树莓离体培养无性系的建立

树莓离体培养无性系的建立（精选5篇）

篇1：树莓离体培养无性系的建立

树莓离体培养无性系的建立

以树莓带芽茎段或顶芽为外植体,探讨不同激素种类与水平对其不定芽分化、增殖与不定根形成的`影响,并筛选了树莓试管苗移栽的适宜基质.结果表明:不定芽启动培养以MS+BA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L为宜;继代增殖以MS+BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1～0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L+干酪素30～50 mg/L为宜;不定根分化以1/2 MS+IBA 0.2～0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L或1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L为宜,生根率高于96%;在泥炭或泥炭∶蛭石=1∶1的基质中移栽,成活率高于93.8%.

作 者：何家涛 董珍文 王会 赵劲松 作者单位：襄樊职业技术学院,湖北襄樊,441021刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：34(13)分类号：Q943.1关键词：树莓 离体培养 无性系

篇2：树莓离体培养无性系的建立

小根蒜组织培养及无性系建立的研究

想基质.

作 者：云宝仪 崔晓琳 陈晓宁 徐娜 姜长阳 YUN Bao-yi CUI Xiao-lin CHEN Xiao-ning XU Na JIANG Chang-yang 作者单位：辽宁师范大学生命科学学院,辽宁,大连,116029刊 名：山东科学英文刊名：SHANDONG SCIENCE年，卷(期)：22(4)分类号：Q943.1关键词：小根蒜 无性系 快速繁殖

篇3：树莓离体培养无性系的建立

组织培养过程本身是一个变异系统, 细胞经历了组织分离后的创伤, 再生过程中因环境因素不同于自然条件, 发生了控制程序的重排或重建, 再生植物中会产生广泛的变异 (Jain, S.M., 2000) 。这些变异可应用于培育植物新品种, 离体培养产生有利的突变可改善植物的农艺性状, 缩短育种周期 (S.Mohan.Jain, 2001) 。Skirvin & Janick (1976) 研究表明:用离器官分化、生长点越远的组织或器官作外植体, 培养时间越久, 体细胞无性系变异频率就越高, 并建议应用体细胞无性系变异改良园艺作物。基于此, 本研究选用唐菖蒲幼嫩的花瓣作外植体, 建立了花瓣再生体系, 并用化学方法诱导花瓣愈伤组织, 试图拓宽唐菖蒲的遗传资源, 对经诱变处理的花瓣愈伤组织长出的丛生芽生根驯化后获得了无性系群体, 结合分子标记技术对变异单株进行M1代的鉴定与选择, 并在M2、M3代验证了早代鉴定的结果。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验所用唐菖蒲品种超级玫瑰来源于东北农业大学园艺学院园林实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 唐菖蒲花瓣愈伤组织的诱导

2011年6月初取Rose Supreme4～6叶期幼嫩的花序, 从茎基部切下, 剥去外面苞叶, 取自下往上第1朵小花以上还未抽出花茎幼嫩的花瓣, 摘下花蕾, 放入加少量洗衣粉的水中浸泡10～15min, 再用流水冲洗20min后在超净工作台上用70%酒精消毒30s, 接着用浓度为1%的HgCl2消毒10～15min, 最后用无菌水冲洗3～4次, 取出花蕾, 用灭过菌的滤纸吸去多余水分后, 除去绿色萼片, 剪下花瓣, 将花瓣从基部切成3～5块1cm2大小的切块, 接入MS+2, 4-D4.0mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上培养 (郑洋, 2007) 。将接种好的材料置于23～25℃、日光灯16h/d、光强2000lx的条件下培养4周, 观察记录材料在培养基上愈伤组织诱导情况。

1.2.2 芽分化及增殖培养

将诱导出来的花瓣愈伤组织转到芽分化培养基上, 诱导愈伤组织分化形成丛生芽, 所用培养基配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L (郑洋, 2007) 。

