MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

MTT法在检测细胞增殖方面的探讨（通用5篇）

篇1：MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

目的` 了解MTT(四甲基偶氮唑盐)法在检测细胞增殖性方面的作用.方法 采用酶标仪在570 nm波长附近(500-600 nm)处测定光吸收值,以反映活细胞的数目.结果 吸光度值在0.75-1.25时,这样才能保证数据有线性关系,MTT比色法才可灵敏、准确地反映出细胞数量上的变化.结论 MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖性方面有效的方法,具有操作简便、经济、快速、易自动化的优点.

作 者：赵嘉惠 张华屏 王春芳  作者单位：山西医科大学医学实验中心分子生物学实验室,太原,030001 刊 名：山西医科大学学报  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF SHANXI MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 38(3) 分类号：Q-331 关键词：比色法   细胞增殖   MTT  

篇2：MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株系

L929小鼠肺成纤维细胞(华北理工大学医学院中心实验室提供)。

1.1.2 纯钛试件及瓷粉

纯钛板(北京齿科材料公司)，Duceratin Kiss瓷粉(Vita，德国，金宇医疗有限公司提供)。

1.1.3 主要试剂和仪器

冰乙酸、碳酸钡、乙酰丙酮(天津市永大化学试剂有限公司)，钛酸丁酯(天津市光复精细化工研究所)，RPMI 1640培养基、25%胰蛋白酶(Gibco公司，美国)，胎牛血清(润泰生物科技有限公司，天津)，MTT(Sigma公司，美国)，DMSO(西安化学试剂厂，西安)，倒置相差显微镜(PM，一恒科技有限公司，上海)，BIO-RAD酶标仪(BIO-RAD公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 钛酸钡溶液配制

用磁力搅拌器把烧杯中15ml的冰乙酸加热至80℃，把1.03 g钛酸钡缓慢倒入烧杯持续搅拌20 min，取出烧杯冷却至室温，在25℃下加入1.53 ml钛酸丁酯继续搅拌5 min后加入0.08ml乙酰丙酮并搅拌30 min，将溶液室温下静置72 h后待用。

1.2.2 实验分组及试件制备

将纯钛板切割成直径为10 mm的圆形纯钛试件10个，打磨抛光后进行氧化铝颗粒喷砂处理，超声清洗所有试件15 min，最终形成厚度为0.7 mm的试件。A组:设置匀胶机将钛酸钡溶液均匀涂布于5个纯钛试件，经过干燥、烧结、保温、退火等处理形成镀有钛酸钡薄膜的纯钛试件;B组:5个纯钛试件进行氧化铝喷砂处理。将A组与B组纯钛试件上瓷，最终形成厚度为2 mm的试件。C组:阴性对照组(含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基)，D组:阳性对照组(1%苯酚)。

1.2.3 细胞培养及L929细胞生长曲线绘制

将L929细胞复苏，选取生长旺盛的细胞稀释成1×104～10×104/ml 10种密度细胞悬液，取1块96孔板接种一组完全培养基及10种密度的细胞悬液，每组平行5个复孔，每孔100μl，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。72 h后每孔加入20μl MTT(5 mg/ml)继续培养4h，弃去原有培养基每孔加入150μl DMSO，室温下震荡15 min，调节酶联检测仪波长为490 nm检测其吸光度(A)，实验重复3次。绘制L929细胞生长曲线，确定本实验室下MTT实验所需的最适细胞密度。

1.2.4 浸提液制备

超声清洗各组试件25 min,121℃高压蒸汽灭菌后置于玻璃瓶中，参照《GB/T16886.12-2005/ISO 10993-12:2002医疗器械生物学评价》第12部分:样品制备与参照样品，试件表面积与浸提液体积比1.25 cm2/ml，将所有试件持续浸提72 h，经0.22μm滤膜过滤除菌备用。

1.2.5 MTT比色法检测细胞毒性

取对数生长期细胞L929配成密度为6×104/ml的细胞悬液，接种于3块96孔板中，每组设5个复孔，每孔接种100μl。把培养板放入孵箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃去旧培养液，PBS冲洗3遍后A组加入钛酸钡涂层钛瓷结合浸提液，B组加入100%常规钛瓷结合浸提液，C组加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，D组加入1%苯酚，将96孔板放入37℃、5%CO2孵箱中培养1、3、5 d。在培养到第1、3、5 d各取出一块96孔板，倒置显微镜下观察细胞形态，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)继续在孵箱中培养4 h，吸出原有培养基后，每孔加入150μl DMSO，室温下震荡15 min，使结晶物充分溶解。调节酶联检测仪波长为490 nm检测其吸光度值(A490)，并按照如下公式计算细胞的相对增殖率和毒性分级。细胞相对增殖率(RGR)=(试验组平均A值/阴性对照组平均A值)×100%。细胞毒性分级标准:0级:细胞增殖率为81%～100%;1级:61%～80%;2级:41%～60%;3级:21%～40%;4级0%～20%。

