] Swanson SJ，Herndon JE 2nd，D'Amico TA，et al.Video-assisted thoracic surgery lobectomy：report of CALGB 39802-aprospective，multi-institution feasibility study.J Clin Oncol，2007，25（31）：4993-4997.

人肺癌细胞 篇7

1资料与方法

1.1一般资料

选取2006年7月-2010年3月就诊于我院的非小细胞肺癌患者66例,年龄56～88岁,平均(73.3±4.5)岁。选择标准:①经病理学和细胞学检查确诊为非小细胞肺癌患者;②经CT、MRI等影像学检查确定患者处于ⅢA、ⅢB、Ⅳ期;③各项检查指标表明患者能耐受化疗;④Kamofsky评分≥60,预计生存时间≥3月;⑤患者知情同意。病理分型:鳞癌18例,腺癌25例,腺鳞癌20例,大细胞癌3例。将患者随机均分为两组,综合治疗组和单纯化疗组,各33例。两组患者组织学分型、性别比例、年龄基本配对,无统计学差异,P>0.05。

1.2方法

综合治疗组:采用恩度联合NP方案,长春瑞滨25～30mg/m2,d1、d8,顺铂80～120mg/m2,d1～d3;恩度每次15mg,生理盐水滴注,1次/d,14d为1个疗程。对照组:仅使用NP方案化疗。

1.3评价标准

近期客观疗效评判按照RECIST标准进行评价,具体分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和疾病进展(PD),CR+PR视为有效率(RR),CR+PR+SD视为疾病控制率(DCR)。药物毒性反应,按照NCI-CTC的3.0的分级标准进行评价,分为0～4度。对生活质量(QOL)评价,采用Kamofsky评分(KPS),以治疗后KPS增加≥10分为QOL改善,变化<10分为QOL稳定,减少≥10分为QOL降低。

1.4统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计量资料采用undefined表示,统计学检验采用均数的t检验及率的χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1近期疗效

66例患者均完成化疗,综合治疗组33位患者共完成101个周期,平均3.1个周期,其中CR 3例、PR 13例、SD 12例、PD 5例,有效率为48.5%,疾病控制率为84.8%。单纯化疗组33位患者共进行123个周期,平均3.7个周期,其中CR 1例、PR 7例、SD 13例、PD 12例,有效率为24.2%,疾病控制率为63.6%。两组患者RR、DCR比较,差异有统计学意义,P<0.05。如表1所示。

2.2毒副反应

两组患者均出现不同程度的毒副反应,白细胞下降、脱发、肝功能异常、静脉炎等。两组出现的毒副反应比较,差异无统计学意义,P>0.05。两组患者QOL比较,综合治疗组QOL改善13例,QOL稳定14例,QOL降低6例;单纯化疗组QOL改善11例,QOL稳定14例,QOL降低8例,两组对比无统计学差异,P>0.05。如表2所示。

3讨论

很多非小细胞肺癌患者入院后已是晚期,极少患者有手术指征,目前治疗以化疗为主,但在临床治疗过程中我们发现单纯化疗效果不理想。已有很多研究表明肿瘤的生长速度与血管的生成速度密切相关,肿瘤内血管的生长是一种病理状态。1998年O’Reilly等研究者分离出一种内源性糖蛋白,分子量20kd,有184个氨基酸,具有显著的血管内皮细胞抑制作用,人血管内皮抑素与鼠血管内皮抑素有83.3%的同源性。内皮抑素是迄今为止发现的效果最好、作用最强的血管抑制剂。不同于传统化疗药,它靶向作用于血管内皮细胞,特异性强,组织毒性小。我国学者罗勇章等自主研发出新型人血管内皮抑素(Endostar,恩度),使得血管内皮抑素能够大量生产,解决了产量低成本高的技术局限,稳定性高、半衰期延长。恩度2006年已成为一线治疗药应用于肿瘤治疗,于2006年收入NCCN(中国版)。