1.2.3 化学诱变剂处理

在灭菌后的继代培养基没有凝固前, 无菌条件下加入一定量的秋水仙素及EMS母液, 然后分装在三角瓶中, 分别配成含秋水仙素浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00、2.00mg/L的培养基及含EMS浓度分别为1、3、5、7、9、11mg/L的培养基。取预培养的结构致密、颗粒较小的花瓣胚性愈伤组织接种于上述配制的含不同浓度秋水仙素及EMS培养基中, 每瓶接种6块, 每个处理接种4瓶, 重复5次, 总计处理1320块。以不加任何化学诱变剂的培养基为对照, 培养3w后统计愈伤组织的存活情况, 分别筛选得到秋水仙素及EMS的半致死剂量;然后选取在半致死剂量培养基中存活的愈伤组织用于继代培养。

1.2.4 花瓣试管苗的驯化与变异株的初步筛选

用MS+IBA1.0mg/L+PP3333.0mg/L+蔗糖60mg/L作为生根培养基 (马国华, 1994) 。待试管苗长出1～2片真叶时, 将其转入生根培养基上。当试管苗根长到1.5cm时, 放在驯化室自然光条件下, 开瓶盖适应2d, 清水洗去根部培养基, 分别将花瓣试管苗、秋水仙素及EMS诱变处理的试管苗分3组移栽到经高温灭菌的基质中, 每10d浇一次1/2MS营养液。待所有试管苗驯化成活后, 提取每个单株的叶片DNA, 用本实验室筛选好的引物对每个单株进行ISSR遗传分析, 并将分析后初步获得的变异单株编号种植。

1.2.5 M2、M3代性状观察

为验证M1代鉴定结果的准确性, 并因唐菖蒲试管苗需2～3年才能开花的特性, 本研究在M2、M3代观察M1代经ISSR标记筛选的花瓣试管苗、经秋水仙素及EMS处理的变异单株在形态、子球形成能力、花色及出苗期等性状上是否有变异。

2 试验结果与分析

2.1 花瓣愈伤组织诱导

花瓣接种4周后, 组织变褐色, 并在切口处陆续出现乳白色半透明的愈伤组织, 愈伤组织明显带有原外植体花瓣的颜色;随着时间延长, 愈伤组织可慢慢分化出不定芽。

2.2 花瓣愈伤组织分化

2.2.1 花瓣愈伤组织芽的诱导

将花瓣愈伤组织接种在芽分化培养基上2周后, 从愈伤组织上逐渐分化出不同形态的幼苗, 有些幼苗的组织如叶鞘、叶片上呈现出花瓣特有的颜色, 说明原花瓣细胞中的色素也随细胞分裂被遗传到新的组织器官中, 但随着新植株的进一步发育, 色素仅在茎上出现, 此后植株发育过程与其子球诱导出的小苗形态上趋于相似。这在一定程度上反映了控制花色的基因在植株发育过程中阶段性表达的情况;部分由花瓣愈伤组织形成的幼苗仅在叶鞘顶部出现花瓣特有的颜色, 但此类幼苗成活率只有10%左右。

2.2.2 唐菖蒲花瓣愈伤直接分化现象

在由幼嫩的花瓣诱导出愈伤组织后, 将愈伤组织转接到芽分化培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L上培养4周后, 发现除分化出卷曲、叶鞘带有花瓣原有颜色的小植株外, 花瓣愈伤组织还可在试管内直接再生出花瓣外植体特有颜色的花瓣, 但不能够形成幼苗。花瓣生长一段时间后逐渐像自然花瓣那样凋萎。出现这种现象的原因可能是花瓣愈伤组织在离体条件下受特定的调节因素影响, 控制花瓣发育的基因被激活表达, 个别细胞的生长、发育和分化方向仍延续了原来花瓣形成基因表达的时空顺序, 具体原因还有待于器官发生学及植物发育分子机理等方面的深入研究。