1.3 统计学分析

数据以，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，各实验组、对照组A值比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 扫描电镜及能谱分析结果

涂层组织致密，有一定粗糙度，表面有纹理，无明显裂纹(图1)。能谱分析数据:Ba的原子百分率为10.97%,Ti为74.22%,O为7.17%,Si为5.91%,A为1.73%(图2)。

2.2 L929生长曲线实验结果

本实验室条件下，细胞的镜下观察及A值分析，经单因素方差分析得到6×104/ml密度比值最大，说明L929细胞的最适生长密度为6×104/ml(图3)。

2.3 倒置相差显微镜观察结果

A组:3个时间段，细胞逐渐增多，贴壁良好，大多数细胞呈长梭形或多边形，核卵圆形，胞质较丰满。B组:3个时间段，细胞逐渐增多，贴壁良好，细胞呈长梭形或星型，胞质均匀，核卵圆形，可见核分裂象。C组:3个时间段，细胞逐渐增多贴壁良好，细胞呈长梭形或星型，胞体丰满，核卵圆形，可见核分裂象。D组:3个时间段，均可见细胞碎片或细胞皱缩为圆形、不规则形，未见明显细胞核(图4)。

2.4 MTT比色法结果

同一培养时间，不同组浸提液与阳性对照组的吸光度值比较差异均有统计学意义(P<0.05)，钛酸钡涂层组吸光度值大于阴性对照组和常规钛瓷结合组，差异有统计学意义(P<0.05);除阳性对照组外，各浓度浸提液组的吸光度值均随着培养时间的延长而增加，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

细胞毒性评级:检测3个时间段，钛酸钡涂层组的细胞毒级为0级，常规钛瓷结合组除第3天为2级，其他为1级或0级，阳性对照组均为4级(表2)。

3 讨论

口腔材料在临床使用前，需要进行严格的生物安全性检测。1955年，Kawahara[5]首次提出用细胞培养法来检测口腔材料的生物安全性。L929作为已经建株的细胞系其敏感度与牙龈成纤维细胞相似甚至更高，其作为材料毒性测试的靶细胞，简单易得，重复性好。目前，国际上评价材料的生物安全性方法有很多，如琼脂扩散试验、同位素标记法、MTT法、流式细胞术、DNA合成率等。MTT法的生物学终点是线粒体，Mosmann于1983年首次采用MTT比色法来检测IL-2的生物学活性。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法可以十分灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的损害程度，能准确客观地对测试材料进行定量评价，并且操作便捷，灵敏度好，可用于大批量检测。

钛酸钡作为良好的介电材料，受到了许多学者的青睐[6]。由于其优良的性能，许多学者通过改性将其逐步应用于医学领域中，使其有了更广泛的应用。Ball等[7]研究发现多孔钛酸钡具有优良的压电效应并不表现短期的细胞毒性，在骨科组织工程应用方面具有潜力。国内学者赵明莉等[8]在钛酸钡压电陶瓷涂层用于种植支抗效果研究中发现，钛酸钡压电陶瓷涂层种植支抗移动距离明显减小，骨形成活跃，骨结合率及最大拔出力显著升高。而钛酸钡涂层作为口腔材料运用于牙科修复领域的细胞毒性研究国内外尚无报道。

本研究采用MTT法体外培养小鼠成纤维细胞L929检测纯钛烤瓷冠中钛酸钡涂层的生物安全性。结果显示，含钛酸钡涂层的实验组细胞形态正常，呈梭形或不规则多角形，细胞毒性检测为0级，说明含有钛酸钡涂层的钛瓷结合试件不表现出短期细胞毒性，生物安全性良好。学者杨杨[9]对口腔内几种常用牙科修复冠材料经细胞毒性的初筛，证实了钛合金具有优良的生物安全性。2015年，马慧等[10]在钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性研究中，用等离子喷涂技术在羟基磷灰石表面喷涂钛酸钡制备了压电陶瓷涂层后进行生物安全性的检测结果发现，钛酸钡压电陶瓷涂层无溶血作用、无毒性、不致热、无致敏作用，具有良好的生物安全性，本实验在细胞毒性方面，结果与其相似。国外学者Ciofani[11]研究发现携带多聚赖氨酸涂层的钛酸钡纳米颗粒在5 g/ml低浓度下可以很好地被小鼠心肌细胞所吸收同化，并可以作为有效的携带者显著地提高细胞携带蛋白的能力。本实验结果显示，随着实验组浸提液浓度的增加，小鼠成纤维细胞的增殖率有所提高，钛酸钡涂层对细胞的增殖有一定促进作用;实验第5天与第1天相比，常规钛瓷结合组试件的浸提液培养的小鼠成纤维细胞的增殖率有增长趋势，说明轻度受损的细胞随着细胞培养时间的延长，有回复的现象发生。但是，口腔内环境复杂，随着时间的延长，材料析出离子的种类、数量及结构可能会有更多变化。这些变化是否会对其细胞毒性产生影响，还有待于进一步研究验证。