本实验通过对比两组患者治疗效果,综合治疗组有效率为48.5%,疾病控制率为84.8%。单纯化疗组有效率为24.2%,疾病控制率63.6%。两组差异均有统计学意义,P<0.05。可以看出重组人血管内皮抑素与化疗药恩度能有效提高化疗效果,抑制肿瘤生长。使用恩度联合化疗药治疗具有以下优点:①内皮抑素安全稳定、毒副作用小,不易产生耐药性;②作用于正常组织细胞的毒性小,不引起骨髓抑制和严重的胃肠道反应。从本实验表2看出,联合用药组的毒副作用与对照组无显著差异,说明内皮抑素不会增加化疗的副作用;③有利于肿瘤细胞药物进入肿瘤组织和细胞内,加速细胞凋亡。

综上所述,采用重组人血管内皮抑素联合化疗能有效提高患者化疗效果,提高患者的生存质量,且内皮抑素特异性高,副作用小,安全有效,可以作为临床首选治疗方案,值得推广应用。

摘要：目的:探讨重组人血管内皮抑素联合化疗方案治疗晚期非小细胞肺癌的临床效果。方法:选取2006年7月-2010年3月就诊于我院的非小细胞肺癌患者66例,将患者平均随机分为两组,各33例,综合治疗组采用重组人血管内皮抑素和化疗药联合治疗;单纯化疗组使用化疗药物治疗。结果:综合治疗组治疗有效率为48.5%,疾病控制率为84.8%。单纯化疗组有效率为24.2%,疾病控制率63.6%。两组比较差异有统计学意义,P<0.05。毒副反应、KPS评分改善无显著差异,P>0.05。结论:应用重组人血管内皮抑素可以有效辅助化疗药作用于肿瘤,无明显加重化疗毒副作用,值得临床推广。

关键词：重组人血管内皮抑素,非小细胞肺癌,毒副作用

参考文献

[1]PARKIN DM.Global cancer statistics in the year 2000[J].Lancet Oncol,2001,2:533-543.

人肺癌细胞 篇8

1资料与方法

1.1 临床资料

2010年3月-2011年3月我科采用以重组人凋亡素+顺铂+长春瑞滨联合方案治疗晚期非小细胞肺癌共6例, 年龄19～58岁, 中位年龄29岁, 均为Ⅲ～Ⅳ期。均经病理学或细胞学证实, 有可测量的临床观察指标, 肝肾功能及血常规正常, KPS评分>70分, 生存期>3个月。按病理分类:鳞癌3例, 腺癌3例。

1.2 方法

具体化疗方案:重组人凋亡素75μg/kg第1～14天;顺铂30mg/m2第2～4天;长春瑞滨 25mg/m2第1～8天, 中间休息1周, 21d为1个疗程。

1.3 判定标准

按照WHO疗效评价的标准对肿瘤进行疗效评价, 分为完全缓解、部分缓解、稳定及进展。不良反应评价参照实体瘤的疗效及评价标准, 抗癌药物毒性反应分为0～Ⅳ。

2护理

2.1 药物配置注意事项及静脉滴注要求

配置过程中应无菌操作, 化疗前1d, 先用100μg/支的重组人凋亡素每瓶注入等渗盐水2ml, 将溶液轻轻摇匀, 取配制好的溶液0.1ml作皮内注射, 观察30min后, 判断结果。阴性标准:皮丘无改变, 周围不红肿, 无自觉症状。阳性标准:局部皮丘隆起并出现红晕硬块, 硬块直径>1cm, 或红晕周围有伪足、痒感, 严重时可出现过敏性休克。阴性者第2天开始用药, 配药用每支1mg的规格, 每支用2ml生理盐水充分溶解后, 将药品进一步稀释到250ml的生理盐水中用输液泵以125ml/h匀速静脉滴注2h, 每天1次, 连续使用14d。配制时生理盐水须缓慢注入管制瓶内, 并轻轻摇匀, 切忌上下颠倒剧烈摇动, 以防产生气泡, 影响药物的活性, 配制好的药液要在1h内输注, 最好现配现用。如配合其它化疗药化疗, 要先输注化疗药再重组人凋亡素。长春瑞滨加入生理盐水100ml在30min内滴完。顺铂加入生理盐水250ml用输液泵以125ml/h匀速滴注2h。顺铂要避光。配制化疗药时, 要戴手套。如果化疗药接触到皮肤, 立即用肥皂和水彻底清洗。如果本品接触到皮肤黏膜, 立即用水彻底清洗。

