深海微生物研究论文提纲

论文题目：深海微生物Bacillus cereus 98耐受重金属及Pseudomonas stutzeri 273抑制生物膜机制初探

摘要：对于微生物来说,逆环境无处不在,而为了应对环境胁迫,微生物已经进化出多种耐受机制。重金属胁迫是最具代表性的环境胁迫之一,镉（Cd）作为常见的有毒重金属,在环境中导致各种不良影响,这就使得细菌进化出不同的策略来应对高浓度的镉。除此之外,微生物在生长繁殖过程中也伴随着与其他微生物的空间和资源竞争,其中生物膜的产生是微生物能够产生竞争力的主要原因之一,这促使其他微生物进化出多种机制来应对生物膜的形成。本文一方面以对重金属镉具有较高耐受性的菌株Bacillus cereus 98为研究对象,探讨钙（Ca）增强其应对镉胁迫的机制;另一方面以Pseudomonas stutzeri 273为研究对象,探讨其分泌的胞外多糖EPS273抑制铜绿假胞菌生物膜形成的机制。本研究首先从深海冷泉沉积物中分离的300多株菌株中筛选到7株对镉具有较高耐受性的细菌菌株,并发现钙的添加均能增强这7株菌株对镉的耐受性,且B.cereus 98对镉的耐受性增加最为明显。为了探究其潜在机制,本研究从蛋白质水平探究相关酶的表达以及相应代谢通路,分析结果表明在培养基中添加镉后,B.cereus 98中一氧化氮合成酶（NOS）的表达明显上调,而将一氧化氮（NO）转化为硝酸盐的一氧化氮双加氧酶（NOD）表达明显下调;培养基中钙补充后,与NO产生相关蛋白质表达水平与只添加镉时相比完全相反。通过实验进一步证明,镉可以诱导NO的合成,钙的添加可明显降低B.cereus 98胞内NO的含量,而铁的获取有助于钙介导的镉毒性的降低。此外,蛋白质组学分析结果还表明,在含镉的条件下添加钙时,硝酸还原酶（Nar）和亚硝酸盐还原酶（Nir）的表达显著提高,且相应离子的测定表明,添加钙实验组的硝酸根离子浓度、亚硝酸根离子浓度以及铵根离子浓度比未添加钙实验组的相应离子浓度都明显增强,表明钙的添加可促进胞内NO向相应离子的转化。因此,结合前人报道,我们初步推测在重金属Cd的胁迫下,B.cereus 98可产生大量的NO,而NO会产生氮氧化胁迫,最终导致细胞伤害的产生。而Ca的加入可以通过诱导相关酶的活性,将NO最终转化为铵根离子进而参与氮循环,从而消除NO产生的氮氧化胁迫,避免了细胞伤害的产生。此外,钙的添加同样能够增强B.cereus 98对其它重金属铜、铬、锰、镍的耐受性,且钙介导的镉毒性减轻同样适用于斑马鱼。此外,本研究还针对P.stutzeri 273抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的现象,通过转录组分析挖掘P.stutzeri 273分泌的胞外多糖EPS273调控的下游基因以及相关基因的功能,探究其抑制生物膜的机制。分析结果表明,铜绿假单胞菌PAO1经EPS273处理后,与生物膜形成密切相关的双组分调控系统、群体感应系统的基因的表达明显降低,与生物膜胞外基质形成、与鞭毛和细胞运动以及与铁的获取等相关基因的表达也发生明显变化。此外,双组分调控系统相关基因phoP、phoQ以及与eDNA降解相关基因eddA的突变株及相应突变株生物膜和迁移率测定进一步验证了转录组分析结果。因此,初步推测EPS273可能通过下调铜绿假单胞菌双组分调控体统PhoP/PhoQ的基因表达,进而调控群体感应系统LasI/LasR、RhlI/RhlR的基因表达,而群体感应系统进一步调控参与生物膜形成相关基因的表达。总而言之,在本研究中,我们一方面探讨了钙增强B.cereus 98应对镉胁迫的耐受机制。另一方面探讨P.stutzeri 273产生胞外多糖EPS273抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的机制,从两个不同的方面揭示了深海微生物的环境适应机制。

关键词：钙;镉;一氧化氮;胞外多糖273;生物膜

学科专业：生物工程（专业学位）

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 微生物与环境胁迫

1.2 非生物因素胁迫下微生物的耐逆机制研究

1.2.1 重金属污染及危害

1.2.2 微生物耐重金属环境胁迫机制研究

1.3 微生物对抗生物膜机制研究进展

1.4 海洋微生物的资源的多样性及利用

1.5 课题研究的意义与内容

第二章 耐重金属镉海洋细菌的筛选鉴定及性质研究

2.1 材料与仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂及主要培养基

2.1.3 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 重金属镉海洋细菌的分离与筛选

2.2.2 耐重金属镉海洋细菌的鉴定

2.2.3 镉及钙对海洋细菌生长情况的影响测定

2.2.4 最适钙浓度的测定及镉对待测菌株最小抑制浓度的测定

2.2.5 扫描电镜(SEM)观察Ca和 Cd对待测菌株的影响

2.2.6 待测菌株对重金属镉的脱除率测定

2.2.7 统计分析

2.3 实验结果

2.3.1 耐重金属镉海洋细菌的分离筛选与鉴定

2.3.2 最适钙浓度的测定及镉对B.cereus98 最小抑制浓度(MIC)的测定

2.3.3 Ca阻止Cd诱导下的B.cereus98 的细胞损伤

2.3.4 B.cereus98 对重金属镉的脱除率

2.4 小结

第三章 钙增强B.cerus98 对镉耐受性的机制初探

3.1 主要试剂与仪器

3.2 实验方法

3.2.1 蛋白质组测定

3.2.2 NO含量测定

3.2.3 硝酸根离子、亚硝酸根离子、铵根离子的测定

3.2.4 胞内Fe含量以及镉和铁同时存在下B.cereus98 的测定

3.2.5 钙降低镉毒性的广谱性分析

3.2.6 统计分析

3.3 实验结果

3.3.1 NO介导Ca增强B.cereus98对Cd的耐受性

3.3.2 铁的获取有助于钙增强B.cereus98 对镉的耐受性

3.3.3 钙增强B.cereus98对Cd的耐受性途径解析

3.3.4 钙降低镉毒性的广谱性分析

3.4 结果与讨论

第四章 Pseudomonas stutzeri273 抑制生物膜形成的机制初探

4.1 材料与仪器

4.1.1 实验菌株

4.1.2 实验试剂和主要培养基

4.1.3 主要实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 菌株的培养以及EPS273的纯化

4.2.2 转录组分析

4.2.3 突变株载体的构建

4.2.4 突变菌株回补

4.2.5 生物膜定量及细胞迁移率测定

4.3 实验结果

4.3.1 不同浓度EPS273 处理PAO1 的总体基因变化情况

4.3.2 EPS273 抑制铜绿假单胞PAO1 生物膜形成的转录组分析

4.3.3 转录组结果的RT-PCR验证

4.3.4 P.stutzeri273 突变菌株的相应性质测定

4.4 结果与讨论

第五章 总结

参考文献

致谢