本实验用含钛酸钡涂层的钛瓷结合组试件的浸提液体外培养L929小鼠成纤维细胞，采用MTT法研究试件浸提液对小鼠成纤维细胞L929增殖率的影响，初步证实含有钛酸钡涂层的钛瓷结合试件在体外毒性试验中无短期细胞毒性，推荐临床使用钛酸钡涂层来增加钛瓷结合强度，减少崩瓷瓷裂的现象发生，从而提高修复治疗的成功率。

摘要：目的:探索纯钛烤瓷冠中钛酸钡涂层对小鼠成纤维细胞L929形态及增殖率的影响,并评价其细胞毒性分级。方法:以含钛酸钡涂层的钛瓷试件、常规钛瓷试件的浸提液体外培养小鼠成纤维细胞1、3、5 d,并以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基为阴性对照组,1%苯酚溶液为阳性对照组,采用MTT法检测试件浸提液对小鼠成纤维细胞L929增殖率的影响。结果:含钛酸钡涂层的钛瓷结合试件浸提液培养的小鼠成纤维细胞L929形态正常,生长旺盛;钛酸钡涂层组吸光度值大于阴性对照组(P<0.05),含钛酸钡涂层的纯钛试件浸提液的细胞毒性分级为0级。结论:含钛酸钡涂层的钛瓷结合试件有良好的细胞相容性。

关键词：钛酸钡涂层,MTT法,小鼠成纤维细胞L929

参考文献

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[3]Troia MG Jr,Henriques GE,Mesquita MF,et al.The effect of surface modifications on titanium to enable titaniumporcelain bonding[J].Dent Material,2007,24(1):28-33.

[4]王慧,吴文慧,岳奇,等.纯钛表面制备钛酸钡薄膜的技术参数研究[J].表面技术,2013,42(6):69-72.

[5]Kawahara H,Shiota M,Yamakawa Y.Studies on the effects of dental metals upon the mesenchymal cell in tissue culture[J].J Osaka Odont Soc,1955,18(2):343-348.

[6]Tangwiwat S,Milne SJ.Barium titanate sols prepared by a diol-based sol-gel route[J].J Non-Crystalline Solids,2005,351(12-13):976-980.

[7]Ball JP,Mound BA,Nino JC,et al.Biocompatible evaluation of barium titanate foamed ceramic structures for orthopedic applications[J].J Biomed Mater Res A,2014,102(7):2089-2095.

[8]赵明莉,刘福来,张海军,等.钛酸钡压电陶瓷涂层用于种植支抗效果研究[J].中国实用口腔科杂志,2015,8(4):219-225.

[9]杨杨,季娟娟,彭蓓,等.4种铸造合金对人牙龈成纤维细胞的毒性研究[J].实用口腔医学杂志,2009,25(1):84-87.

[10]马慧,徐国强,迪丽努尔·阿吉,等.钛酸钡压电陶瓷涂层的生物相容性评价[J].中国组织工程研究,2015,19(3):384-388.

篇3：MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

为了进一步验证NGF的促生殖作用并探索其机制, 同时建立一种更有效的卵巢GC体外培养的标记方法, 本研究采用分离和培养原代小鼠卵巢腔前颗粒细胞 (preantral granulosa cells, Pre GC) , 应用CCK-8分析和Brd U体外标记检测细胞增殖, 以探讨NGF是如何影响GC的增殖。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

NGF, RD systems公司;DMEM-F12培养液, Tryple, 胎牛血清, 双抗, GIBCO公司;BSA, Biotech BASIC INC公司;抗体, Promega公司;CCK-8, Dojindo laboratories公司;Brd U, Brd U in situ defection kitⅡ, BD Biosciences公司。