2.2 疲乏的护理

本组患者出现疲乏3例占50%, 这与使用凋亡素有关, 做好心理护理, 给予社会支持, 指导家属、朋友多关心、开导患者, 安排老患者与新患者交流, 由老患者现身说教, 交流战胜疾病的心得体会、治疗经验和感受。指导患者进行有氧锻炼, 包括步行 (80～100步/min) 、上下楼梯每天3次、20～30min/次, 活动量根据患者的情况而定, 指导患者可搭配要膳, 每天早晚进食补虚正气粥1次, 50～100g/次。或请中医科医师开中药调理。对极度疲劳的患者, 应卧床休息, 外出时最好有家人陪伴, 以防跌伤, 同时注意保暖, 防止外感风寒, 从而加重病情。本组均遵从护嘱, 积极配合治疗和护理, 未发生意外安全事件。

2.3 感染的护理

本组患者出现体温升高3例, 其中1例体温高达39.1℃, 给予必理通口服处理。另外1例发热, 按NCZ 分级为2级, 遵医嘱应用苯海拉明对症处理。由于该发热与使用凋亡素有关。因此操作过程中要严格执行无菌操作规程, 如配药或换锁穿等, 在凋亡素治疗结束后2h要密切监测体温的变化, 发热时, 要加强监测体温的变化。指导患者多进食高热量高蛋白高维生素清淡易消化饮食, 多饮水, 勤漱口保持口腔清洁, 严重时应用抗感染药。有2例发热患者被迫停止治疗, 等感染控制后继续治疗。

2.4 静脉皮肤反应的护理

合理选择静脉, 要选择粗直的血管, 要避开关节、肌腱、韧带等部位, 并有计划由远端静脉开始, 注意经常变换给药的静脉, 以利静脉恢复。要经常观察局部有无红、肿、热、痛、血管变硬等。使用药物前要先回抽有回血, 经证实在血管内方可输入, 在输注过程中要加强观察, 防止化疗药外渗。在输注长春瑞滨前后给予地塞米松或氢化泼尼松, 输完用生理盐水冲洗静脉, 以减轻静脉的刺激。因长春瑞滨是发泡性药物, 并且是高渗透性的, 可透过血管深入皮下组织间隙, 导致局部浓度过高, 破坏了细胞膜内外的渗透压平衡, 同时局部pH改变, 引起静脉炎或毛细血管痉挛, 局部供血减少, 使组织缺血、缺氧, 局部出现水疱, 形成硬结和溃疡[2]。因此首选深静脉置管。1例采用外周静脉化疗后第9天出现药物化学性静脉炎, 根据化疗药物的性质选择合适的解毒剂, 用生理盐水+利多卡因+地塞米松作局部封闭, 用33%硫酸镁湿敷, 或用金黄散与蜂蜜调成糊状, 敷于患处, 并抬高患肢。或外涂醋酸氟轻松软膏, 经处理后局部未出现坏死及硬结。

2.5 头晕的护理

本组患者出现头晕2例, 嘱其卧床休息, 起床速度宜慢, 外出时要有家属陪伴, 给予监测血压, 密切观察生命征的变化。遵嘱口服西比灵对症处理后均能顺利完成治疗。2.6 骨髓抑制的护理 重组人凋亡素联合全身给药后, 均出现Ⅰ～Ⅳ度骨髓抑制。护理措施为: (1) 掌握粒细胞下降的程度至最低点, 注意血象的变化, 可预防应用特尔津或瑞白。 (2) 指导患者保持口腔及皮肤黏膜的清洁卫生, 可给予生理盐水或温开水漱口。 (3) 要经常开窗通风, 保持室内空气新鲜, 环境要清洁, 用消毒灵擦拭桌椅和地面。 (4) 注意观察患者有无牙龈出血, 皮肤有无出血点。 (5) 指导患者多休息, 避免到人多的地方, 限制探视。

2.7 恶心、呕吐的护理

该药联合长春瑞滨、顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的消化道反应主要表现为恶心、呕吐。 (1) 本组患者治疗前均使用止吐药 (如格拉司琼、托烷司琼等) , 胃肠道反应严重时, 应用地塞米松处理, 甲氧氯普安20mg肌内注射或氯丙嗪镇静处理。 (2) 口服胃肠动力药, 如吗丁啉、伊托必利等, 制酸药如耐信等及胃黏膜保护药, 特别是使用激素的时候可加用氢泵抑制剂。 (3) 提供安静卫生的进食环境, 前后用餐适当活动。 (4) 指导患者进清淡易消化食物, 少量多餐, 多进食蔬菜和水果, 根据患者的饮食习惯, 尽量做到色香味俱全, 鼓励患者多进食, 积极配合治疗。

