增强型绿色荧光蛋白（精选五篇）
增强型绿色荧光蛋白 篇1
1材料与方法
1.1质粒和菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a(含质粒p EGFP-N1) 为克隆宿主菌,BL21菌为质粒表达菌, 均由本实验室保存。
1.2动物
雌性SD大鼠,10只,体重(220±10)g,动物合格证号:0079674,广东省实验动物中心提供。
1.3试剂
高纯度小提中量质粒提取试剂盒购自Omega公司,QIA quick PCR Purification Kit购自QIAGEN公司,低分子蛋白Marker、Gel DNA Purification Kit、 Eco RⅠ、Bam HⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA、Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 3.0购自Takara公司,异丙基硫代 -β-D- 半乳糖苷(IPTG)购自Amersco公司,中性粒细胞分离液试剂盒购自天津灏羊生物科技生物有限公司,胎牛血清购自天杭生物科技有限公司,DMEM购自GENMED公司。
1.4仪器
单人双面垂直洁净工作台购自苏州净化设备有限公司,振荡培养箱购自美国SHLEL Lab公司,PCR扩增仪购自美国ABI公司,荧光分光光度计LS-555购自美国Perkin Elmer公司,凝胶成像系统Bio-rad为美国GEL-EQ公司生产,荧光显微镜为日本奥林巴斯生产,TG16-W微量高速离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,细菌计数板为英国THOMA公司生产。
1.5方法
1.5.1增强型绿色荧光蛋白序列的PCR扩增和酶切以p EGFP-N1为模板,引物1为:5'-CGCGGAT CCATGGTGTGCAAGGGCGAGG-3',引物2为:5'-CC GGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3';PCR反应条件如下:94℃预变性5 min,然后进入94℃变性45 s,58℃退火45 s,72℃延伸60 s,共28个循环,72℃继续延伸10 min[8]。EGFP片段进行Eco RⅠ 和Bam HⅠ酶切。
1.5.2原核表达载体p ET-20b (+)-EGFP的构建按照高纯度小提中量质粒提取试剂盒说明书提取p EGFP-N1,Eco RⅠ酶切后用QIA quick PCR Purification Kit纯化大片段,再进行Bam HⅠ酶切,然后用Takara Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 3.0胶回收。双酶切后的EGFP和p ET20b(+)纯化后进行酶连接再转化到BL21,BL21菌液涂布于100 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基, 37℃培养18 h。待生长出菌落后挑取大肠杆菌BL21的单菌落,PCR鉴定EGFP片段,鉴定成功后,BL21用20%的甘油保存,置入 -80℃冰箱冷冻备用。重组质粒p ET-20b(+)-EGFP于上海生工生物工程有限公司测序。
1.5.3增强型绿色荧光蛋白的诱导表达以1%比例培养转化子DE3至OD600为0.6~0.7时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导1~8 h。每隔1 h取1 ml细菌,8 000 r/min离心1 min,倒弃上清液,加入600μl无菌PBS混匀,吸取500μl菌液用LS-555进行荧光强度测定,记录其在激发波长395 nm、发射波长510 nm的荧光强度。
1.5.4细菌培养与准备按1%比例接种细菌于50 ml的LB液体培养基中,200 r/min摇床振荡,37℃培养16 h,加入IPTG使培养基终浓度为1 mmol/L,诱导8 h。然后8 000 r/min离心5 min,倒弃上清,加入无菌LB液体培养基20 ml,混合均匀,重悬,每1 ml分装,再同样的条件离心,倒弃上清液。置入 -20℃冰箱保存抗菌实验备用。中性粒细胞抑菌实验用的细菌按1%比例加入E.coli至5 ml LB肉汤培养基, 37℃培养过夜,200 r/min。加入IPTG诱导细菌8 h, 8 000 r/min离心1 min。倒弃培养基,加入5 ml含10% 血清的DMEM,重悬,吸取1 ml菌液备用,细菌数约为1×1010cfu/ml。
1.5.5中性粒细胞分离SD大鼠实验前禁食12 h, 不禁水。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉,固定。抽取SD大鼠外周血10 ml装于肝素抗凝管中,外周血与中性粒细胞分离液的用量为1∶1的体积比。在超净台中,小心将外周血加入分离液中,水平离心机2 500 r/min离心25 min,此时离心管中由上至下细胞分4层。取第3层(此层液体中含有大量中性粒细胞),吸取混浊层2 500 r/min离心15 min。弃上清液,留下含有红细胞的中性粒细胞沉淀,加入1ml红细胞裂解液,在冰中反应5 min,并轻微摇动离心管, 1 800 r/min离心5 min。重复此步骤,离心获得较高纯度的中性粒细胞。最后加入2 ml含有10%血清的DMEM,重悬,1 800 r/min离心2 min。加入2 ml含有10%血清的DMEM将中性粒细胞稀释,细胞计数板下观察约6×107的细胞。
1.5.6中性粒细胞抑菌实验EGFP-E.coli为对照组,中性粒细胞与细菌共培养为实验组。实验组反应的总体积为600μl,其中性粒细胞300μl,细菌200μl,100μl含10%血清的DMEM。同样体积的对照组中,细菌为200μl,400μl含10%血清的DMEM。 均匀混合,37℃培养箱培养,分别测定0~60 min,检测1次 /10 min;60~120 min,检测1次 /15 min。在上述指定时间后,取600μl反应体系,8 000 r/min离心1 min[9,10]。弃上清液,加入同体积的PBS,重悬。吸取500μl测定荧光强度。
1.5.7抑菌曲线方程当细菌与中性粒细胞共同培养时,中性粒细胞对大肠杆菌产生抑制作用[10],其公式为:被中性粒细胞抑制的细菌数量 = 细胞外的细菌数量×中性粒细胞对细菌的抑制率。假设中性粒细胞对细菌的抑制作用符合一级速度方程,则公式为:ln(F/F0)=-kt,F0指抑菌时间为零时测得的大肠杆菌荧光强度;F指一定抑菌时间后细胞外的细菌数量与被中性粒细胞抑制的细菌数量的大肠杆菌荧光强度差值;k指抑菌的一级速率常数,t为抑菌的时间。