1.2 实验动物

10 d龄的健康雌性ICR小白鼠, 中国科学技术大学生命科学学院实验动物中心[许可证号:SCXK (皖) 2005-0008]。

1.3 Pre GC的原代培养

小鼠断颈处死后无菌取出双侧卵巢, 去除周围脂肪组织及卵巢被膜, 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution, PBS) 洗净卵巢上血污, 体视显微镜下用尖头镊子分离腔前卵泡, 消化膜细胞5~10 min后吸取单个腔前卵泡, 2 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 加入胰酶消化15 min, 期间吹打数次, 终止消化后离心5 min, 1 500 r/min, 去上清, 加入完全培养基制成颗粒细胞悬液, 调整细胞密度为2×105个/ml, 预接种到培养板中。

1.4 CCK-8检测细胞的增殖

将细胞悬液接种到96孔培养板, 每孔100μl, 设定NGF分别作用时间为12、24、48、72和96 h的实验组, 每个时间段都设定各自的对照组, 对照组加入普通培养基, 每组设定6个复孔。5%二氧化碳CO2, 37℃孵箱培养24 h, 细胞贴壁率达到90%, 更换含0.1%BSA的DMEM/F12培养基饥饿24 h, 加入NGF使终浓度为50 ng/ml, 继续培养各个时间段后终止培养, PBS清洗后每孔再加入10μl CCK-8溶液孵育12 h, 酶标仪检测450 nm波长的吸光值, 计算平均值。

1.5 Brd U体外标记GC增殖

将盖玻片 (1.5 cm×1.5 cm) 在酒精灯上迅速过火后小心放入24孔培养板中, 然后将单细胞悬液滴到玻片上, 40μl/滴, 然后加培养基到500μl, 设定对照组和NGF组 (50 ng/ml) , 每组3个复孔。培养24 h, 饥饿后加入NGF使终浓度为50 ng/ml继续培养。

根据细胞生长状况, 培养36 h左右适时取出爬片, 按照Brd U免疫荧光技术的步骤操作, Hoechst染核, 封片后荧光显微镜拍照, 随即计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数, 计算标记指数 (labeling index, LI, 百分数表示) 。

1.6 统计方法

所有的检测数据以均数±标准差 (±s) 表示, 使用SPSS 16.0统计分析软件进行单因素方差分析后进行组间LSD分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGF对小鼠卵巢Pre GC促增殖作用

50 ng/ml的NGF作用Pre GC不同时间段后, 采用CCK-8法检测NGF对细胞增殖的作用。结果显示, 在波长450 nm时, OD值随作用时间的延长 (12~96 h) 而增加, 当NGF作用48 h时, 促增殖作用明显表现出来, 同对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 随着NGF作用时间进一步延长, 促增殖作用持续存在, 同对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图1。

2.2 Brd U的免疫荧光技术检测及LI (%)

Brd U免疫荧光技术检测显示, 经50 ng/ml NGF处理36 h后, NGF对小鼠卵巢Pre GC已经有促增殖作用, 见图2。随机计数10个高倍视野中细胞总数及Brd U阳性细胞数, 计算LI (%) , NGF组的Brd U的LI为45.03%, 明显高于对照组20.65% (P<0.01) , 见图3。

1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05

A:对照组, 只有少数细胞表达Brd U;B:NGF (50 ng/ml) 组, 表达Brd U的细胞数增多

覮与对照组比较, P<0.01;1:对照组;2:NGF 50 ng/ml组

3 讨论

颗粒细胞是卵巢的主要组成细胞, 为卵母细胞的发育提供其所需要的营养物质以及生存的微环境[4]。卵母细胞通过缝隙连接从周围的颗粒细胞中摄取各种营养因子, 使卵母细胞的代谢需要得以满足。因此, 颗粒细胞在卵母细胞生长中起着重要的营养作用[5]。而且, 颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接是卵母细胞生长、分裂和成熟能够正常进行的必需因素;同时, 卵母细胞对卵泡细胞功能起着中心调节作用[6]。卵母细胞分泌的生长因子对颗粒细胞和卵丘细胞的分化、增生、凋亡和泛素化起着广泛的调节作用, 说明颗粒细胞和卵母细胞之间的关系是相互依赖的[7]。颗粒细胞的增殖和分化在原始卵泡形成启动以及以后的卵泡正常发育起着至关重要的作用。因此, 颗粒细胞是否能够正常的增殖分化可作为卵泡发育成熟的标志[8]。