2.8 心脏毒性的护理

化疗前应了解患者有无心脏病病史, 并检查心电图。对老年人、有心脏病史患者应慎用或禁用心脏毒性药物。严密观察病情的变化, 监测心率、心律, 必要时遵医嘱给予抗心律失常药、保护心脏的药物。

2.9 肾毒性的护理

化疗前必须进行有关肾功能的检查。化疗前和化疗时嘱患者多饮水, 使尿量每天维持在2000～3000ml。使用顺铂时需进行水化, 每天输液3000ml, 用生理盐水稀释药液效果最好。1例出现高尿酸血症, 除每天给予大量液体, 促使尿量增多外, 还可口服碱性药物以利尿酸溶解。注意控制食用高嘌呤含量的食物, 如肉类、动物内脏、花生、瓜子等, 每日限制蛋白质入量, 多吃新鲜蔬菜和水果。应密切观察肾功能状况, 发现异常及时报告。

3结果

3.1 治疗效果

本组6例患者中, 部分缓解2例, 稳定3例, 进展1例, 治疗有效率为33.3%, 疾病控制率为83.3%。生存质量较未用该方案前有所改善, 生存期较预期长。

3.2 不良反应发生情况

见表1。

4讨论

重组人凋亡素2配体与国产长春瑞滨联合顺铂方案联合化疗药治疗增效显著[2], 对晚期肺癌患者可延长无疾病进展期, 控制肿瘤进展而达到良好稳定病情的作用。由于TRAIL通过与TNF受体超家族中的DR4、DR5两种死亡受体结合, 诱发细胞膜表面死亡受体DR4和DR5三聚化, 并与死亡受体胞外富含Cys区域相结合, 激活DR4、DR5分子中的死亡结构域, 从而引发细胞凋亡的流程。人TRAIL分子由281个氨基酸组成, 重组人可溶性TRAIL/Apo2L为第114-281个氨基酸, 分子量19.6kD。而长春瑞滨联合顺铂方案有较好的近期疗效, 毒性反应可耐受, 可作为初治晚期非小细胞肺癌的一线治疗[3]。本方案治疗晚期非小细胞肺癌有较好的疗效, 特别对复治者也可取得较高的有效率, 可考虑作为二线治疗方案[4]。而且重组人凋亡素2配体不良反应轻微, 人体耐受良好, 且非常安全;疗效评价显示对晚期恶性非小细胞肺癌、淋巴瘤、胃癌等多种肿瘤有良好的效果。本组病例中将重组人凋亡素2配体与国产长春瑞滨联合顺铂方案联合使用有效, 不良反应轻, 人体的耐受性好, 再配合以上细致有效的护理措施, 极大地提高了患者生活质量。

关键词：重组人凋亡素,长春瑞滨顺铂,非小细胞肺癌, 晚期

参考文献

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[3]赵彦南, 陈坤, 蔺强, 等.国产长春瑞滨联合顺铂治疗初治晚期非小细胞肺癌[D].中国科学院上海冶金研究所, 材料物理与化学 (专业) .博士论文.2000.

人肺癌细胞 篇9

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Trizol、PrimeScript RT reagent Kit with g DNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)购自Takara。

1.2 仪器与设备

ABI 7500 FAST荧光定量PCR扩增仪,美国ABI公司;Libra S32PC紫外分光光度计,英国BIO Chrom公司。

1.3 标本来源

收集自2010年4月～2010年10月桂林医学院附属医院和南溪山医院诊断为肺癌并行手术切除患者共30例。其中,男20例,女10例;年龄43～85岁,中位年龄56岁;病理分型:肺鳞状细胞癌12例,腺癌18例。标本直接取自手术切除物,均为配对组织,每对为肿物及距肿物>5 cm处正常组织各一份。在手术切除后10 min之内获得,取材后置于无菌冻存管中,立即放入液氮中冻存,取回放入-80℃低温冰柜中保存。