2.3 化学诱变剂对花瓣无性系的影响

2.3.1 秋水仙素对花瓣试管苗的影响

a.半致死剂量的筛选。不同秋水仙素诱变剂浓度对唐菖蒲花瓣愈伤组织存活率有很大的影响。愈伤组织在经秋水仙素诱导后, 一部分褐化死亡, 一部分可继续分化出愈伤组织。不同浓度秋水仙素处理存活率统计显示:秋水仙素浓度为0.05mg/L的培养基愈伤组织存活率最高, 为68%;秋水仙素浓度为2.0mg/L的培养基存活率最低, 为27.5%。由表1可看出秋水仙素对唐菖蒲愈伤组织半致死剂量为0.5mg/L。

b.秋水仙素对花瓣试管苗的诱导结果。将在含半致死剂量秋水仙素培养基中培养3周后的花瓣愈伤组织转接到芽分化培养基上6周发现, 有60%经秋水仙素处理的愈伤组织上长出的芽及植株与对照相比表现明显粗壮, 移栽前组培苗粗壮、叶片肥大, 移栽驯化后植株叶片增厚、增宽;在400倍光学显微镜下的气孔观察表明:秋水仙素处理后获得的变异株气孔明显大于对照株。秋水仙素诱导植株常用的方法有处理种子、胚根和生长点, 诱变率一般在10%～40% (张敩芳, 1990;马爱如, 1987) , 但已有的研究结果表明, 将一定的秋水仙素母液加到培养基中诱导愈伤组织获得的诱变率要远高于常规方法, 这是因为离体培养的单细胞或多细胞团 (如愈伤组织) 对诱变处理的敏感性高, 而且由单细胞或多细胞团发育而成的再生植株不易出现嵌合体, 突变性状表现早而比较稳定 (郑秀芳, 2000) 。王强等 (2002) 用0.1%的秋水仙素处理贝母的愈伤组织24h, 诱导率为47.0%;将其接种到含1000mg/L秋水仙素的培养基中处理5d, 诱导率高达70%, 且诱变效果优于浸泡处理。本研究用秋水仙素处理花瓣愈伤组织获得了60%的诱导率。可见用唐菖蒲花瓣愈伤组织进行离体诱变可明显提高诱变率。

2.3.2 EMS对花瓣试管苗的影响

a.半致死剂量的筛选。不同EMS诱变剂浓度对唐菖蒲愈伤组织存活率也有很大的影响。愈伤组织在经过EMS诱导后, 一部分褐化死亡, 一部分可以继续分化出愈伤组织。根据EMS的处理浓度不同, 统计处理后的存活率, EMS浓度为1mg/L的培养基存活率最高, 为83.3%;EMS浓度为11mg/L的培养基存活率最低, 为23%。由表2可以看出EMS对唐菖蒲愈伤组织半致死剂量为9mg/L。

b.EMS诱导花瓣愈伤组织试管苗形态上的变异。经EMS诱导的花瓣愈伤组织分化出的芽及幼苗形态上表现出明显的畸形, 如叶片卷曲、扭曲、皱缩、植株细弱及形成花瓣类似物等现象, 但随时间推移, 生根及驯化成活后形态开始趋于正常。

2.4 花瓣无性系变异单株M1代ISSR标记筛选

将由花瓣愈伤组织上长出的幼苗及在化学诱变剂半致死剂量下诱导的花瓣组培苗于温室内驯化成活后, 将所有单株编号, 分别提取单株叶片DNA, 用本实验室筛选出的20号引物 (引物序列分别为TGT、GTG、TGT、GTG、TGT、GA) 对其进行ISSR遗传分析。结果表明:第1组94株花瓣组培苗中有2株变异, 和对照相比, 变异株在750bp处明显缺少一条带;第2组151株秋水仙素处理后代中有87株变异, 其中有6株ISSR条带与CK相比明显不同;第3组136株EMS处理后代有7株变异, 这7株在250bp～1500bp间条带明显增多;这些充分说明长时间离体培养及诱变条件下基因组发生了改变, 但与表型变异相关的一些基因的分离还在进一步研究中。