最开始的研究显示:NGF的生物学功能仅仅限于神经系统, 但越来越多的证据表明NGF也可以作用于其他非神经系统的组织细胞。研究表明, NGF及其受体Trk A和p75在动物的生殖系统中有表达[9]。在猪卵巢中, NGF及其受体在膜细胞和颗粒细胞中都有表达, 从而证明NGF及其受体在卵泡发育、排卵等方面都有重要的作用[10]。在金仓鼠的子宫组织中, NGF及其受体Trk A在子宫内膜上皮细胞、腺细胞及基质细胞中都有表达, 而p75只在子宫内膜上皮细胞、腺细胞中有表达[11]。对山羊的研究显示NGF及其受体Trk A与p75在输卵管壶腹部与峡部的上皮细胞与肌细胞中有表达[12]。对小鼠和人的卵巢研究也表明, NGF的过表达会导致卵巢中初级卵泡与次级卵泡数量的大幅增加, 而裸露的卵母细胞数量相对减少, 表明不正常的NGF及其受体水平的增加会造成卵巢囊状疾病[13]。

CCK-8试剂中含有WST-8, 它是一种类似于MTT的化合物, 在电子载体的作用下被细胞线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 (Formazan) 。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比, 细胞增殖越多越快, 则颜色越深;细胞毒性越大, 则颜色越浅。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值, 可间接反映活细胞数量。与传统的MTT检测法比较, CCK-8具有使用方便, 不需要放射性同位素和有机溶剂, 检测快速, 灵敏度高, 甚至可以测定较低的细胞密度, 重复性优于MTT, 对细胞毒性小等各种优点[14]。

本实验采用CCK-8试剂盒比较了不同作用时间的NGF对体外培养的小鼠Pre GC增殖的影响, 选取10 d龄的小鼠, 获取Pre GC, 避免分化的颗粒细胞自身因素对NGF促增殖作用的影响, 并且在加入NGF前用无血清培养基饥饿培养, 减少其他因素干扰细胞增殖。实验结果证实50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞48 h的时候, 促增殖作用非常明显地表现出来, 随着作用时间延长, 呈现一定的时效关系。虽然NGF对细胞的促增殖作用持续存在, 但过长的作用时间可能会使细胞的密度太大。因此, 判定50 ng/ml的NGF对颗粒细胞的促增殖作用最理想反应时间不能超过48 h。

Brd U作为胸腺嘧啶的类似物, 能取代胸腺嘧啶被增殖细胞利用。当细胞处于DNA合成期, 即细胞处于增殖期, Brd U被细胞特异性地摄入细胞核掺入到细胞新合成的DNA中, 只要细胞存活, 这种存留是永久的, 用抗Brd U单克隆抗体经免疫荧光技术染色后, 可特异性显示Brd U阳性标记细胞, 即可直接观察其在细胞内的掺入情况[15]。

本研究采用Brd U体外标记方法, 50 ng/ml的NGF作用颗粒细胞36 h后, 进行免疫荧光技术检测, 结果显示荧光显微镜下可见Brd U阳性标记的颗粒细胞, NGF组的阳性细胞数量明显多于对照组, 提示细胞处于增殖期。同时计算Brd U阳性标记指数LI (%) , 数据显示NGF组的Brd U标记指数明显高于对照组, 差异具有统计学意义, 这更加直观的表明NGF能够促进颗粒细胞的增殖。

可见, 在研究NGF促颗粒细胞增殖及影响因素实验中, 采用CCK-8检测和Brd U体外标记的方法是可取的, 它们是高效、便捷地标记Pre GC增殖的方法, 而且本实验结果也证实了NGF促进颗粒细胞增殖是与时间呈时效关系的。

摘要：目的 为了解神经生长因子 (NGF) 对小鼠卵巢腔前颗粒细胞促增殖情况并探索其机制, 同时建立方便灵敏、无污染和毒性小的细胞增殖检测方法。方法 用NGF刺激培养的小鼠卵巢腔前颗粒细胞, 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 实验分析, 溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brd U) 掺入标记, 免疫荧光技术检测颗粒细胞在体外培养中的增殖情况和Brd U标记指数。结果 NGF明显促进颗粒细胞增殖, 并且具有一定的时效关系。荧光显微镜下可见Brd U阳性标记的颗粒细胞, 提示细胞处于增殖期。NGF组的Brd U标记指数为45.03%, 明显高于对照组20.65% (P<0.01) 。NGF使增殖期的细胞显著增多及增殖指数明显升高。结论 该研究证实NGF能够促进颗粒细胞增殖, CCK-8分析和Brd U标记是高效、灵敏的标记腔前颗粒细胞增殖的方法, NGF促进颗粒细胞增殖与促进颗粒细胞DNA的合成有关系。

篇4：MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 溶液配制

(1)培养基:水解酪蛋白培养基即MH(Mueller-Hinton,MH)肉汤(购自杭州天和生物制品有限公司),用去离子水稀释,高压灭菌备用。(2)抗生素:丁胺卡拉霉素(0.2 g/2 ml)、头孢他啶(0.5 g/瓶)。均用生理盐水稀释为0.1 g/ml备用。(3) MTT(sigma):用PBS(磷酸盐缓冲液,0.01 mol/L,pH值7.2)配制为5 mg/ml,0.22μm滤膜过滤除菌,-20℃避光保存备用。(4)DMSO(二甲基亚砜):分析纯,购自天津市福晨化学试剂厂。