1.4 方法

1.4.1 引物的设计与合成

根据GenBank中CYP2A6和β-actin(做内参)设计引物:CYP2A6上游引物序列为:5'-ACACCAAGTTTCGGGATTTC-3',下游引物序列为:5'-AACAGTACCGCTTTCCGATG-3',扩增产物片段长度为189 bp;内参β-actin:上游引物:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3',下游引物:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3',产物长度285 bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。

1.4.2 R NA的抽提

取冻存的组织标本50～100mg,加入1 m L的Trizol,在液氮状态下进行匀浆处理,按Trizol操作步骤提取DNA以1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,紫外分光光度计测定各个RNA样本的纯度和含量,A260/A280在1.8～2.2之间。

1.4.3 c DNA的合成

按照PrimeScript RT reagent Kit With g DNA Eraser说明书的要求取1μg的总RNA以Oligo dT为引物进行反转录。合成的c DNA置于-20℃保存备用。

1.4.4 荧光定量PCR

使用ABI 7500 Fast Real Time PCR System进行PCR扩增及结果分析,采用SYBR法。取反转录后的c DNA稀释10倍后,取2μL作为模板,按照TAKARA试剂盒的说明,配制反应体系:SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10μL,上、下游引物各0.3μL,ROX 0.4μL,模板2μL,加灭菌蒸馏水至20μL。反应条件为:95℃变性30 s,95℃3 s,60℃30 s,40个循环(该条件为普通RT-PCR优化得到)。每份c DNA样品均在相同反应条件下进行CYP2A6及β-actin的检测,所有样本重复3次,阴性对照以DEPC水为模板,结果采用比较CT法定量,计算方法是2-△△CT法,计算公式如下:△△CT=CT(目的基因-内参基因)癌组织-CT(目的基因-内参基因)癌旁组织。计算CYP2A6基因的起始模板的量,从而反映出CYP2A6基因在不同样本的表达水平。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。取5μL荧光定量PCR的产物上样于1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.5 PCR测序

随机抽取样本进行RT-PCR反应,得到的产物取5μL于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,将条带割胶纯化后测序,测定产物的特异性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学处理,计量资料以均数±标准差表示,癌组织与癌旁组织比较采用配对t检验,CYP2A6 m RNA表达与临床病理参数间的比较采用两样本t检验,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色肺癌的病理分型

本实验中收集到的30对肺组织均经过HE染色证实其病理分型,肺鳞状细胞癌12对、腺癌18对(如图1)。

2.2 RNA的抽提及Re a l-time P CR

利用Trizol法对RNA进行抽提,取5μL产物上样于1%琼脂糖凝胶电泳,结果可清楚看到18 s和28 s条带,证明RNA质量较好(图2)。将RNA反转录后进行荧光定量PCR检测,通过荧光定量PCR扩增曲线,产物到达平台期,对融解曲线分析,可以看到单一的峰型,说明扩增产物有较高的特异性(图3)。PCR产物采用比较CT法定量,根据2-ΔΔCt值计算CYP2A6基因的起始模板量,从而反映出CYP2A6在不同样本的表达水平。如表1。

2.3 实时荧光定量P CR检测CYP 2A6 mRNA的表达

30例肺癌患者癌组织和癌旁组织CYP2A6m RNA表达量的结果经配对t检验,癌组织CYP2A6m RNA的表达量是癌旁组织的0.25,P=0.018差异有显著性(表1)。

2.4 组织中CYP 2A6 mRNA的表达与临床病理参数的关系

组织中CYP2A6 m RNA的表达与患者的年龄、性别、病理分型及有无淋巴结转移无关(P>0.05)(表2)。

2.5 荧光定量P CR产物琼脂糖凝胶电泳结果及P CR产物测序

取5μL的荧光定量PCR产物上样于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,可看到在189 bp和285 bp出现相应的条带,结果如图4。将纯化后的RT-PCR产物进行测序反应,结果与GenBank(Gene ID:1548)上公布的序列一致,测序结果如图5(截取部分)。

3 讨论

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,吸烟暴露被认为是肺癌的最主要的危险因素,最近WASSENAAR[7]等人报道CYP2A6与吸烟的行为有重要关联。烟草中含有数百种已知的和可能的致癌物,可由代谢酶活化。细胞色素P450是致癌物代谢活化的典型的Ⅰ相代谢酶。CYP2A6包含在P450家族中,主要在肝脏表达,对于尼古丁和烟草特异致癌物NNK的代谢有重要作用。