2结果
2.1载体pET-20b(+)-EGFP的构建
利用T7启动子型表达载体p ET-20b(+)表达外源基因时,先用PCR仪扩增出EGFP目的基因片段, 再插入到载体的多克隆位点(见图1)。
转化子的PCR结果显示,目的基因EGFP成功插入p ET-20b(+)(见图2)。挑选的转化子过夜培养, 提取质粒,同时于30℃酶切6 h后电泳,与EGFP目的基因PCR后的结果对比,发现750 bp附近有酶切的小片段(见图3)。
吸取诱导8 h的BL21菌液5μl滴加在细菌计数板上,在荧光显微镜400倍下观察到芝麻般的绿色亮点,随着倍数增加,可以看到细菌的轮廓,整个细菌都携带绿色荧光(见图4)。
2.2基于增强型绿色荧光蛋白的中性粒细胞抑菌曲线拟合
用从SD大鼠外周血提取的中性粒细胞与EGFP-E.coli共培养指定时间后,测得各个时间点的荧光强度,60 min前,中性粒细胞对细菌的抑制作用不明显,60 min后,对照组的荧光强度数值与实验组比较明显增加(见图5)。将中性粒细胞抑菌的数值对时间t进行变化,按照公式ln(F/F0)=-kt做一次线性拟合,其结果为ln(F/F0)=0.035 9 t-0.557 9(R2= 0.823 8,Sy.x =0.679 3),一级速率常数为0.035 9,常数项为 -0.557 9。t1/2为19.306 min(见图6)。
3讨论
目前,生物研究中用到的标记物有碱性磷酸酶、 荧光素酶、氯霉素转化乙酰基酶等,但是这些物质都要底物反应和辅助因子的参与才能显色。绿色荧光蛋白不仅有上述标记物的优点,而且不用加入任何物质就可表达绿色荧光,实现在体观察。因此绿色荧光蛋白被广泛应用于各领域的科学研究[11,12,13,14]。本实验选择构建EGFP原核表达载体,便于实现实时定量大肠杆菌数量。本实验固定荧光分光光度计的激发波长为395 nm,荧光扫描波段为450~650nm,发现在510 nm处EGFP有较强的荧光强度。
长期以来人们认为PMN缺乏转录活性,几乎不能合成任何蛋白的终末分化细胞,其作用仅限于吞噬与杀菌[15,16]。PMN抗菌的方式可能有以下2种:1杀菌物质MPO-H2O2-C1-的免疫调节作用;2PMN产生的细胞因子及对细菌感染的免疫调节。本实验提取SD大鼠中性粒细胞于体外抑菌实验结果表明, PMN的抑菌效果在60 min后作用明显,其抑菌机制可能与MPO有关。荧光素酶的特性在于只有活菌才能表达,且细菌数与荧光素酶的表达呈正相关。国外ATOSUO等[9]用重组菌E.coli K12-Lux表达荧光素酶,监测各时段内中性粒细胞对细菌的杀菌记录,证明髓过氧化酶是杀菌的一个重要物质,离不开次氯酸的形成而诱导细菌裂解。
早在20世纪初就有不同学者对PMN抑菌动力学过程进行不同的动力学方程描述。为直接测量细胞内的杀菌能力,LEIJH等[17,18]将细菌和PMN的作用分为2个时相:1细胞外减少的细菌数反应PMN吞噬数;2细胞外的细菌移动前,PMN摄取细菌3 min后,再将其通过离心与未吞噬细菌的PMN分离。该方法存在以下缺点:1PMN在重新恢复活性的冰浴过程中因离心和冲洗又受到损伤;2吞噬细菌后3 min才开始测量杀菌率,难以准确做到;3细胞内细菌在第2时相中可能受到PMN分泌物质的破坏。在此基础上,HAMPTON等[10]假设PMN吞噬和杀菌都符合一次线性方程,按一步法测量PMN吞噬和杀菌的能力。PMN和细菌共培养时,在一个特定的时间段分离吞噬与未吞噬的细菌,PMN吞噬和杀菌的能力通过细胞外减少的细菌和细胞内改变的细菌数计算。 虽然该方法能从吞噬细菌开始就测量并避免第2时相测量方法中胞外细菌分离后PMN的活性丧失,但是该一步法要在稀释细菌后,涂布于琼脂板培养一段时间才可计数,耗时费力。
在测量PMN抑菌率方面,本文基于EGFP表达的E.coli,与文献[10]一样遵循一次线性方程假说。中性粒细胞抑菌的荧光 - 时间实验结果显示,时间与ln(F/F0)呈正相关(R2=0.8238),这种现象与PMN杀菌物质MPO密不可分。为排除PMN的分泌物质对抑菌的影响和细菌对PMN的刺激[9,15,16],将提取出来的PMN和细菌迅速共培养,从培养时刻就开始计算PMN对细菌的抑菌率。60min内实验都未表明PMN有抑制细菌生长的现象,这与t1/2为19.306 min相互矛盾。这可能是因为60 min内的细菌生长速率远远高于PMN对细菌的抑制作用,导致PMN需要一定时间恢复活性才可发挥抑菌作用。中性粒细胞抑菌的荧光 - 时间实验显示,60 min后实验组的荧光强度明显低于对照组。本实验也提示PMN对E.coli吞噬率并不完全符合一次线性方程。这与细菌和细胞共培养的数量有关系。本实验基于EGFP改进传统的PMN抑菌方法。
摘要：目的 基于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)研究中性粒细胞(PMN)对大肠杆菌的抑制作用。方法 以p EGFP-N1为模板,扩增出750 bp的EGFP基因片段,克隆到p ET-20b(+)载体上,构建p ET-20b(+)-EGFP并转入宿主BL21,PCR鉴定、IPTG诱导表达后的EGFP-E.coli与中性粒细胞共同培养后,测定指定时间的荧光强度,并线性拟合中性粒细胞抗菌的动力学方程。结果 成功构建重组质粒p ET-20b(+)-EGFP和BL21表达增强型绿色荧光蛋白。中性粒细胞对大肠杆菌的作用时间与ln(F/F0)呈正相关(R2=0.823 8)。结论 基于EGFP改进传统的PMN抑菌方法。
增强型绿色荧光蛋白 篇2
利用绿色荧光蛋白(GFP)基因结合鼠Talin基因表达技术及水稻(Oryza sativa L.)转基因技术,筛选出表达稳定和具等位基因型的第三代转基因水稻.在其活体花粉的4个发育阶段(Ⅰ.小孢子晚期;Ⅱ.二细胞早期;Ⅲ.二细胞晚期;Ⅳ.三细胞阶段),观察了细胞内微丝骨架的分布和结构形态的变化.发现在这4个花粉发育阶段,花粉内的营养核、生殖核、生殖细胞和精细胞都在不同的.发育阶段出现位移.而这些位移与微丝骨架的结构变化和运动有密切关系.在胞质中央的微丝网络以及细胞周质的网络不断变化和互动,导致营养核、生殖核或生殖细胞和精细胞的定向位移.在活体生殖细胞和精细胞内,存有一股与细胞纵轴平行排列的微丝骨架.这些微丝骨架对生殖细胞及精细胞可以提供移动的动力,这对生殖细胞或精细胞在花管内以及胚囊内的运动(包括独自游动)提供了依据.
