植物生理实验教学中叶绿素提取方法的改进与探讨

1 引言

植物生理学是高等院校生物科学及生物技术专业的一门主要必修课程,是现代农林业生产的重要理论基础。植物生理学实验教学质量的提高对于学生深入理解和掌握理论知识、培养学生的好奇心和创造性思维能力至关重要[1] 。由于受教材、教学环境和实验条件等多方面原因的限制,实验的教学内容和教学方法基本停留在以往的水平,导致实验教学达不到应有的效果[2,3] 。

叶绿素的含量与植物光合速率,营养状况等密切相关,是植物生长发育的重要生理指标之一,叶绿素的提取和测定也是植物生理学实验教学中的一项重要内容[4] 。但传统的实验教学方法一般采用的是Arnon法[5] ,在长期的教学实践中发现,由于此法要经过称重、研磨、过滤等繁杂的操作程序,极易导致材料的损失、叶绿素的光解等问题,最终使各实验小组的实验结果极不稳定、差异极大,因此,又进一步挫伤了学生参与实验的热情和积极性。同时,在研磨的过程中所使用的丙酮具有极强的挥发性,对学生的眼、鼻、喉具有一定刺激性,同时,丙酮对人的中枢神经系统还具有一定的麻醉作用,长时间接触会导致乏力、恶心、头痛、头晕等症状。为了便于实验教师的教学组织及学生操作,提高实验教学效率,改善实验效果,根据多年的实验教学实践,对叶绿素提取的实验方法进行了优化和改进。

2 实验方法的改进

2.1 取材方法的改进

按照传统的Arnon叶绿素提取法,第一步取材,是采用称重法称取一定量的待测植物的叶片。但由于实验室配备的电子天平数量有限,不可能做到学生人手一台,导致每位学生轮流称取待测材料,操作不但费时费力,而且还容易导致较大的实验误差。为此,我们将称量法改为“打孔”法,具体做法是,先选取一定规格的打孔器,并测量其孔径,计算出打孔器的孔洞面积,取材时,在叶片的相应部位,用打孔器取下3-5片圆形叶片,然后,将其剪碎后转入提取液中。

2.2 提取液的改进

在改进的实验方法中,我们采用80%丙酮﹕乙醇=2:1的混合液作为叶绿素的提取液,取代了原实验教材中的80%丙酮。教学实践证明,丙酮与乙醇的混合液对叶绿素的提取效率要高于丙酮。这可能是丙酮与乙醇混合液的协同效应所致[6] 。而丙酮与乙醇的混合比例,则是通过正交试验确定的最佳配比。

2.3 提取方法的改进

按照植物生理实验教材中的方法,是将取好的材料转入研钵中,加入一定量的80%丙酮充分研磨,然后,多层滤纸过滤,获得叶绿素提取液。此操作过程中具有诸多不利因素。首先,研磨法会使部分实验材料损失,从而导致较大的实验误差;其次,研磨的过程中,会有大量的丙酮弥漫于实验教室中,由于丙酮极强的挥发性和对中枢神经系统的麻醉作用,非常不利于学生的身体健康。为了克服了Arnon法的研磨、过滤或离心的烦琐步骤,陈福明曾采用了混合液法[7] 提取植物的叶绿素,这种方法快速、简便,而且获取叶绿素稳定性较高,而且其浸提液的叶绿素吸收光谱与丙酮提取液叶绿素吸收光谱相似,吸收高峰则完全相符,因此,可利用Arnon公式来计算叶绿素含量。之后,张宪政等在其基础上进行改良,提出了丙酮、乙醇混合液法[8] ,其稳定性高于丙酮、乙醇、水混合液法,但提取时间较长,不适合用于实验教学。为此,我们在张宪政的丙酮乙醇混合液法和冯瑞云的热醇法的基础上[9] ,在实践中摸索出了一种稳定高效的混合液加热浸提法。并利用正交设计对丙酮乙醇的混合比例、反应温度和处理时间等提取条件进行了优化。具体做法是,将用打孔器取好的叶片剪成碎条,置于盛有丙酮乙醇混合提取液的10ml刻度试管中,补充提取液至10ml;然后,将其置于温度为60℃的水浴中,处理10min;待叶片由绿色变为白色时,取出刻度试管上下摇匀,使溶液中叶绿素分布均匀后,即可用于光密度值的检测。

2.4 检测与计算

分别用分光光度计测定待测提取液在645nm和663nm处的光密度值,并记录。然后,根据Arnon公式计算叶绿素浓度(CV,ug·m L-1)。由于采用了打孔器取材,所以,可按下列公式转换为以单位叶面积表示的叶绿素含量(mg/m2):CA=CV*1/1000*10*10000/S=CV*100/S[10] 。

3 结语

叶绿素是植物光合作用的重要基础物质,其含量的变化是植物生长发育、营养状况以及生理代谢变化的重要指标之一,并且可作为环境生理研究的参考指标。通过叶绿素提取的实验操作,有利于加深学生对课堂教学中的理论知识的理解和掌握。与原实验教材推荐的实验方法相比,我们改进的实验方法,可使指导教师对实验教学的组织和安排更为有序,保证了实验课堂教学良好的教学秩序;其次,新的实验方法也有利于学生的操作,在一般实验室条件下,即可满足学生人手一份,人人动手的实验要求,有利于学生动手能力和实验操作能力的培养和提高[11,12] ;此外,该方法有效减少了实验操作导致的实验误差,降低了实验操作过程中丙酮对学生身体健康的不良影响;同时,改进的实验方法简化了操作过程,在保证实验效果的前提下,大大缩短了实验时间,显著提高了实验教学效率,从而保证了该实验在实验教学中的顺利实施和完成。

摘要：本文针对目前高校植物生理实验教学中,叶绿素提取方法繁琐、教学效果不稳定、难以在课堂教学中有序地组织和开展等问题,对叶绿素的提取这一教学实验,从取材、提取、检测与计算等各个环节均进行了改进和优化,旨在使实验教学简便可行,重现性好,便于学生操作,能显著提高实验教学效率。

关键词：植物生理学实验,叶绿素提取,改进,探讨

参考文献

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