吸烟是导致肺癌的重要原因,但是并不是所有的吸烟者都会患肺癌,这主要是个体差异的问题,不同个体对于致癌物的代谢吸收不同,致癌物进入人体后在酶的作用下代谢激活,发挥基因毒性。因此,这些酶的代谢化学致癌物的能力被认为是肿瘤的危险因素之一。之前有研究证明CYP2A6遗传多态性在尼古丁代谢、吸烟行为及肺癌风险方面有很大的个体差异[8]。而且证实CYP2A6的多态性与尼古丁代谢率的改变有关,这些突变在主要在非洲及美国轻度吸烟人群中发现[9,10,11]。CYP2A6等位基因的缺失在不同的人种群中可以降低或增加肺癌的风险。日本研究小组研究发现CYP2A6缺失型可降低患肺癌的危险性[12]。但是,随后谭文[13]等人关于一个大样本病例对照研究(包括151例肺癌,326例健康者),却得出了相反的结论,认为携带CYP2A6缺失基因型的个体患肺癌的危险性增加,他们分析认为CYP2A6是尼古丁、亚硝胺等致癌物的代谢最重要的酶,由于CYP2A6缺失基因型不能产生有活性的酶,导致肺内前致癌物的蓄积,从而通过其他代谢途径如:CYP2D6/CYP1A1等,从而产生终致癌物,引起癌症的产生,因此CYPs各亚家族之间的协同关系起着十分重要的作用。KADLUBAR[14]等通过一项病例对照研究,揭示高水平的CYP2A6的活性,在中西部美国人群中与胰腺癌密切相关。

本研究采用荧光定量PCR技术,在PCR过程中将靶基因的扩增、杂交以及光谱检测技术结合起来,对靶基因的表达水平进行准确的定量检测[15]。不仅操作简单,而且敏感性和特异性比传统PCR更好。通过分析肺癌及其相应癌旁正常组织中CYP2A6的表达水平,以探究CYP2A6在肺癌发生发展中的作用。结果表明,在肺癌组织中,CYP2A6的m RNA水平低于正常组织,比较CYP2A6基因的表达与患者临床病理参数的关系发现,CYP2A6的m RNA的表达水平与患者性别、年龄、肺癌的病理分型及有无淋巴结转移无关(P>0.05)。之前有研究证明许多P450酶在肿瘤中过表达。例如,CYP2S1在肺鳞癌中及CYP2A5在化学致癌物诱导的小鼠肝癌中[16,17],但是也有学者发现在肝癌组织中有多种CYP450基因的表达发生了下调,表达量明显的低于癌旁组织和正常的肝组织[18],与本实验结果相符。笔者分析认为,CYP2A6在肺癌组织中m RNA的表达下调,推测CYP2A6在肺癌中可能扮演肿瘤抑制基因的角色。CYP2A6在肺癌组织中功能的丧失可能会促进细胞的肿瘤性转化。从另一方面讨论,在癌旁正常组织中CYP2A6对外源性致癌物的代谢活化,使得终致癌物增多,促进肿瘤的发生,但是在肿瘤组织中,CYP2A6表达的降低可导致CYP2A6对致癌物的代谢作用减弱,起到一种保护作用。也可以推测,可能有下游靶基因代替CYP2A6基因促进肿瘤的发生。本研究证明,CYP2A6在肺癌组织中的表达较癌旁正常组织下调,提示CYP2A6在肺癌发生发展中可能起作用,但是对于具体的CYP2A6在肺癌中的基因功能及其分子机制有待进一步地研究。

摘要：目的 检测肺癌及相应癌旁正常组织中细胞色素P450 2A6(CYP2A6)mR NA的表达,探讨其可能的临床意义。方法 采用Real-time PCR技术比较人肺癌与相应癌旁正常组织中CYP2A6mRNA的表达差异,并比较CYP2A6基因的表达与患者临床病理参数的关系。结果 CYP2A6 mR NA在肺癌组织中的表达低于对应的癌旁组织(P<0.05),CYP2A6 mRNA的表达程度与患者的性别、年龄、肺癌的病理分型及有无淋巴结转移无关(P>0.05)。结论 CYP2A6 mRNA在肺癌组织中的表达下调,提示CYP2A6基因表达下调可能在肺癌的发生发展中起作用。