1.1.2 仪器

美国恒温空气浴摇床和恒温振荡水浴培养箱、美国BIO-RAD680型酶标仪。

1.1.3 菌株

随机选取本院微生物室临床分离的鲍曼不动杆菌(采用美国德灵公司生产的NC21鉴定药敏板及配套试剂和Vitek-32进行菌株鉴定和药敏测定,临床药敏结果显示均对丁胺卡拉霉素敏感,将对头孢他啶耐药的菌株定义为1号菌株,对头孢他啶敏感的菌株定义为2号菌株)。

1.2 方法

1.2.1 细菌活性检测

(1)菌液制备:挑取平板上的菌落用MH肉汤于35℃恒温摇床上200 r/min过夜培养,约12 h后收集细菌,用生理盐水调整细菌浓度为2.0麦氏单位(约4×108 cfu/ml),取4 ml至无菌离心管内,于100℃煮沸5 min以制备死菌菌悬液,余约4 ml未煮的细菌悬液作为活菌菌悬液,用MH肉汤倍比稀释死菌和活菌菌悬液至1.00麦氏单位(约2×108 cfu/ml)、0.50麦氏单位(约1×10s cfu/ml)、0.25麦氏单位(约0.5×108 cfu/ml)和0.125麦氏单位(约0.25×108 cfu/ml)备用。(2)微量肉汤稀释法:将以上制备的各菌悬液依次加入96孔微量反应板中,每孔加200μL,各做8个复孔,另加8孔生理盐水作为空白对照。于450 nm处测定吸光度值。(3)MTT法:将MTT(5 mg/ml)加至已接种死菌和活菌的96孔微量反应板中,每孔加20μL,于35℃继续培养20 min,然后每孔加入DMSO(二甲基亚砜)100μL,振荡10min使甲瓒充分溶解,然后将96孔微量反应板于平板离心机中2000 r/min离心5 min,取上清200μL移至另一96孔微量反应板,再检测570 nm处的吸光度值。

1.2.2 药敏实验

(1)菌液制备:同上将过夜培养的2株细菌调整浓度为0.5麦氏单位,各取10μL用生理盐水稀释100倍备用。(2)药物稀释:根据临床药敏报告调整丁胺卡拉霉素和头孢他啶的终浓度(见表1),将0.1 g/ml的高浓度药物依次稀释为终浓度的两倍,各取100μL依次加至96孔微量板中备用。(3)细菌培养:各取10μL已稀释好的菌悬液接种到96孔微量板的相应孔中,每一个药物浓度每一菌株每个药物浓度组均做3个重复孔,同时设定不加药物和不加细菌的空白孔、不加药物的阳性细菌对照孔和不加细菌的药物对照孔,均做3个重复孔,结果取均值进行相关分析。加样完毕后,将96孔板置恒温水浴振荡培养箱中于(35℃)低速振荡(50 r/min)培养。(4)结果检测:培养13 h后(细菌处于对数生长期的一个时间点)于450 nm(微量肉汤稀释法)测定吸光度值(OD值),再按MTT法检测步骤于570 nm处测定各加样孔的吸光度值,参照向丽等[3]的方法根据吸光度值计算各药物组细菌存活率:细菌存活率=(实验组OD值—不加细菌的药物组OD值)/(不加药物的阳性细菌组OD值-空白孔OD值)×100%。结果判定:细菌存活率<30%则对该药为高度敏感(S),细菌存活率30%～50%则对该药为中度敏感(MS),细菌存活率>50%则对该药为不敏感(R)。

1.3 统计学方法

运用统计软件SPSS 16.0中的t检验对微量肉汤稀释法或MTT法检测的同一浓度的死菌或活菌吸光度值进行比较,用Χ2检验对药敏实验所得两种方法的细菌存活率进行比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1

以细菌浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制微量肉汤稀释法和MTT法检测的不同浓度的死菌和活菌吸光度值检测结果图,并对结果进行统计分析。可见随着细菌浓度增加,微量肉汤稀释法和MTT法检测的活菌或死菌的吸光度值均增加(见图1),但用微量肉汤稀释法检测的同一浓度的活菌和死菌的吸光度值之间差别不大,t检验结果显示无统计学意义(P>0.05);而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比,MTT法检测的活菌吸光度值明显增加,t检验结果显示差异均有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