作 者：徐是雄 叶秀麟 王凌健 丘志平叶永健 作者单位：徐是雄,丘志平,叶永健(香港大学植物系,香港)
叶秀麟(香港大学植物系,香港;中国科学院华南植物研究所,广州,510650)
王凌健(香港大学植物系,香港;中国科学院上海植物生理生态研究所,植物分子遗传国家重点实验室,上海,200032)
绿色荧光蛋白的发现与发展 篇3
生物发光是一个很普遍的生物学现象。早期的生物研究大多涉及分类、形成和生态方面，后来重点转移到生态、生化的研究，目前已进入分子生物学的研究水平。从不同生物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。迄今，腔肠动物门多管水母属的维多利亚多管水母（aequorea victoria）的发光蛋白系统研究得较为深入。
多管水母体内存在着两种发光蛋白，即光蛋白——水母素（aequorin）和绿色荧光蛋白（GFP，green fluorescent protein）。光蛋白作为分子标记及Ca2+的生物学指示剂，已被成功地应用于哺乳动物、植物、酵母、大肠杆菌细胞，用于检测很多重要的生理学和病理学反应。GFP作为良好的细胞、发育、分子生物学的活体标记，用于监测各种体系中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。利用GFP进行示踪的研究范围相当广泛，从细胞生物学的基础研究如细胞骨架和细胞分化、细胞器动力学和囊泡跟踪，到一些热门的前沿和学科和技术领域，如器官移植、基因治疗、神经生物学等等。
日本科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖。他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医学等领域具有重要的意义，而且也与人们的日常生活密切相关，对于提高人类的生活品质以及进一步改善人类的健康有十分重要的意义。
1研究GFP的时间线索
GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半个多世纪的时间。首先简单回顾一下这半个多世纪内和GFP相关的主要事件。
1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光物质。
1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并分离了GFP，证实了绿色荧光物质是一种蛋白质。它的溶液在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。
1969年之前称为绿色蛋白质（green protein）得名“绿色荧光蛋白”。
1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间会发生能量转移（图2）。
1979年下村修找到了GFP中的生色基团（Chromophore）（图3，图5）。
1985年普腊石（Douglas Prasher）根据蛋白质的氨基酸顺序拿到了光蛋白（水母素）的基因。
1992年普腊石拿到了GFP的基因。
1993年GFP中生色基团的结构被确认。
1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。
1995年研制出了增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它的转录速度比野生GFP快四倍。
1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构，钱永健在EGFP的基础上，利用突变技术，设计并研制出黄色荧光蛋白。
1997年光蛋白和GFP被用于Ca2+的敏感指示剂。
1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造并用于科学研究。
在研究GFP的50多年间，2008年诺贝尔化学奖的三位得主做出了至关重要的贡献。
2下村修与维多利亚水母
在下村修以前就有人研究过生物发光现象，例如萤火虫发出荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化氧化底物分子荧光素（luciferin）以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修的研究。
1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了维多利亚多管水母中的发光蛋白—水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班前，他将产物倒进水池里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定钙离子能增强光蛋白发光。
1963年，他和另一位研究者约翰森在《科学》杂志报道钙和光蛋白发光的关系。其后Ridgway和Ashley提出可以用光蛋白来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，光蛋白成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。
其实早在1955年，Davenport和Nicol就发现水母可以发出绿光，但不知其因。在1962年下村修和约翰森在那篇纯化光蛋白的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，通过纯化他们得到了这种蛋白，当时称之为绿色蛋白，即现在所谓的称绿色荧光蛋白。Morin和Hastings提出光蛋白和GFP之间可以发生能量转移。光蛋白在钙刺激下会发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光（图2）。
GFP是一种酸性球状蛋白质，它的发射光谱在505 nm具有吸收峰；激发光谱则在395 nm和470 nm具有吸收高峰（图4）。