人肺癌细胞 篇10

1资料与方法

1.1一般资料选取2013年9月至2015年9月我院収治的90例肺癌合并恶性胸腔积液患者作为研究对象,全部患者均经影像学、细胞学、病理学检查确诊,并签署了知情权同意书。按随机数字表法将患者分为对照组与观察组,每组45例。对照组患者中,男23例,女22例,年龄47~71岁,平均(58±4)岁;肺癌类型:腺细胞癌19例,鳞状细胞癌16例,小细胞癌10例。观察组患者中,男24例,女21例,年龄46~70岁,平均(58±3)岁;肺癌类型:腺细胞癌20例,鳞状细胞癌13例,小细胞癌12例。两组患者性别、年龄、肺癌类型比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。

1.2治疗方法两组患者均给予止痛、营养支持等对症治疗。同时,对照组患者给予胸腔闭式引流联合胸腔内灌注重组人白细胞介素-2,方法:置管后1~3 d内尽可能地将胸腔积液引流干净,并注入重组人白细胞介素-2(北京双鹭药业股份有限公司,批号:20130911,规格:20万U),每周共200万U,连续使用4周。观察组患者在对照组基础上采用沙利度胺(常州制药有限公司,批号:20130712,规格:20 mg×20片)进行治疗,第1天口服沙利度胺100 mg,连续治疗1周后增加至每天200 mg,然后维持此剂量。治疗4周后,抽取所有患者空腹静脉血5 ml离心处理后放置于-80℃环境中保存,检测血清血管内皮生长因子(VEGF)水平,并记录不良反应发生情况。

1.3疗效判定标准完全缓解:患者经治疗后胸腔积液完全消失,并维持4周以上;部分缓解:患者经治疗后胸腔积液减少50%以上并能够维持4周以上;稳定:患者经治疗后胸腔积液减少不足50%或增加不超过25%;进展:患者经治疗后胸腔积液增加25%以上[3]。疾病控制率(%)=(完全缓解例数+部分缓解例数+稳定例数)/总例数×100%。

1.4统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料以±s表示,组间比较采用t检验,计数资料以百分率表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1治疗前后血清VEGF水平比较治疗前,两组患者的血清VEGF水平差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,观察组患者的血清VEGF水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2临床疗效比较观察组患者的疾病控制率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

注:与对照组比较,χ2=5.93,*P<0.05

2.3不良反应发生情况比较两组患者的不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

3讨论

晚期肺癌患者多伴有恶性胸腔积液,其预示着肿瘤已发展至终晚期,此时采用胸腔内排液引流、胸腔镜手术、胸膜固定术等治疗方法,仍无法获得满意疗效。沙利度胺是一种谷氨酸衍生物,其可通过作用于人内皮细胞株,抑制对该细胞分泌VEGF,同时可促进细胞毒性T淋巴细胞增殖,并于诱导期分泌γ干扰素及重组人白细胞介素-2,以发挥抗肿瘤功效,另外还通过增强自然杀伤细胞(NK)活性而间接发挥抗肿瘤效果。沙利度胺虽然疗效显著,但有研究报道显示其可增加“海豹婴儿”的发病率,原因是该药物可抑制新生血管形成[4]。重组人白细胞介素-2作为一种临床应用较广泛的生物反应调节剂,能够促进T淋巴细胞、NK细胞等增殖,并可加快淋巴细胞分泌抗体及干扰素,从而达到抗肿瘤,提高机体免疫力的目的。两者联合产生的临床效果明显优于单独应用重组人白细胞介素-2,且不会增加相关毒性反应,患者耐受性较好[5]。

本研究结果显示,治疗后观察组患者的血清VEGF水平明显低于对照组,疾病控制率明显高于对照组;两组患者的不良反应发生率差异无统计学意义,与林志豪等[6]的研究结果相似。提示采用沙利度胺联合胸腔内灌注重组人白细胞介素-2治疗肺癌合并恶性胸腔积液临床效果显著,可通过降低血清VEGF水平,延缓疾病进展,且安全性高。

但由于本试验样本量较少,随访时间较短,未能对肺癌患者的远期生存率及淋巴转移情况进行分析,临床医师可通过进一步扩大样本资料收集范围并延长随访时间,以获得更加准确的结论。

参考文献

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