注:*P<0.05

2.2 药敏结果

根据微量肉汤稀释法和MTT法测定的吸光度值计算细菌存活率和药敏结果判定,两种方法的检测结果与临床药敏结果一致(即两株鲍曼不动杆菌对4μg/ml的丁胺卡拉霉素均敏感,1号菌株对512μg/ml的头孢他啶耐药,2号菌株对32μg/ml的头孢他啶敏感)。用Χ2检验对微量肉汤稀释法和MTT法检测的细菌存活率进行比较,两种方法的检测结果具有显著性差异(P<0.05)(见表3)。

注:R为耐药,S为敏感

3讨论

随着抗菌药物的广泛使用,细菌耐药问题日益突出[4,5,6],严重影响临床疗效和患者安全。细菌感染尤其是耐药菌株感染已成为患者高病死率的重要原因。虽然体外细菌鉴定和药敏实验的开展为临床医生给感染性疾病患者给予个体化的治疗提供了参考依据[7,8],在一定程度上可减少病程、降低患者的医疗费用、降低死亡率,但是由于送检到获取药敏报告的时间较长(一般要48 h以上)和药敏报告的不准确性,可能会造成治疗延误乃至引起不良后果。故为了得到一份快速、准确的药敏报告,除了严格收集标本、规范化细菌鉴定和药敏试验外[9],寻求一种便捷、准确的药敏鉴定方法也非常必要。

虽然早在2002年高伟等[10]就提出MTT法是一种快速检测细菌生长繁殖的好方法,王栩及向丽等[2,3]也通过实验进一步阐述了MTT法在细菌活性检测和药敏试验中应用的可行性,但目前国内外主要在科学研究中用MTT法对细菌活性进行检测(如唐静及Nuryastrti等[11,12]),将MTT法用于临床尤其是能否替代经典的微量肉汤稀释法,仍有必要进行探讨。

本实验结果显示:(1)当用微量肉汤稀释法检测活菌和死菌时,同一浓度的吸光度值差别不大(P>0.05),充分显示该方法的局限性:不能区别死菌和活菌,而死菌极有可能干扰微量肉汤稀释法的检测结果,影响结果的准确性;而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比,MTT法检测的活菌吸光度值明显增加,t检验结果显示差异均有统计学意义(P<0.05),说明MTT法可用于检测细菌活性,经离心后测定可排除死菌对吸光度值的干扰,其结果比微量肉汤稀释法更准确、特异性更高。(2)药敏结果显示当某株细菌对一种药物敏感时,MTT法测得的细菌存活率比用微量肉汤稀释法检测的细菌存活率更低;而当某株细菌对一种药物耐药时,MTT法测得的细菌存活率比用微量肉汤稀释法检测的细菌存活率更高,经统计学分析,皆有显著性差异(P<0.05),说明MTT法不仅可用于细菌药敏检测,而且其敏感性和准确性明显优于微量肉汤稀释法。(3)另外本次MTT的检测时间点为加药培养后13 h,此时细菌增殖正处在对数生长期,更能准确的反应细菌的生长状态,从而间接反应药物对细菌生长的影响,传统的微量肉汤稀释法检测的时间点是加药培养16～24 h,此时细菌生长可能已达平台期,即使药物对细菌的生长有一定的影响,但是因为培养的时间太长,而细菌的分裂周期很短,即少量的细菌也可能在培养16 h后达平台期,此时与未加药组相比几乎没有差别,从而使结论可能不太准确。从这点而言,与微量肉汤稀释法相比,MTT法明显缩短了药敏试验的时间,结果也更准确。

总之,虽然与微量肉汤稀释法相比,MTT法的操作步骤略多,但MTT法的灵敏性、特异性更高,检测周期短,结果更准确,完全可用于临床细菌药敏检测,以便更快速和准确的为临床感染性疾病的诊治提供实验依据。

摘要：目的 探讨四甲基偶氮唑盐(MTT)法在细菌活性检测和药敏试验中的应用价值。方法 分别采用MTT法和微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌活性以及鲍曼不动杆菌对丁胺卡拉霉素和头孢他啶的敏感性,对两种方法的操作过程和结果进行比较。用统计软件SPSS 16.0对检测结果进行分析。结果 随着细菌浓度增加,微量肉汤稀释法和MTT法检测的活菌或死菌的吸光度值均增加,但用微量肉汤稀释法检测的同一浓度的活菌和死菌的吸光度值之间差别不大,t检验结果显示差异无统计学意义(P>0.05);而与用MTT法检测的同一浓度死菌吸光度值相比,MTT法检测的活菌吸光度值明显增加,t检验结果显示差异均有统计学意义(P<0.05);用微量肉汤稀释法和MTT法检测的鲍曼不动杆菌对丁胺卡拉霉素和头孢他啶的敏感性均与临床药敏结果一致。结论 同微量肉汤稀释法一样,MTT法可以用于检测细菌活性和药敏试验。