只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，但与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为生色基团的部位。在GFP的初级氨基酸序列上，第65个至第67个氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成环状六肽三体，以共价键与GFP蛋白肽键骨架相连（图5）。生色基团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。下村修最先推导了水母GFP色基结构，后来又进行了进一步验证与修改。
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。但他的研究却切切实实地对之后的生物科学起到了革命性的作用。当他离开普林斯顿到Woods Hole海洋研究所后，他的同事普腊石（Douglas Prasher）对生物示踪分子非常感兴趣。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了光蛋白的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就能很好地应用它，比使用蛋白质更为方便。
1996年，GFP的晶体结构也被研究得到，它是一个由11个β－折叠的蛋白质以一个α－螺旋蛋白质为中心轴所形成的笼状圆柱体，生色基团是α－螺旋蛋白质的重要组成部分，它的位置非常接近这个笼状圆柱体的中心位置（图6）。另一种平面的GFP表示方式如图7，其中绿色的代表β－折叠，红色的代表α－螺旋。
3沙尔菲将GFP应用于生物示踪
将GFP表达到其他生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的沙尔菲实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。
沙尔菲在之前的工作中一直和Caenorhabditis elegans（一种被广泛用于生物研究的线虫）打交道。C. elegans这种线虫只有959个细胞的一个脑，并且其三分之一的基因和人类基因有关。更重要的是，C. elegans是透明的，研究人员可以很方便的应用显微镜对其进行观察研究。
1988年当沙尔菲得知GFP后，他意识到可以使用这一工具对C. elegans进行研究，它可以作为变化的绿色信号对线虫不同细胞间的活动进行示踪观察。他将GFP基因与其他不同基因结合成可发出荧光的蛋白质的想法付诸于实践后，就能观察到细胞中不同蛋白质的形成。
沙尔菲使用DNA技术，将GFP的基因作为一个片段注射到成熟的线虫的性腺细胞核中（图7A），由于线虫是雌雄同体，它可以使自已受精。GFP基因就出现在它的卵中（图7B），这些卵分裂后形成新的细胞核在紫外光照射下可发出荧光（图7C和D），图7E中显示了两个这样的细胞核。
光蛋白和GFP都有重要的应用，但光蛋白是荧光酶的一种，它需要荧光素才能发光，而GFP蛋白质本身即能发光，在原理上有重大突破。在上世纪90年代，科学家一般认为荧光物质在细胞中是通过许多步骤得到，每一步都需要蛋白质来控制，并且此过程需要一些特殊的蛋白质（荧光素）来产生GFP中的生色基团。但沙尔菲用实验证实了这个假设是错误的。沙尔菲的研究向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的示踪分子的作用。
当时沙尔菲的论文引起了巨大轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。
将GFP用作示踪分子，具有以下优点：①荧光稳定；②检测方便；③无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制；④GFP对受体细胞基本无毒害；⑤由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果；⑥不需任何反应底物和辅助因子；⑦可制成永久标本；⑧灵敏度高。
尽管GFP作为报告基因或示踪分子有许多优点，但野生GFP发出的荧光较弱。其次，荧光反应不是酶反应，不能通过添加某些物质来加强信号，且不易对荧光进行定量检测。另一方面，GFP基因在植物细胞内的表现频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表现。所以有更多的科学家对GFP进行了改进。
从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少被人注意。在1974年以后，特别是八十年代后的后继工作，很多研究生都能够完成。其中例外的是钱永健所在实验室所发现的变种出现新颜色，这一发现却非显而易见。
4钱永健改造并发展了GFP的应用
随着生物信息学、定点突变，DNA－shuffling等一系列理论和技术的应用，绿色荧光蛋白的家族成员不断扩大，出现荧光光谱、温度敏感性等改变的多种变异型。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得拓宽了GFP的应用范围，解决了许多单独运用GFP不能解决的问题。GFP基因的改进目前主要通过以下几个途径得到突变体GFP：①更换GFP生色团氨基酸；②改变碱基组成；③除去GFP基因中隐蔽剪接位点；④插入植物内含子；⑤更换强启动子等突变体GFP；⑥增加荧光强度和热稳定性。
目前已有的具不同光谱的突变型有EBFP（增强型蓝色荧光蛋白）、ECFP（增强型青色荧光蛋白）、EGFP（增强型绿色荧光蛋白）和EVFP（增强型黄色荧光蛋白），分别呈现蓝、青、绿、黄四种颜色。至今所获得突变型的最大发射波长为529nm，为黄绿色荧光。
钱永健是和下村修研究相关的一位重要科学家。从八十年代一开始，他的工作就非常引人瞩目。同时他十分肯定下村修的工作，较早公开介绍下村修的发现。在他的研究工作中，有两项重要工作都与下村修有一定联系。
一项是研究钙染料。1980年钱永健发明检测Ca2+浓度的染料分子，1981年改进了将染料引入细胞的方法，以后发明了更多、更好的染料，被广泛地应用。检测钙的方法有三种：选择性电极、光蛋白、钙染料。在钱永健研制的钙染料没有出现以前，具有空间检测能力的只有光蛋白，但当时光蛋白需要注射到细胞内，应用不方便。钱永健的钙染料可以通透到细胞里面去。
钱永健的第二项工作是研究GFP。1994年起，钱永健开始研究并改造GFP，并获得了多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种。改造后的GFP促进了生色基团的折叠，改善了其荧光特性，甚至可以得到红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，有的可激活、可变色，大大拓宽了GFP研究的领域。他被公认为这方面的先驱。