2.5 变异单株M2、M3代性状观察

对所有经ISSR初步筛选出的变异单株编号种植, M2、M3代性状观察发现:第1组为94株未经任何处理的花瓣组培苗, M3代共有5株开花, 其中2株被ISSR标记出的植株花色与CK明显不同, 其花瓣和对照相比颜色变浅, 花瓣上有较规则、斑驳的色素带, 花药及花瓣基部 (花心) 呈明显的紫色;第2组为秋水仙素处理的花瓣无性系群体, 在87株被ISSR标记出的变异单株中, 有65株形态上表现明显粗壮, 有9株死亡。65株形态上表现粗壮的植株在子球形成能力上差异较大, 其中有6株无子球形成能力, 此组未获得开花植株;第3组由EMS处理的花瓣无性系群体中获得了7个出苗异常的单株, 这7个单株的子球在同期同条件播种情况下, 出苗时间差异很大, 最大差异长达3个月;这7株中仅获得了1株开花植株, 花色与CK一致。

3 讨论

目前, 唐菖蒲育种大多采用杂交、辐射、转基因及组织培养4种方式, 辐射和转基因育种存在一些安全性问题, 杂交育种虽操作简单, 但后代性状发生分离且唐菖蒲杂交苗需要2～3年才能开花的特性导致育种年限较长。正常情况下, 用子球作培养材料, 几乎不发生变异或变异率较低, 而通过花瓣诱导愈伤组织, 再诱导愈伤组织分化成芽苗, 其变异率较高且趋向于“优势”变异。目前为止利用唐菖蒲花瓣愈伤组织为诱变材料进行诱变的研究未见报道, 本研究结果可对其他园艺作物花瓣诱导变异植株及筛选优良品种有一定的参考意义。

采用离体培养产生体细胞无性系变异, 并结合化学诱变手段, 不仅能增加获得诱变的几率, 还能让诱变工作更方便、有效 (孙岩, 1999) 。在离体培养时进行诱变处理, 对花卉较其他植物更有应用价值。因为花卉育种一般只要求个别观赏性状发生变异, 不一定要像粮食作物那样追求综合性的产量因素 (郑秀芳, 2000) 。

近年来, 唐菖蒲的诱变育种取得了一定的进展, 但采用物理诱变较多, 且诱变材料大都以种球为主 (Bannerji, 1994;张立富, 2001;孙纪霞, 2001;P.Srivastava, 2002;任少雄, 2006;刘长命, 2009) , 仅Idrees Ahmad Nasir (2008) 报道过用唐菖蒲子球愈伤组织悬浮液作诱变材料来筛选抗根腐病新品系。因此, 试验选用唐菖蒲幼嫩的花瓣为外植体, 诱导形成花瓣愈伤组织, 建立了再生体系。本研究在没添加任何化学诱变剂的情况下, 由花瓣愈伤组织所获得的无性系群体中也发生了较高频率的变异。花瓣愈伤组织在经过8个月的继代培养后, 变异率为2%;在半致死剂量的秋水仙素及EMS诱导条件下诱变率分别为57.6%与4.4%。由此可见, 花瓣愈伤组织经过化学药剂诱变后变异率明显增大。