篇5：MTT法在检测细胞增殖方面的探讨

1 材料和方法

1.1 材料

细胞株:小鼠破骨前体细胞RAW264.7(ATCC TIB-71),DMEM培养基(美国Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青公司),Forma 3131型CO2培养箱(美国),倒置相差显微镜CK41(Olympus公司),超净工作台(上海博讯实业有限公司),超纯水仪(Elix3+Mill-GB,法国Milipo二公司),坐式自动电热压力蒸汽灭菌器(ZDXX-35BI型,上海),电子分析天平(BP221S,美国),低温高速离心机(HC-3018R,中国),MTT(Amresco分装)溶解于PBS中,5mg/m L,抽滤除菌备用,二甲基亚砜(DMSO)(国产分析纯),Bio Tek ELx800全自动酶标仪(美国Bio Tek公司)

1.2 方法

取对数生长期的RAW264.7细胞,分别以5×104和2×105种植于96孔板,分别在不同时间,加MTT,一般每孔200μL培养基加入20μL MTT(5mg/m L),37℃培养箱内继续孵育4 h,血清浓度尽量不高于10%,最好在加MTT(5 mg/m L)前换成无血清的培养基,呈色,比色。RAW264.7细胞是贴壁细胞,小心吸出培养上清液,每孔加入100μL DMSO,使结晶物充分溶解,选择490 nm波长测定,在酶标仪上测定各孔数值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件行方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

处于生长期的RAW264.7细胞在倒置显微镜下照片见图1。取对数生长期的RAW264.7细胞,以2×105种植于96孔板,脱离血清进行培养观察48 h内细胞生长情况,生长曲线如图2所示;另取对数生长期的RAW264.7细胞,以5×104种植于96孔板,10%的血清正常培养8 d,每2天换液1次,记录OD值,描绘生长曲线,见图3。

DMSO溶解后放置不同时间,OD值的变化以及孔板盖子对OD值的影响。将对数生长期RAW264.7细胞,以2×105种植于96孔板,DMSO溶解后,将细胞移入另一96孔板,分别在不同时间进行比色,并将96孔板盖子盖上和去掉,所得结果显示,DMSO溶解后0~48 h内,OD值结果差异没有统计学意义(P>0.05);3~30 d,OD值结果与0 h组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。加盖前后OD值比较,差异没有统计学意义(P>0.05),但是加盖后OD值相对值要增大0.06~0.07,对最终结果有一定的影响。见附表。

注:覮与0 h组相比,P<0.05

3 讨论

众所周知,MTT是一种显色剂,可以检测细胞存活和生长[4,5,6]。它的作用原理都已经很清楚,活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原MTT形成蓝色的结晶物,与细胞数成正比,采用Biotek Elx800酶标仪在490nm处测其吸光度,可间接反应活细胞的数量。但是,当反应体系中存在影响细胞生长的因素时,常会影响实验结果造成实验数据的偏差[7,8,9]。在MTT比色法实验操作结尾时,要进行OD值测量时,也可能会存在误差,或因时间选择等问题造成数据偏差或错误。在实验中,操作者处理完孔板内的细胞后,通过2种方式将细胞移出放入酶标仪进行测量,通常用DM-SO完全溶解后,全部移入相同孔数的板子,直接进行测量;另一种,有一次性酶标仪转移板,也可直接移入进行测量。如果能够实时测量且工作量较少,则可以进行,不会影响测量结果。考虑到药物剂量的筛选、细胞毒性试验的测定等批量工作,设想能将不同作用时间的细胞和不同作用的细胞数量在某个剂量下,既能同时检测,又能反映出细胞的活力,而且不影响实验结果。

笔者认为,当受试细胞在进行MTT实验时,首先需要对种植细胞的浓度进行计数,最好选择在1×104~2×105的细胞数比较合适,对实验中检测和绘制细胞生长曲线以及细胞活力等试验指标影响较小。另外,即将检测的细胞应当用锡箔纸包裹,室温下避光保存。在进行MTT检测时,如果疏忽没有将盖子取下来,所测得的OD值,要比正常测量的值要高很多,这可能与盖子影响到了透光度有关。

总之,MTT比色法操作虽然简单,但是影响其测定结果的因素却较多,在细胞的准备、种植、培养等初期都非常重要,MTT液体的配置,加入后孵育,DMSO的剂量,直至最后放入酶标仪后的比色,放置时间的长短,波长的选定,等等,同样对实验者的操作要求更加严格。

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