钱永健对人们理解GFP及GFP族的化学荧光特性做出了重要的贡献，他使不同的GFP产生的荧光颜色覆盖了整个可见光谱，同时他改善了生色基团，增强了GFP的荧光效应，也使荧光的稳定性增强。他发展了GFP，使之成为极有效的研究动态生命过程的基因标记工具。
5结束语
科学上一个偶然的发现往往会引起巨大的科学革命，新工具的出现会使研究取得意想不到的新成果。当年下村修研究了GFP，但他并没有意识到GFP重要的应用前景。沙尔菲恰恰在自己的实验研究过程中采用了最新的GFP研究成果，并发展了GFP的应用领域。而当今世界上用的GFP大多数是钱永健实验室改造后的变种。
获得2008年诺贝尔化学奖的三位科学家在发现和研究GFP的过程中各有贡献，而且可以看出他们的研究是一脉相承的。随着分子生物学理论与技术的发展，对GFP研究的进一步深入，GFP在分子生物学领域的应用进一步加强。GFP工程，包括GFP蛋白工程和GFP基因工程，尤其GFP基因作为新型报告基因越来越受到关注。当然在应用GFP作为研究工具时，也遇到了一些问题。例如将GFP作为选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒时发现一些因素影响着GFP的检测。此外，在细胞生物学的研究过程中发现新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式过程十分缓慢。但随着生物技术的发展，对GFP的基础理论研究的进一步深入和新型突变体的不断出现，有理由相信这些问题终将会得到解决，从而使GFP更好地为科学研究服务。
参考文献：
[1]Baird G. S，Zachatias D. A，Tsien R. Y．Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1999(20)：11241~11246．
[2]Heim R，Cubitt A. B，Tsien R. Y．Improved green fluorescence[J]．Nature，1995(373)：663~664．
[3]王晓丽，邵卫星．绿色荧光蛋白研究进展[J]．动物医学进展，2008，29(1)：56~59．
[4]http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/[EB/OL].2008-10-08．
增强型绿色荧光蛋白 篇4
黄色单胞菌L1是MBR膜面污泥的优势菌之一[6], 现从MBR膜丝表面分离出一株黄色单胞菌L1 (Xanthomonas Campestris L1) , 研究表明其具有较强的EPS释放能力, 可能是造成MBR膜污染的主要细菌之一。本实验将利用重组DNA技术, 将荧光蛋白基因整合到黄色单胞菌的染色体中, 使荧光蛋白获得稳定、长效的表达, 已便在MBR反应器中更好地示踪黄色单胞菌的生长和迁移情况。
p Tn Mod-OGm是由Tn5转座子元件、窄宿主复制位点p MBI、来自RP4的结合转移诱动基因序列以及硫酸庆大霉素抗性基因 (Gm) 组成的质粒。该质粒只能在E.coli S17-1中复制而不能在其他革兰氏阴性菌中复制, 故被称为自杀性质粒。它可以通过结合转移的方法转至多数革兰氏阴性菌中[7]。研究表明Tn5转座子在革兰氏阴性菌中的转座几率高达10-3, 非常适合于革兰氏阴性菌的基因工程操作。而且本研究分离的黄色单胞菌是革兰氏阴性菌, 因此选用带有Tn5转座子的质粒p Tn Mod-OGm作为载体, 将egfp基因插入其转座子中的多克隆位点之后, 利用Tn5转座子的转座功能将egfp基因转座到黄色单胞菌的染色体上, 实现黄色单胞菌荧光标记。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒
实验采用的菌株、质粒名称如下:大肠杆菌JM109、黄色单胞菌L1 (革兰氏阴性菌, KanR) 、携带增强型绿色荧光蛋白基因 (egfp) 的质粒p SEBG、E.coli S17-1和含Tn5的质粒p Tn Mod-OGm。
1.1.2 主要试剂
实验采用的限制性内切酶 (Kpn I、SalΙ) 、DNA凝胶回收试剂盒、Ex Taq (d NTP、Taq酶、缓冲液) 、DNA快速连接试剂盒 (Rapid DNA Ligation Kit) 均来自TAKARA公司, SSCS和抗生素 (Amp、Gm、Km) 均来自生工, Axy Prep质粒DNA小量试剂盒来自爱思进生物技术有限公司, DNA纯化试剂盒 (Wizard Genomic DNA Purification Kit) 来自Promega公司。
1.1.3 主要仪器设备
主要仪器为生化培养箱 (PYX-150S-A) 、PCR仪 (Bio-Rad PTC-100) 、电泳仪 (Bio-Rad Power Pac) 、冷冻离心机 (Sigma 3-16K) 、可见分光光度计 (UV-1700) , 荧光显微镜 (Olympus BX41) 。
1.2 方法
1.2.1 egfp基因的获得
利用Axy Prep质粒DNA小量试剂盒提取质粒p SEBG, 以含egfp基因的质粒p SEBG为模板, 利用合成的引物 (上游引物:5’-CGGGGTACCCCGATG-GTGAGCAAGGGCGA-3’和下游引物:5’-CCAGT-CGACTGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’, 含有Kpn I和Sal I酶切位点) 进行PCR扩增, 扩增反应体系:PCR Premix 25μL, 正反向引物 (20μM) 各1μL, 模板DNA (1.25 ng/μL) 2μL, dd H2O补足50μL。扩增条件:94℃3 min;94℃30 s, 55℃30 s, 72℃50 s, 30个循环;72℃10 min。PCR产物利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。
1.2.2 p ZTE转化子的构建
将回收到的egfp基因片段与T载体进行连接, 形成新质粒p ZTE, 转化至感受态大肠杆菌JM109。采用氨苄抗性平板、菌落PCR和质粒酶切对p ZTE转化子进行筛选。
1.2.3 重组质粒p TE-OGm的构建