篇4：萝卜离体再生体系的建立

关键词：萝卜；愈伤组织；不定芽；不定根；激素

中图分类号：S631.104⁺.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0021-03

萝卜（Raphanus sativus L.）又名莱菔，是十字花科萝卜属的二年生草本植物。作为一种以肉质根为主要食用部位的蔬菜作物，萝卜深受广大群众喜爱，在我国南北各地普遍栽培。随着生活水平的提高，人们对萝卜品质的要求也日益增长，这就对尽快育成优质抗病的萝卜新品种提出了迫切要求。建立高效的离体再生体系是亲本无性快繁和基因工程育种的基础环节，然而萝卜一直以来被认为是一种再生顽拗型植物，再生难度大、广泛适应性不强。本试验选用不同基因型萝卜为材料，从培育无菌苗到诱导愈伤组织、不定芽、不定根，再到最后炼苗移栽，拟建立起完整的具有广泛适应性的萝卜离体再生体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

潍县青、青圆脆、满堂红、沙窝青、堤东、花叶红玉春、喜诺晓青和翠绿萝卜8个萝卜品种。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗培育 将萝卜种子于超净工作台上用75%酒精处理30s，再用4%次氯酸钠溶液灭菌3min，最后用蒸馏水冲洗3遍，接种于1/2MS培养基上，室温25℃、光照时间16h·d^-1条件下培养，得到无菌苗。

1.2.2 愈伤组织和不定芽的诱导 取生长3～5d的无菌苗，切取子叶，留叶柄并将生长点去除干净，接种于不同激素配比的MS培养基上，在室温25℃、光照时间16h·d^-1条件下培养15～20d，统计愈伤组织和不定芽的诱导率。通过记录每种培养基内萝卜带柄子叶的再生情况，确定适宜的愈伤组织和不定芽诱导激素配比和诱导天数。

1.2.3 不定根的诱导 取诱导出的不定芽，接种于不同激素配比的MS培养基上，在室温25℃、光照时间16h·d^-1条件下培养15～20d，统计不定根诱导率。通过记录每种培养基内不定芽的生根情况，确定适宜的不定根诱导激素配比和诱导天数。

1.2.4 炼苗移栽 将不定根诱导成功的再生植株培养瓶的盖子揭开，注意适当保湿，使再生苗的生长环境接近于田间，进行炼苗培养。2～3d后将再生苗移栽于营养钵中，于炼苗室内缓苗培养15d左右，再移栽到大田中。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导培养基的筛选

以MS培养基+30g·L^-1蔗糖+0.7%琼脂+不同配比激素，在pH5.7左右诱导萝卜带柄子叶再生愈伤组织效果明显，8个萝卜品种分别经由2，4-D、IBA和NAA配合6-BA均能诱导出愈伤，其中，2，4-D配合6-BA诱导愈伤组织的效果最佳（表1）。

虽然8个萝卜品种的带柄子叶均诱导形成了愈伤组织，但是愈伤进一步分化形成不定芽却极其困难。在各种激素的诱导下，愈伤组织极易先生根，却难以诱导出芽，仅喜诺晓青和翠绿萝卜在NAA配合6-BA诱导培养基中不仅再生出了愈伤组织，还再生出了不定芽，但诱导率却很低。

2.2 不定芽诱导培养基的进一步筛选

以喜诺晓青和翠绿萝卜为试材，进一步细化NAA和6-BA激素配比进行不定芽的诱导。发现随激素浓度的增加，萝卜不定芽诱导率有先增加后降低的趋势（表2）。6-BA和NAA浓度比值为100时，不定芽的诱导率较高，比值过高或过低会导致不定芽的诱导率下降。综合比较，5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA对于喜诺晓青和翠绿萝卜诱导不定芽较适宜。翠绿的不定芽诱导率明显高于喜诺晓青，说明翠绿的基因型易再生培养。

2.3 不定根诱导培养基的筛选

在诱导不定芽的基础上，进一步试验不同浓度6-BA与NAA配比对喜诺晓青和翠绿萝卜不定根再生的影响，发现不定根的诱导与NAA浓度密切相关，NAA浓度过低时无法生成不定根，而NAA浓度过高时，生根率也会降低。总体来看，以5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA对于喜诺晓青和翠绿萝卜诱导不定根比较适宜（表3）。翠绿比喜诺晓青更易于再生出不定根，说明易于诱导出不定芽的基因型也同样适宜进一步诱导不定根，萝卜的再生频率高低和其基因型密切相关。

3 结论与讨论

植物组织培养过程中，不定芽有通过外植体直接诱导出芽和经愈伤组织诱导出芽两种途径，2，4-D、IBA和NAA配合6-BA诱导愈伤组织、再经愈伤组织诱导出芽在番茄、黄瓜等蔬菜作物中均有报道。关于萝卜的离体培养，仅有诱导出愈伤组织和直接诱导出不定芽的报道，并没有从愈伤组织再诱导出芽的报道，所以，萝卜离体再生诱导的关键是直接诱导不定芽的分化和增殖。

本试验选用潍县青、青圆脆、满堂红、沙窝青、堤东、花叶红玉春、喜诺晓青和翠绿共8份试验材料，多数材料仅能再生出愈伤组织，难以进一步分化再生出不定芽，其中仅有喜诺晓青和翠绿萝卜诱导出了不定芽并进而形成不定根。说明萝卜的再生能力较弱，其再生能力在不同基因型间差异十分显著。

外植体的选择也是影响萝卜再生诱导效果的关键因素之一。本试验初期选用了下胚轴、子叶、子叶横切、子叶纵切和带柄子叶这几种外植体材料，其中再生效果最差的是下胚轴，效果最好的是带柄子叶，所以后期试验都采用带柄子叶作为外植体。本研究发现萝卜带柄子叶离体培养的再生方式相对特殊，在不定芽诱导过程中先是子叶叶柄基部膨大产生少量愈伤组织后再生成大量不定芽，若外植体接种后产生大量愈伤组织就不能有效产生不定芽，说明诱导愈伤组织的多少对不定芽再生有重要影响，这可能与其再生顽拗有所关联，关于产生愈伤组织的多少对于有效诱导不定芽的影响机制有待进一步深入研究。

篇5：树莓离体培养无性系的建立

关键词：山麦冬,愈伤组织,无性系,快速繁殖

山麦冬(Liriope spicata)又叫紫穗麦冬、土麦冬、大麦冬、鱼子兰、麦门冬等,属于百合科麦冬属多年生草本植物[1],生长于山坡、林下和草丛中[2];在我国除了黑龙江、吉林、内蒙古、青海和西藏等地外,其他各地均有分布[3]。山麦冬的块根含甾体皂甙、β谷甾醇、氨基酸和维生素等成分,可供药用,具有滋阴生津、润肺止咳、清心除烦等功效[3,4],能治热病伤津、心烦口渴、咽干肺热、咳嗽、肺结核等疾病;近年来在辽宁南部地区也将其进行观赏栽培,其观赏、绿化效果受到了人们的普遍欢迎。但是,由于不论是野生的山麦冬,还是栽培的山麦冬都只能形成很少的种子,并且种子的发芽率低;因此,人工栽培难以通过种子繁殖的方法对其进行人工繁殖。于是,有人试图挖取野生植株进行栽培。然而,由于野生的山麦冬分布量很少(比如在大连地区只有长海县和凌水镇有少量分布),采用挖取野生植株的方法不仅不能满足人们的需要,而且使分布本来就很少的野生资源又遭到了破坏。为了满足人工栽培对种苗的需要,我们对山麦冬进行了组织培养及无性系建立的研究。虽然现在已有百合科麦冬属植物组织培养研究的报道[5,6,7,8,9,10,11],但迄今未见山麦冬嫩叶组织培养及无性系建立研究的报道。本研究以山麦冬的嫩叶为材料,通过愈伤组织诱导的途径,成功地建立起山麦冬的无性系。