1.2.3. 1 egfp基因片段和p Tn Mod-OGm片段连接
首先提取质粒p ZTE和p Tn Mod-OGm, 用限制性内切酶Kpn I和Sal I对两者进行双酶切, 将酶切载体p Tn Mod-OGm片段和egfp基因片段进行连接, 形成新质粒p TE-OGm。
1.2.3. 2 转化p TE-OGm至E.coli S17-1
将连接产物转化至感受态E.coli S17-1, 采用硫酸庆大霉素抗性平板和质粒PCR进行转化子检测。
1.2.4 接合转移与重组子的筛选
以携带p TE-OGm具有硫酸庆大霉素 (Gm) 抗性的E.coli S17-1作为供体菌, 以具有卡那霉素 (Kan) 抗性的黄色单胞菌作为受体菌。首先, 供体菌与受体菌转接培养达到对数生长期后3 500r/min离心5 min收集菌体, 分别重悬于50μL新鲜LB培养基中, 混合后涂布在无抗性的LB琼脂平板上37℃共同培养18 h;然后, 将菌苔用液体LB培养基从平板上吹打下来, 混合菌体悬液均匀涂布在含卡那霉素与硫酸庆大霉素的LB琼脂平板上, 37℃培养过夜;最后, 挑取单菌落在含卡那霉素与硫酸庆大霉素的LB琼脂平板上划线, 挑选能正常生长的菌株, 分别采用质粒PCR和荧光显微镜进行重组子检测。
1.2.5 重组子的传代培养及其稳定性检测
对阳性重组子作连续传代培养, 并通过荧光显微镜检测其遗传稳定性。
2 结果与分析
本实验的质粒构建过程可用图1表示。
2.1 p ZTE质粒的构建
从图2可以看出, p ZTE质粒可以用egfp基因的引物扩增出一个略小于750 bp的片段, 与egfp基因的片段大小相似。图3是p ZTE质粒经Kpn I和Sal I双酶切之后的结果。结果显示切开的两个片段中, 一个约为750 bp, 与所设计的egfp基因的片段大小相似;另一个约为2 500 bp与T载体大小相似, 可以初步推测egfp基因已经连接到T载体上, 而且通过PCR加入的两个酶切位点也能够顺利地被Kpn I和Sal I酶切。
M为DL2000;1为阳性对照:p SEBG为模板的egfp PCR产物;2为p ZTEi6为模板的egfp PCR产物;3为p TE-OGm-1为模板的egfp PCR产物;4为p TE-OGm-2为模板的egfp PCR产物;5为p TE-OGm-3为模板的egfp PCR产物;6为阴性对照, 灭菌水为模板的egfp PCR产物
2.2 重组质粒p TE-OGm的构建
从图4可以看出, 质粒p TE-OGm可以用egfp基因的引物扩增出一个略小于750bp的DNA片段, 该片段大小与egfp基因的片段大小相似。测序结果表明质粒p TE-OGm上含有egfp基因, 由于质粒p T-n Mod-OGm上并没有egfp基因, 故p TE-OGm上测序得到的目的基因是通过连接得到, 证实了egfp基因已经成功连接到质粒p Tn Mod-OGm上, 即质粒p TE-OGm构建成功。
2.3 接合转移以及重组转化子的筛选
重组子菌株黄色单胞菌L1-20荧光激发较强, 所以选择其作进一步分析。利用质粒提取试剂盒没有从重组子黄色单胞菌L1-20中提取到质粒, 说明该重组子中不含有质粒。图5是重组子基因组DNA进行PCR检测结果, 从图中可知, 用egfp基因的引物进行扩增, 阳性对照质粒p TE-OGm扩增得到一个略小于750bp的目的片段;重组子黄色单胞菌-20基因组DNA扩增出与p TE-OGm相同大小DNA片段;而受体菌黄色单胞菌基因组则没有扩增出目的条带。所以可以证实egfp基因已经转座到黄色单胞菌L1-20的基因组上了。
M为DL2000;1为pT E-OGm为模板的egfp PCR产物;2为黄色单胞菌L1为模板的egfp PCR产物;3为黄色单胞菌L1-20为模板的egfp PCR产物;4为阴性对照, 灭菌水为模板的egfp PCR产物
将重组子在无抗生素选择压力下, 在LB培养基中连续传代培养后, 在荧光显微镜下仍然可见较强的荧光, 说明荧光蛋白表达比较稳定。发光情况见图6。
2.4 传代培养对重组子荧光蛋白表达的影响
从图7可见, 传代培养前重组子荧光较强, 而进行传代培养10代后的重组子荧光蛋白表达量略有下降。
3 讨论
3.1 关于荧光标记
本实验成功地通过连接T载体与来自质粒p SEBG上的egfp基因而构建成质粒p ZTE, 并成功地将来自p ZTE的荧光蛋白基因插入到自杀质粒p Tn Mod-OGm中转座子上的多克隆位点Kpn I和Sal I中构建成质粒p TE-OGm。利用双重抗生素筛选的方法对重组子进行筛选。由于p TE-OGkm在黄色单胞菌L1中无法复制, 只有当p TE-OGm上带有硫酸庆大霉素抗性与egfp基因的转座子元件发生转座并插入到受体菌黄色单胞菌L1的染色体上时, 重组子才能够在同时含硫酸庆大霉素 (Gm) 与卡那霉素 (Kan) 的抗性平板上生长成菌落。
3.2 关于荧光蛋白的表达
利用转座子进行基因标记的方法可以比较简便地将标记基因随机地插入到目的菌株的基因组染色体中, 通过此方法进行染色体标记得到的重组子遗传稳定性比将标记基因插入到质粒上要好。因为质粒在不同宿主细胞中的稳定性不一致, 转入的质粒很容易丢失。Leff等人[1]曾报道, 贫营养条件下的河水可能会导致p GFP质粒丢失或不表达。不足的是, 这种插入染色体上的标记基因经常是以单拷贝的形式存在, 标记基因表达的强度较弱。故本实验使用了野生型绿色荧光蛋白的改造版, 所激发的荧光强度是野生型的4~35倍。
实验在重组子筛选培养的初期, 激发的荧光较强, 而经过传代培养之后, 激发的荧光逐渐变弱, 但是最后能够稳定在一个水平。分析可能的原因是自杀质粒的自杀过程需要一定时间, 当自杀性质粒还未被目的菌株自身的复制充分稀释之前, 该质粒上存在的标记基因的表达会对荧光激发起到加强作用。
参考文献
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[2] Errampalli D, Okamura H, Lee H, et al.Green fluorescent protein as a marker to monitor survival of phenanthrene-mineralizing Pseudomonas sp.UG14Gr creosote-contaminated soil.FEMS Microbiology Econlogy, 1998;26:181—191
[3] Elvang A M, Westerberg K, Jernberg C, et al.Use of green fluorescent protein and luciferase biomarkers to monitor survival and activity of Arthrobacter chlorophenolicus A6 cells during degradation of 4-chlorophenol in soil.Environmental Microbiology, 2001;3 (1) :32—42
[4] Pinheiro L B, Gibbs M D, Vesey G, et al.Fluorescent referencestrains of bacteria by chromosomal integration of a modified green fluorescent protein gene.Appl Microbiol Biotechnol, 2008;77:1287—1295
[5] Campelo A B, Rodriguez A, Martinez B.Use of green fluorescent protein to monitor cell envelope stress in Lactococcuslactis.Appl Environ Microbiol, 2010;76:978—981
[6] 高秀红.A/O膜生物反应器中微生物群落的演替及对膜污染的影响.哈尔滨:东北林业大学, 2011:23Gao X H.Changes in characteristics of microbial community structure in A/O-MBR and relation to membrane fouling.Harbin:Northeast Forestry University Academic Degree Thesis, 2011:23
增强型绿色荧光蛋白 篇5
种子细胞的成骨功能是制约组织工程骨成骨能力的重要因素, 骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 具备较强的增殖能力和多向分化潜能[1,2], 成为组织工程骨种子细胞的重要来源之一。绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein, GFP) 是一种细胞标记蛋白, 可在慢病毒[3]、腺病毒[4]、质粒[5]等载体介导下, 在宿主细胞内表达绿色荧光蛋白基因, 可在体内、外示踪种子细胞的定植、存活及迁移等状况, 是一种具有广阔应用前景的标记物。慢病毒载体是可靠的基因转染载体, 具有转染谱广、表达稳定的特点[6]。因此, 通过慢病毒载体可将GFP基因整合入成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞基因组, 示踪骨髓间充质干细胞的功能状态, 可作为良好的种子细胞, 用于构建组织工程骨。
1 试剂和材料
1.1 材料及仪器
2014年1月至2014年12月间, 在新疆医科大学第一附属医院科研中心, 感染与免疫共建实验室。
实验动物:2月龄新西兰大白兔2只, 清洁级, 体重1.3~1.5kg。
1.2 试剂
胎牛血清, DMEM/F12培养基, TRIzolReagent, β-甘油磷酸二钠, 感受态Stbl3 E.coli菌株, GFP-p Lenti6/V5-D-TOPO vector重组真核表达质粒, 慢病毒包装质粒p LP1, p LP2, p LP/VSVG, Lipofectamine2000脂质体转染剂, 293FT细胞株 (invitrogen公司, 美国) ;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒, 高纯度质粒提取试剂盒, 培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒 (天根公司, 中国) ;Taq DNA聚合酶, Revert Aid TM First Strand c DNA Synthesis Kit (Fermentas公司, 立陶宛) 。
1.3 仪器
Steri-cycle CO2恒温培养箱 (Thermo公司, 美国) , IX71倒置荧光显微镜 (OLYMPUS, 日本) , ABI Veriti梯度聚合酶链反应仪 (Gene公司, 美国) , 凝胶成像仪 (BIO-RAD公司, 美国) , 生物安全操作柜 (Thermo公司, 德国) 。
2 实验方法
2.1 BMSCs的分离与原代培养
BMSCs的原代培养:2月龄新西兰大白兔2只, 氯胺酮 (50 mg/kg) 与地西泮 (50 mg/kg) 混合麻醉, 常规消毒, 注射器 (内含肝素200 U/m L) 抽取骨髓6m L。超净台内, 以8m L培养液 (内含体积分数为5%的FBS、DMEM/F12、维生素C 0.05 g/L、青霉素和链霉素各100 U/L) 混匀, 接种于细胞培养瓶内, CO2孵箱中常规培养。以后每3~4d换液, 待细胞长至80%~90%汇合时, 传代培养。
BMSCs的诱导培养:第3代的BMSCs, 换以成骨诱导培养基进行培养 (体积分数5%的FBS, DMEM/F12, 地塞米松1×10-8mmol/L, β-磷酸甘油钠0.01mol/L, 维生素C 0.05g/L, 青霉素和链霉素各100U/L) , 每3~4d换液1次、待细胞约80%~90%融合时, 传代培养。
2.2 RT-PCR鉴定成骨细胞非特异性基因表达
2.2.1 引物设计