1 材料与方法

1.1 材料及灭菌

于5~6月份将在林下生长非常旺盛的山麦冬嫩叶采回来,用自来水洗涤冲净后,置于0.001%的HgCl2溶液中杀菌24 h,然后放到250 mL的磨口广口瓶中,用自来水冲洗30 min左右,接着用0.05%安利洗涤液振荡洗涤20 min左右移至超净工作台上进行操作。将经上述处理的嫩叶用无菌水洗涤至无泡沫后加入70%~75%乙醇灭菌10 s左右,迅速用无菌水洗涤2次,再用0.05% HgCl2溶液振荡灭菌10 min,最后用无菌水洗涤6次,即获得无菌材料。

1.2 培养条件

以MS、1/2MS、B5、N6、White为基本培养基,附加不同浓度的细胞分裂素和生长素。以MS为基本培养基时,加蔗糖30 g·L-1;以其他培养基为基本培养基时,加蔗糖15 g·L-1。培养基胨力强度为180 g·cm-2[12],pH为5.8~6.0,培养温度为20~28℃,光照12 h· d-1,光照度3 000 lx左右。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对愈伤组织诱导的影响

用解剖刀将无菌材料切成边长0.2~0.4 cm的嫩叶块,接种到以MS、1/2MS、B5、N6、White 5种培养基为基本培养基,附加6-BA0.4 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 1.5 mg·L-1的培养基上,进行光照培养和暗培养。愈伤组织诱导试验进行了3次重复,每次重复试验接种200个无菌嫩叶块。

观察表明,接种后10 d左右,在有的培养基上接种培养的休眠芽开始萌动生长。接种50 d时观察统计证明:在光照培养的条件下,培养材料难以生长形成愈伤组织;在暗培养的条件下,各种培养基都能不同程度地形成愈伤组织,其中以MS为基本培养基的培养材料不仅愈伤组织的诱导率最高(达到了100%),而且诱导的愈伤组织长势好。观察表明,在这一培养基上最早形成的愈伤组织是从材料的切口开始生长的,此时的愈伤组织为表面光滑无色半透明状,随着培养时间的延长和愈伤组织的不断生长,所培养的愈伤组织逐渐生长成为黄色的颗粒状。3次重复试验的结果基本一致。上述试验说明,MS+6-BA0.4 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 1.5 mg·L-1这一培养基是山麦冬嫩叶愈伤组织诱导的理想培养基。

2.2 不同浓度激素对愈伤组织分化培养的影响

将上述继代培养的愈伤组织用镊子分散成颗粒状后,接种到附加不同浓度的BA(0、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.1和0.4 mg·L-1)、IBA(0、0.1和0.4 mg·L-1)和2,4-D(0、0.1和0.4 mg·L-1)的1/2MS+AgNO31.2 mg·L-1培养基上。每个处理接种100个愈伤组织颗粒。在光照条件下进行分化培养。60 d时观察统计颗粒状愈伤组织的分化情况,统计分化不定芽数量,计算分化率。试验重复了5次。

由表1可见,在不同浓度BA、NAA、IBA和2,4-D单独使用、不同浓度的BA与不同浓度的IBA和2,4-D配合使用的培养基上,愈伤组织不能分化;在不同浓度BA与不同浓度NAA配合使用的培养基上愈伤组织可以分化。从愈伤组织的分化率及分化不定芽的长势看,在BA浓度为0.5 mg·L-1、NAA浓度为0.1 mg·L-1的培养基上,不仅培养的愈伤组织颗粒分化率达到了96%,平均每个愈伤组织颗粒的分化芽数达到5.8个,并且分化不定芽长势好。观察表明,在这一培养基上培养10 d左右,愈伤组织颗粒开始分化,随后,伴随着分化不定芽数量的增加和已经分化不定芽的生长,在不定芽基部又会分化出数量不等的不定芽。分化培养到60 d时,分化的不定芽就会生长分化为绿色丛生状,大部分不定芽的高在0.5 cm以上。把高0.5 cm以上的不定芽从基部剪下,接种到相同的培养基上进行不定芽分化继代培养。每次重复试验分化继代培养4代。分化继代培养除了培养时间缩短为50 d、每个不定芽一个培养周期平均可分化生长出6.1个不定芽外,其继代培养分化生长不定芽的长势与愈伤组织颗粒诱导分化生长的不定芽基本一致。这说明1/2MS+AgNO31.2 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1这一培养基是诱导山麦冬颗粒状愈伤组织和不定芽分化的理想培养基。