参照董世武等[7]文献所载, NCBI数据库中的PrimerBLAST Tool设计引物, 和Genebank中的序列比对, 委托上海生工公司合成。碱性磷酸酶基因:上游引物:5’-ACG TGG CTA AGA ATG TCA TC-3’, 下游引物:5’-CTG GTA GGC GAT GTC CTT A-3’;退火温度59℃, 扩增目的片段475bp。骨钙素基因:上游引物:5’CAT GAG AGC CCT CAC A 3’, 下游引物:5’-AGA GCG ACA CCC TAG AC-3’, 退火温度59℃, 扩增片段310 bp。Ⅰ型胶原基因:上游引物:5’-CCC AAC CAA GGA TGC ACT AT-3’, 下游引物:5’-TGT TCT GAG AGG CGT GAT TG-3, 退火温度52℃, 扩增片段259 bp。骨桥蛋白基因:上游引物:5’-CCG ACC AAG GAA CAA T-3’, 下游引物:5’-CTC TGA AGC ACC AGG ATA-3’, 退火温度53℃, 扩增片段581 bp。碱性成纤维细胞生长因子基因:上游引物:5’-GCG ACC CAC ACA TCA AAT TA-3’, 下游引物:5’-TTT CAG TGC CAC ATA CCA GC-3’, 退火温度52℃, 扩增片段218 bp。β-actin基因:上游引物:5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’, 下游引物:5’-CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT C-3’, 扩增片段540 bp。
GFP基因:上游引物:CAC CAT GGT GAG CAA GGG CGA G, 下游引物:CTG TAC AAG TAA AGC GGC CGC, 退火温度64℃, 扩增片段723bp。
2.2.2 总RNA抽提及RT-PCR方法
用TRIzol法提取原代及诱导后第1或2代BMSCs总RNA, 紫外分光光度计检测其浓度, 凝胶电泳显示RNA完整性。两步法RT-PCR法进行检测, 第一链c DNA合成方法及条件, 请参看Fermentas公司生产的#K1621试剂盒说明书。
PCR体系包括:10×Taq buffer 2.5μL, 25 mmol/L Mg Cl23.0μL, (10mmol/L) d NTP 2.0μL, Taq DNA Polymerase (1 U/μL) 1.0μL, dd H2O 18.5μL, 模板c DNA 1.0μL, 上游引物和下游引物 (20μmol/L) 各1.0μL, PCR仪设置为95℃预变性3 min, 1个循环;30个循环, 退火45 s (退火温度请参上) , 72℃延伸1min;72℃, 7 min总延伸。在相同反应条件下, 5个基因均分别设置β-actin引物反应作为内参。凝胶电泳鉴定后, 送PCR产物进行测序, 经DNASTAR5.0软件比对, 基因序列无移码突变。
2.3 GFP-慢病毒载体构建及基因转染
2.3.1 GFP-慢病毒载体构建
GFP-p Lenti6/V5-D-TOPO vector真核表达质粒3ug (胡杨构建) , 3个慢病毒包装质粒p LP1, p LP2, p LP/VSVG 9ug, 脂质体转染剂Lipofectamine 200036u L介导下, 4个质粒共转染293-FT细胞株, 48h后收集病毒上清液备用。
2.3.2 GFP-慢病毒载体转染骨向诱导的BMSCs
(1) 转染前1d, 第3代成骨方向诱导的兔BMSCs以1×106/m L的密度接种入六孔板, 孵育过夜。 (2) 转染当天, 每细胞孔中加入1m LGFP-慢病毒液, Polybrene 10 mg/L, 孵育过夜。 (3) 第3d, 换新鲜培养基, 去除病毒液, 孵育过夜。 (4) 第4d, 换用5 mg/L Blasticidin的培养基, 孵育过夜;以后每3~4d换液。 (5) 第14~16d, 经10~12d含Blasticidin的培养基筛选、培养, GFP/BMSCs组细胞株可见数个大小不等、分散的细胞团块。
3 统计学分析
收集、整理实验数据, 应用SPSS17.0软件进行分析, 实验数据以±s表示, 组间比较采用单因素方差分析或t检验, P<0.05为差异有显著性意义。
4 实验结果
4.1 兔BMSCs形态观察
原代BMSCs体积较小, 细胞形态呈梭形、三角形或多边形。细胞可汇合形成细胞团, 细胞团块中心细胞密集聚集, 周围细胞呈放射状排列 (见图1) 。
成骨诱导培养后, BMSCs细胞形态呈三角形及不规则形, 细胞核圆形或椭圆形, 胞浆中有黑色颗粒。随着传代次数的增加, BMSCs生长变慢 (见图2) 。
4.2 成骨细胞非标志性基因在m RNA水平的表达
BMSCs在成骨方向诱导培养过程中, 阶段性表达成骨非特异性基因。第1、2代BMSCs, 仅表达碱性磷酸酶和collgen-Ⅰ基因;诱导培养后第1代BMSCs, 表达骨桥蛋白和碱性磷酸酶基因, 第2代BMSCs继续表达骨桥蛋白和碱性磷酸酶基因, 还表达骨钙素、碱性成纤维细胞生长因子以及collgen-Ⅰ基因。
凝胶电泳图及基因测序结果:骨桥蛋白、骨钙素、碱性成纤维细胞生长因子基因PCR产物无移码突变, 电泳图和测序结果如图3-10所示。
4.3 GFP重组慢病毒载体构建及转染
4.3.1 GFP-p Lenti6/V5-D-TOPO vector测序鉴定
GFP-p Lenti6/V5-D-TOPO vector重组慢病毒真核表达质粒, 经测序鉴定, GFP基因序列完全一致, 无移码突变 (见图11-12) ;293FT细胞培养 (见图13) 。
4.3.2 GFP重组慢病毒感染成骨方向诱导的BMSCs
倒置荧光显微镜观测, GFP-重组慢病毒感染成骨诱导的BMSCs 48 h后, 波长488 nm蓝色荧光激发, 绿色荧光蛋白表达 (见图14) 。
5 讨论
现阶段研究表明, 骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基的诱导下, 成骨诱导培养基含一定浓度的维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠等诱导剂作用下, 可诱导成为具有成骨功能的成骨细胞[8]。本实验结果表明, 在成骨培养基的诱导下, BMSCs确向成骨细胞分化, 按照一定时间顺序表达成骨非特异性基因。第1, 2代原代BMSCs表达碱性磷酸酶和collgen-Ⅰ基因, 诱导培养后第1代BMSCs表达骨桥蛋白和碱性磷酸酶基因;诱导后第2代细胞, 继续表达骨桥蛋白和碱性磷酸酶基因, 还表达骨钙素、碱性成纤维细胞生长因子和collgen-Ⅰ基因。碱性磷酸酶常作为骨髓间充质干细胞向成骨分化成功的标志, 其可作为成骨细胞成骨的标志之一[9,10]。collgen-Ⅰ、骨桥蛋白和骨钙素也是成骨细胞的标记物之一[11,12], 与肖仕辉[13]等研究结果一致, collgen-Ⅰ、骨钙素及碱性磷酸酶的阶段性表达, 证实骨髓间充质干细胞确向成骨细胞分化, 具备良好的成骨功能。