注:-为不生长;+长势一般;++长势好。

2.3 不同生长素对不定芽生根和生根继代培养的影响

将在1/2MS+AgNO31.2 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1培养基上继代分化培养的不定芽从基部剪下,接种到以1/2MS+IAA0.2 mg·L-1和1/3MS +IAA0.2 mg·L-1为基本培养基附加不同浓度NAA的生根培养基上进行生根培养,生根培养进行了4次重复试验,每种处理接种100个材料。

观察表明,在有的生根培养基上,接种后10 d左右能形成可见根原基。接种后30 d观察统计。由表2可见,以1/3MS+IAA0.2 mg·L-1为基本培养基基本不能诱导不定芽生根,以1/2MS+IAA0.2 mg·L-1为基本培养基可诱导不定芽生根,并且在基本培养基中添加不同浓度NAA的生根效果好;尤其是在添加浓度为0.1 mg·L-1的NAA培养基上,不仅生根率为97%、每株生根苗的平均生根数为6.6条,而且试管苗长势好。观察表明,在添加浓度为0.1 mg·L-1的NAA培养基上,接种后10 d大多数培养不定芽能形成可见根原基,随后,伴随着根系的不断生长,逐渐生长成为旺盛的试管苗。培养到30 d时,就会培养成为高4~5 cm、具有5~8个叶片的旺盛试管苗。4次重复生根重复试验结果基本一致。这说明1/2MS+IAA0.2 mg·L-1 +NAA0.1 mg·L-1这一培养基是山麦冬不定芽生根培养理想培养基。

注:++为长势好;+为长势一般;-为不生长。

2.4 试管苗的移栽和移植

把培养着生根试管苗的培养瓶瓶塞打开,放到5 000~6 000 lx的温室光照下炼苗4 d后,用镊子将试管苗取出,在清水中将根部的培养基洗去,移栽到上面铺着一层6~8 cm厚颗粒炉灰渣的温室苗床上。移栽后的前14 d要保持没有直射光、温度20℃以上、湿度95%左右的环境条件;从第15天开始,按照温室内的正常环境进行管理。移栽试验进行了4次,移栽的株数分别为:300、300、400和600株。移栽后30 d观察统计证明:移栽成活率为95%,成活的试管苗生长旺盛。

把在温室中移栽成活的试管苗,于5月中上旬分3次移植到山坡林缘。观察统计证明:移植成活率近100%;移植的试管苗翌年7月中旬开花,9月中旬果实成熟;与野生植株相比,试管苗具有生长旺盛、整齐、根系发达的特点,其他生物学性状保持不变。

3 讨论

在过去的研究中以单子叶植物叶片为材料进行分化培养的报道很少,本研究以山麦冬的嫩叶为材料,通过诱导愈伤组织诱导建立起山麦冬的无性系。这个结果与杨乃博[13]对沿阶草叶片愈伤组织的诱导和莫肖蓉等[14]对金边麦冬叶片愈伤组织诱导的观察是一致的。这个结果还说明山麦冬嫩叶非分生组织细胞也具有全能性。

在不定芽分化继代中,一个继代培养周期(50 d)平均能分化生长出6.1个不定芽。按照这个速度,一年能繁殖出6.17.3个不定芽,可培养出30多万株试管苗。这个繁殖速度不仅完全可满足观赏、药用生产对大量种苗的需要,而且也为保护这种野生植物的种质提供了可能。